Summary
B7-H1 (PD-L1) и его привязка к PD-1 обеспечивает основной опухоли индуцированные иммуносупрессивной сигнала в микроокружение опухоли. Иммуногистохимического техники окрашивания, чтобы охарактеризовать выражением и локализации B7-H1 поджелудочной железы аденокарцинома описано здесь.
Abstract
B7-H1/PD-L1, член B7 семьи иммунной нормативно поверхности клеток белков, играет важную роль в негативной регуляции клеточного иммунного ответа через его взаимодействие с рецептором, запрограммированной смерти-1 (PD 1) 1,2. Избыточная B7-H1 опухолевыми клетками было отмечено в ряде опухолей человека, в том числе меланомы, глиобластомы и рака легкого, молочной железы, толстой кишки, яичников, почек и клетки, и было показано, нарушить противоопухолевых Т- клеточного иммунитета 3-8.
Недавно B7-H1 выражение ткани поджелудочной железы аденокарцинома была определена в качестве потенциального прогностическим маркером 9,10. Кроме того, блокада B7-H1 в мышиной модели рака поджелудочной железы был показан по производству противоопухолевого ответа 11. Эти данные свидетельствуют о важности B7-H1 в качестве потенциальной терапевтической мишени. Anti-B7-H1 антитела блокады, следовательно, проходят клинические испытания для мноКратные человека солидных опухолей, включая меланомы и рака легких, толстой кишки, почек, желудка и поджелудочной железы 12.
Для того, чтобы в конечном итоге быть в состоянии идентифицировать пациентов, которые выиграют от B7-H1 таргетинга терапии, важно исследовать связь между выражением и локализации B7-H1 и реакции пациента на лечение B7-H1 антитела блокады. Изучение экспрессии B7-H1 в человеческой аденокарциномы поджелудочной ткани через иммуногистохимии даст лучшее понимание того, как это сотрудничество ингибирующее сигнальная молекула участвует в подавлении противоопухолевого иммунитета в микроокружение опухоли. Анти-B7-H1 моноклональных антител (клон 5Н1) разработал Чэнь и его коллеги была показана для получения надежных результатов окрашивания в cryosections несколько типов человеческих опухолевых тканях 4,8, но окрашивание на парафин слайды были проблемы, пока Недавно 13-18. У нас есть разработчикасбежала B7-H1 окрашивания протокол парафин слайды ткани поджелудочной железы аденокарцинома. B7-H1 окрашивания протокол, описанный здесь, производит последовательную мембранных и цитоплазматических окрашивания B7-H1 с небольшим фоном.
Protocol
B7-H1/PD-L1, член B7 семьи иммунной нормативно поверхности клеток белков, играет важную роль в негативной регуляции клеточного иммунного ответа через его взаимодействие с рецептором, запрограммированной смерти-1 (PD 1) 1,2. Избыточная B7-H1 опухолевыми клетками было отмечено в ряде опухолей человека, в том числе меланомы, глиобластомы и рака легкого, молочной железы, толстой кишки, яичников, почек и клетки, и было показано, нарушить противоопухолевых Т- клеточного иммунитета 3-8.
Недавно B7-H1 выражение ткани поджелудочной железы аденокарцинома была определена в качестве потенциального прогностическим маркером 9,10. Кроме того, блокада B7-H1 в мышиной модели рака поджелудочной железы был показан по производству противоопухолевого ответа 11. Эти данные свидетельствуют о важности B7-H1 в качестве потенциальной терапевтической мишени. Anti-B7-H1 антитела блокады, следовательно, проходят клинические испытания для нескольких человексолидных опухолей, включая меланомы и рака легких, толстой кишки, почек, желудка и поджелудочной железы 12.
Для того, чтобы в конечном итоге быть в состоянии идентифицировать пациентов, которые выиграют от B7-H1 таргетинга терапии, важно исследовать связь между выражением и локализации B7-H1 и реакции пациента на лечение B7-H1 антитела блокады. Изучение экспрессии B7-H1 в человеческой аденокарциномы поджелудочной ткани через иммуногистохимии даст лучшее понимание того, как это сотрудничество ингибирующее сигнальная молекула участвует в подавлении противоопухолевого иммунитета в микроокружение опухоли. Анти-B7-H1 моноклональных антител (клон 5Н1) разработал Чэнь и его коллеги была показана для получения надежных результатов окрашивания в cryosections несколько типов человеческих опухолевых тканях 4,8, но окрашивание на парафин слайды были проблемы, пока Недавно 13-18. Мы разработали B7-H1 stainiнг протокол парафин слайды ткани поджелудочной железы аденокарцинома. B7-H1 окрашивания протокол, описанный здесь, производит последовательную мембранных и цитоплазматических окрашивания B7-H1 с небольшим фоном.
