Summary
B7-H1 (PD-L1) e il suo legame al PD-1 forniscono una maggiore tumore segnale indotto immunosoppressiva nel microambiente del tumore. Una tecnica di colorazione immunoistochimica per caratterizzare l'espressione e la localizzazione di B7-H1 in adenocarcinoma pancreatico è descritto qui.
Abstract
B7-H1/PD-L1, un membro della famiglia B7-immune di regolamentazione proteine di superficie cellulare, svolge un ruolo importante nella regolazione negativa di risposte immunitarie mediate da cellule attraverso la sua interazione con il suo recettore, morte programmata-1 (PD -1) 1,2. Sovraespressione di B7-H1 da cellule tumorali è stato osservato in un certo numero di tumori umani, compreso il melanoma, glioblastoma, e carcinomi del polmone, seno, colon, ovaio, e cellule renali, e ha dimostrato di alterare anti-tumorali T- cella immunità 3-8.
Recentemente, B7-H1 espressione tessuti adenocarcinoma pancreatico è stato identificato come un potenziale marcatore prognostico 9,10. Inoltre, il blocco di B7-H1 in un modello murino di cancro pancreatico ha dimostrato di produrre una risposta antitumorale 11. Questi dati suggeriscono l'importanza di B7-H1 come un potenziale bersaglio terapeutico. Anti-B7-H1 anticorpi bloccanti sono quindi in fase di sperimentazione in studi clinici per il mulgestire più tumori umani solidi tra cui il melanoma e tumori del polmone, del colon, rene, stomaco e pancreas 12.
Per essere successivamente in grado di identificare i pazienti che beneficeranno B7-H1 di targeting terapie, è fondamentale per indagare la correlazione tra espressione e la localizzazione delle B7-H1 e la risposta del paziente al trattamento con anticorpi B7-H1 blocco. Esaminando l'espressione di B7-H1 in tessuti umani adenocarcinoma pancreatico attraverso immunoistochimica darà una migliore comprensione di come questa co-inibitrice molecola di segnalazione contribuisce alla soppressione dell'immunità antitumorale in microambiente del tumore. L'anticorpo anti-B7-H1 monoclonale (clone 5H1) sviluppato da Chen e colleghi ha dimostrato di produrre risultati affidabili in colorazione criosezioni di più tipi di tessuti neoplastici umani 4,8, ma macchie nei paraffinati diapositive era stata una sfida fino recentemente 13-18. Abbiamo devfuggita la B7-H1 protocollo di colorazione per le diapositive incluse in paraffina di tessuti adenocarcinoma pancreatico. La B7-H1 protocollo di colorazione qui descritto produce coerente colorazione membranosa e citoplasmatica di B7-H1 con po 'di storia.
Protocol
B7-H1/PD-L1, un membro della famiglia B7-immune di regolamentazione proteine di superficie cellulare, svolge un ruolo importante nella regolazione negativa di risposte immunitarie mediate da cellule attraverso la sua interazione con il suo recettore, morte programmata-1 (PD -1) 1,2. Sovraespressione di B7-H1 da cellule tumorali è stato osservato in un certo numero di tumori umani, compreso il melanoma, glioblastoma, e carcinomi del polmone, seno, colon, ovaio, e cellule renali, e ha dimostrato di alterare anti-tumorali T- cella immunità 3-8.
Recentemente, B7-H1 espressione tessuti adenocarcinoma pancreatico è stato identificato come un potenziale marcatore prognostico 9,10. Inoltre, il blocco di B7-H1 in un modello murino di cancro pancreatico ha dimostrato di produrre una risposta antitumorale 11. Questi dati suggeriscono l'importanza di B7-H1 come un potenziale bersaglio terapeutico. Anti-B7-H1 anticorpi bloccanti sono quindi in fase di sperimentazione in studi clinici per l'uomo piùtumori solidi tra cui il melanoma e tumori del polmone, del colon, rene, stomaco e pancreas 12.
Per essere successivamente in grado di identificare i pazienti che beneficeranno B7-H1 di targeting terapie, è fondamentale per indagare la correlazione tra espressione e la localizzazione delle B7-H1 e la risposta del paziente al trattamento con anticorpi B7-H1 blocco. Esaminando l'espressione di B7-H1 in tessuti umani adenocarcinoma pancreatico attraverso immunoistochimica darà una migliore comprensione di come questa co-inibitrice molecola di segnalazione contribuisce alla soppressione dell'immunità antitumorale in microambiente del tumore. L'anticorpo anti-B7-H1 monoclonale (clone 5H1) sviluppato da Chen e colleghi ha dimostrato di produrre risultati affidabili in colorazione criosezioni di più tipi di tessuti neoplastici umani 4,8, ma macchie nei paraffinati diapositive era stata una sfida fino recentemente 13-18. Abbiamo sviluppato la B7-H1 stainiprotocollo ng per le diapositive incluse in paraffina di tessuti adenocarcinoma pancreatico. La B7-H1 protocollo di colorazione qui descritto produce coerente colorazione membranosa e citoplasmatica di B7-H1 con po 'di storia.