1. Де-parafinization
- Выпекать скользит при 55 ° С в течение 20 мин.
- В химической капот, погружают слайды в ксилоле в течение 10 мин.
- Погрузитесь слайды в свежем ксилола в течение 10 мин.
- Погрузитесь скользит в 100% этаноле в течение 5 мин.
- Погрузитесь скользит в свежем 100% этанола в течение 5 мин.
- Погрузитесь скользит в 95% этаноле в течение 5 мин.
- Погрузитесь скользит в 80% этаноле в течение 5 мин.
- Погрузитесь скользит в деионизированной воде в течение 5 мин.
2. Антиген поиска
- Погрузитесь слайды в Трис-ЭДТА буфере (рН 9,0) и тепловой энергии в скороварке до 125 ° C в течение 30 секунд, затем 90 ° С в течение 10 сек.
- Пусть слайды остыть в течение 60 мин.
- Погрузитесь слайды в TBST в течение 5 мин; рэпев два раза.
3. Окрашивание
- Протрите решений по всему ткани на слайдах. Отметить круг вокруг ткани с гидрофобным перо.
- Поместите слайды в камере влажности и избежать высыхания тканей на слайде на протяжении всего процесса окрашивания. Место одной капле (около 200 мкл или больше, чтобы покрыть тканью области полностью) пероксидазы блока в гидрофобной круг на слайде и инкубировать слайды в блоке пероксидазы в течение 5 мин.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
- Место одна капля BLOCK ACE блокирующего буфера на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
- Место одна капля Авидин решение на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
- Место одна капля Биотин решение на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
- Промыть SLIде с TBST, то место в TBST в течение 5 мин.
- Инкубируйте слайды с 1:1000 разведения мышей анти-B7-H1 моноклональных антител (клон 5Н1) или мышь IgG1 κ контроля изотипа в 200 мкл TBST при 4 ° С в течение ночи на 22 часов + / - 1 час. Конечная концентрация антител в TBST составляет 2,57 мкг / мл.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
- Инкубируйте слайды с биотином сопряженных антимышиным IgG1 вторичные антитела в концентрации 1:500 (в 200 мкл 2% козьей сыворотки, раствора) в течение 30 мин.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
- Место одна капля стрептавидин-биотин комплекса (должна быть подготовлена в течение 30 мин до использования) на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
- Место одну каплю реагента усиления (разбавленный 2:1 с TBST) на каждом слайде и инкубировать в течение 4 мин.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
- Место одна капля стрептавидин-HRP на каждом слайде и инкубировать в течение 15 мин.
- Промыть слайдов с TBST, то место в TBST в течение 5 мин. Повторите два раза.
- Поместите одну каплю 3,3-диаминобензидина (DAB) субстрат и хромоген на каждом слайде и развитие цвета в течение 2 мин.
- Сразу же после окрашивания, мыть стекла с DDH 2 O в течение 1-2 мин.
- Инкубируйте слайды с одной каплей гематоксилином в течение 90 сек.
- Промыть DDH 2 O в течение 1-2 мин.
- Промыть мыльной водой из-под крана в течение 1-2 мин.
- Промыть DDH 2 O в течение 1-2 мин.
4. Обезвоживание и монтаж
- Погрузитесь слайды в 80% этаноле в течение 3 мин.
- Погрузитесь слайды в 95% этаноле в течение 3 мин.
- Погрузитесь слайды в 100% этанола в течение 5 мин. Повторить.
- Погрузитесь слайды в ксилоле в течение 5 мин. Повторить.
- Добавьте одну каплюCytoseal 60 до слайды и место покровное.
В таблице 1 перечислены реагенты, используемые в описанных выше процедур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное иммуногистохимического окрашивания B7-H1 будет демонстрировать гетерогенных выражение B7-H1 (коричневый цвет сигналы DAB развития) в поджелудочной аденокарциномы. Некоторые клетки поджелудочной железы аденокарциномы имеют преимущественно мембранных выражение B7-H1 (рис. 1А), тогда как другие имеют либо преимущественно цитоплазматическая экспрессия B7-H1 или мало выражение B7-H1 (рис. 2 и 3). Нормальный поджелудочной железы эпителия выражает мало B7-H1 (рис. 4). Окрашивание с помощью мыши IgG1 антитела κ контроля изотипа вместо анти-B7-H1 антитела показывает мало окрашивание фона (рис. 1б).
Рисунок 1. А. Иммуногистохимическое окрашивание с анти-B7-H1, клон 5H1 антител показывает, мембранные выражении на некоторых клеток поджелудочной железы аденокарцинома. B. Immunohistochemical окрашивание с контролем изотипа IgG1 показывает немного цвета DAB развития на той же ткани аденокарциномы поджелудочной железы.
Рисунок 2. B7-H1 выражение в цитоплазме клеток поджелудочной железы аденокарцинома.
Рисунок 3. Некоторые клетки поджелудочной железы аденокарцинома выразить немного B7-H1.
Рисунок 4. B7-H1 выражении на нормальные панкреатического протоков эпителий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Иммуногистохимического окрашивания B7-H1 на cryosections сообщалось в предыдущих исследованиях для различных видов рака 3,4. Однако, клинические образцы опухоли обычно доступны только в виде парафин блоков. 5H1 моноклональные антитела, совсем недавно успешно применяется для окрашивания парафин опухоль тканей, включая рак почки, рак шейки матки, рак мочевого пузыря и меланома 13-18. B7-H1 пятна на парафин или 9,19 криостат 20 секций поджелудочной железы аденокарцинома тканей с других моноклональных антител также не поступало. Здесь мы показали успешное окрашивание парафиновых срезах тканей поджелудочной железы аденокарцинома с 5H1 моноклональные антитела к В7-H1. Выражение B7-H1 поджелудочной железы аденокарцинома является гетерогенным, подобный тому, во многих других видах злокачественных опухолей, таких как меланома 4,21. Оба мембранных и цитоплазматических выражение B7-H1 арэлектронной наблюдается аденокарцинома клетки (рис. 1 и 2). Мембранные выражение B7-H1 в соответствии с его биологической функции. Роль цитоплазматических B7-H1 в опухолевых тканях еще предстоит изучить. Нормальный поджелудочной железы эпителиальные клетки или ацинарных не выражают B7-H1 (рис. 4).
Все шаги в этом протоколе происходить при комнатной температуре, за исключением инкубации в течение ночи при 4 ° C. Антиген поиск условий, используемых в этой B7-H1 окрашивания процедуры не были представлены в вышеупомянутых публикациях 9,19. Усиление шаг был также не работают в этих исследованиях. Мы обнаружили, что критические шаги в этом протоколе включать антиген поиска, ночной инкубации с первичными антителами, усиления и развития DAB цвета. Разбавления первичных антител, возможно, необходимо титровать немного для каждой партии 5H1. Усиление была сохранена ровно в 4 мин сразбавленных реагентов усиления. Эти изменения дают достаточное усиление позитивных сигналов без увеличения фона. Время разработки, как правило, 2 мин, но мы регулярно следить за развитием под микроскопом, чтобы обеспечить оптимальное окрашивание с минимальным фоном. С каждым раундом окрашивания, мы включать в себя один слайд из предыдущей партии и один слайд из ткани миндалин качестве положительного контроля. Паракортикальная окрашивания B7-H1 в миндалине был описан ранее 4. Если фон является высоким или если она длится более 5 минут, чтобы развивать типичные сигналы управления в этих слайдах, мы рекомендуем заменять реагенты для критических шагов и проверка всех окрашивания шаги.
Использование этой техники окрашивания позволяет для качественного и полуколичественного анализа B7-H1 выражения и локализацией на опухолевые клетки аденокарциномы поджелудочной железы. С изменением разведения первичных антител, длина и разведение amplificatiна шаг, и время проявления цвета, этот протокол может быть применена к другим типам тканей. Мы модифицировали этот протокол и использовать его для рака молочной железы и саркомы тканей. Как B7-H1 и ее привязки к PD-1 обеспечивает основной опухоли индуцированные иммуносупрессивной сигнала в микроокружение опухоли, это окрашивание техники будет способствовать нашему пониманию роли микроокружения опухоли в опухоль инициации, прогрессии и противоопухолевый иммунный ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
EB, КМБ, и HX в равной мере. Это исследование было поддержано SPORE NCI в желудочно-кишечного P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten фонд, Фонд Viragh, ASCO премия для молодых следователь, NIH 5T32 CA0090701-28 Обучение Грант, Sol Goldman рака поджелудочной железы центр и Национальный фонд поджелудочной железы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
References
- Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
- Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
- Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
- Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
- Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
- Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
- Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
- Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
- Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
- Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
- Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
- Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
- Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
- Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
- Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
- Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
- Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
- Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
- Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
- Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
- Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37 (2012).