1. De-parafinization
- Bake scorre a 55 ° C per 20 min.
- In una cappa chimica, immergere i vetrini in xilolo per 10 min.
- Immergere i vetrini in xilene fresco per 10 minuti.
- Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al fresco 100% per 5 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 5 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 80% per 5 min.
- Immergere i vetrini in acqua deionizzata per 5 min.
2. Antigen Retrieval
- Immergere i vetrini in tampone Tris-EDTA (pH 9,0) e riscaldare in una pentola a pressione a 125 ° C per 30 sec, quindi 90 ° C per 10 sec.
- Lasciare raffreddare i vetrini per 60 min.
- Immergere i vetrini in TBST per 5 min; rEPEal doppio.
3. Colorazione
- Pulire soluzioni in tutto il tessuto nelle diapositive. Segnare un cerchio intorno al tessuto con una penna idrofobo.
- Porre i vetrini in una camera umida ed evitare l'essiccamento del tessuto sul vetrino durante tutto il processo di colorazione intero. Porre una goccia (circa 200 pl o più per coprire la zona di tessuto completamente) del blocco perossidasi all'interno del cerchio idrofobico sul vetrino ed incubare i vetrini in blocco perossidasi per 5 min.
- Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
- Porre una goccia di BLOCK ACE tampone di bloccaggio su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
- Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
- Mettere una goccia di soluzione di avidina su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
- Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
- Mettere una goccia di soluzione di biotina su ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
- Risciacquare slides con TBST, poi mettere in TBST per 5 min.
- Incubare vetrini con diluizione di 1:1000 topo anti-B7-H1 anticorpo monoclonale (clone 5H1) o un mouse IgG1 κ controllo isotipico in 200 microlitri TBST a 4 ° C per una notte per 22 ore + / - 1 h. La concentrazione finale di anticorpo in TBST è 2,57 mg / ml.
- Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
- Incubare vetrini con biotina coniugata ratto anti-topo IgG1 anticorpo secondario ad una concentrazione 1:500 (in 200 ul di soluzione al 2% di siero di capra) per 30 min.
- Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
- Una goccia di streptavidina-biotina Complex (deve essere preparata almeno 30 minuti prima dell'uso) su ciascun vetrino e incubare per 15 min.
- Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
- Porre una goccia di reagente di amplificazione (diluito 2:1 con TBST) su ogni diapositiva e incubare per 4 min.
- Sciacquare i vetrini con TBST, quindi posto in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
- Porre una goccia di streptavidina-HRP in ogni diapositiva e incubare per 15 minuti.
- Sciacquare i vetrini con TBST, poi mettere in TBST per 5 min. Ripetere due volte.
- Una goccia di 3,3-diaminobenzidina (DAB) e substrato cromogeno su ciascun vetrino e sviluppare il colore per 2 min.
- Subito dopo lo sviluppo del colore, lavare i vetrini con DDH 2 O per 1-2 min.
- Incubare vetrini con una goccia di ematossilina per 90 sec.
- Lavare con DDH 2 O per 1-2 min.
- Lavare con acqua corrente e sapone per 1-2 min.
- Lavare con DDH 2 O per 1-2 min.
4. Disidratazione e montaggio
- Immergere i vetrini in etanolo al 80% per 3 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 3 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 5 min. Ripeti.
- Immergere i vetrini in xilene per 5 min. Ripeti.
- Aggiungere una goccia diCytoseal 60 a diapositiva e il luogo del coprioggetto.
La Tabella 1 elenca i reagenti utilizzati nelle procedure sopra descritte.
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Representative Results
Un successo colorazione immunoistochimica di B7-H1 dimostrerà l'espressione eterogenea di B7-H1 (marrone segnali di sviluppo di colore DAB) in adenocarcinoma pancreatico. Alcune cellule pancreatiche adenocarcinoma hanno espressione prevalentemente membranosa B7-H1 (Figura 1A), mentre altri hanno espressione sia prevalentemente citoplasmatica di B7-H1 o espressione poco B7-H1 (figure 2 e 3). Epitelio dotto pancreatico normale esprime poco B7-H1 (Figura 4). Colorazione con un anticorpo IgG1 κ controllo isotipico, anziché l'anticorpo anti-B7-H1 mostra una colorazione poco sfondo (Figura 1B).
Figura 1. A. colorazione immunoistochimica con l'anti-B7-H1, anticorpo clone 5H1 mostra l'espressione di membrana sulle cellule di adenocarcinoma del pancreas alcuni. B. Immunohistoccolorazione chimici ed al controllo isotipo IgG1 mostra poco sviluppo di colore DAB sul tessuto stesso adenocarcinoma pancreatico.
Figura 2. B7-H1 espressione nel citoplasma di cellule di adenocarcinoma del pancreas.
Figura 3. Alcune cellule pancreatiche adenocarcinoma esprimono poco B7-H1.
Figura 4. B7-H1 espressione dell'epitelio duttale pancreatico normale.
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Discussion
Immunoistochimica del B7-H1 sulla criosezioni è stato riportato in studi precedenti per una varietà di tumori 3,4. Tuttavia, clinici campioni tumorali di solito sono disponibili solo in forma di paraffina-incastonati blocchi. L'anticorpo monoclonale 5H1 è recentemente stato applicato con successo per la colorazione di tessuti inclusi in paraffina tumorali compresi carcinoma renale, carcinoma della cervice, carcinoma della vescica e melanoma 13-18. B7-H1 colorazione su inclusi in paraffina 9,19 o criostato 20 sezioni di tessuti pancreatici di adenocarcinoma con altri anticorpi monoclonali è stata anche riportata. Qui, abbiamo dimostrato con successo la colorazione di tessuti inclusi in paraffina adenocarcinoma del pancreas con l'anticorpo monoclonale 5H1 B7-H1. L'espressione di B7-H1 in adenocarcinoma pancreatico è eterogeneo, simile a quella in molti altri tipi di tumori come il melanoma 4,21. Espressione sia membranosa e citoplasmatica di B7-H1 are osservato con adenocarcinoma (figure 1 e 2). Espressione membranosa di B7-H1 è coerente con la sua funzione biologica. Il ruolo della citoplasmatica B7-H1 in tessuti neoplastici rimane da esplorare. Pancreatiche normali cellule epiteliali del dotto o acinose non esprimono B7-H1 (Figura 4).
Tutti i passaggi in questo protocollo avvenire a temperatura ambiente, tranne per l'incubazione per una notte a 4 ° C. Recupero dell'antigene condizioni utilizzate in questo B7-H1 procedura di colorazione non sono stati riportati nel suddetto pubblicazioni 9,19. La fase di amplificazione non è stato usato anche da questi studi. Abbiamo trovato che i passaggi critici in questo protocollo includono il recupero dell'antigene, la notte di incubazione con l'anticorpo primario, l'amplificazione e lo sviluppo del colore DAB. La diluizione dell'anticorpo primario potrebbe essere necessario da titolare leggermente per ogni diverso lotto di 5H1. Amplificazione è stata mantenuta esattamente 4 min conun reagente di amplificazione diluito. Queste modifiche danno sufficiente amplificazione di segnali positivi senza aumentare sfondo. Il tempo di sviluppo è tipicamente 2 min, ma di routine monitorare lo sviluppo al microscopio per garantire la colorazione ottimale con sfondo minimo. Con ogni turno di colorazione, si includono uno scivolo da un lotto precedente e uno scivolo di tessuto tonsillare come controlli positivi. Colorazione Paracortical di B7-H1 in tonsille è stato precedentemente descritto 4. Se lo sfondo è elevato o se ci vuole più di 5 minuti a sviluppare segnali tipici in questi vetrini di controllo, si consiglia di sostituire i reagenti per le fasi critiche e controllando tutte le fasi di colorazione.
L'uso di questa tecnica consente di colorazione per analisi qualitativa e semi-quantitativa di B7-H1 espressione e la localizzazione delle cellule neoplastiche adenocarcinoma pancreatico. Con modifica della diluizione dell'anticorpo primario, la lunghezza e la diluizione del amplificatiil passo, e il tempo di sviluppo del colore, questo protocollo può essere applicato ad altri tipi di tessuto. Abbiamo modificato questo protocollo e lo ha utilizzato per il cancro al seno e dei tessuti sarcoma. Come B7-H1 e il suo legame al PD-1 forniscono una maggiore tumore segnale indotto immunosoppressiva nel microambiente del tumore, questa tecnica di colorazione faciliterà la nostra comprensione del ruolo del microambiente del tumore in apertura del tumore, la progressione e anti-tumorale risposta immunitaria.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
EB, KMB, e HX contribuiscono allo stesso modo. Questo studio è stato sostenuto dal SPORE NCI in tumori gastrointestinali P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Fondazione Lustgarten, Viragh Foundation, Investigator Award ASCO giovane, NIH CA0090701 5T32-28 Training Grant, Sol Centro pancreatico Goldman Cancer, e della Fondazione Nazionale Pancreas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
References
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