Summary
Isolatie van lymfocyten met behulp van de Miltenyi MAC-kit is een betrouwbare manier om cellen van hele lymfeweefsel homogenaten te zuiveren. Cellen gezuiverd met behulp van de Miltenyi systeem zijn meestal ≥ 96% zuiver. Hier tonen we de stappen die zijn genomen om CD4 + T-cellen, een van de vele kits worden aangeboden door Miltenyi isoleren.
Abstract
Isolatie van cellen uit de primaire bron is een noodzakelijke stap in veel meer complexe protocollen. Miltenyi biedt kits te isoleren cellen van verschillende organismen waaronder de mens, niet-menselijke primaten, rat en, zoals we hier beschrijven, muizen. Magnetische bead-based celscheiding maakt zowel positieve selectie (of cel depletie) als negatieve selectie. Hier tonen we negatieve selectie van de ongerepte of na ve CD4 + helper T-cellen. Met behulp van deze standaard protocol we meestal zuiveren cellen die ≥ 96% zuiver CD4 + / CD3 +. Dit protocol wordt gebruikt in combinatie met het protocol Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen gepubliceerd in nummer 7 van Jupiter, voor het zuiveren van T-cellen en andere celtypes te adoptief dragen voor de beeldvorming doeleinden. Hoewel we FACS-analyse niet aan te tonen in dit protocol video, is het sterk aanbevolen om de totale zuiverheid van de geïsoleerde cellen met behulp van de juiste antilichamen via FACS te controleren. Daarnaast tonen we de niet-steriele methode van T-cel isolatie. Als steriele cellen nodig zijn voor uw specifieke end-user applicatie, moet u alle van de aangetoonde procedures in de weefselkweek kap doen onder standaard steriele omstandigheden. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw eigen experimenten!
Protocol
Lees en volg het protocol opgenomen in de Miltenyi kit of online op http://www.miltenyibiotec.com/ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolatie van cellen uit de primaire bron is een noodzakelijke stap in veel meer complexe protocollen. Miltenyi biedt kits te isoleren cellen van verschillende organismen waaronder de mens, niet-menselijke primaten, rat en, zoals we hier beschrijven, muizen. Magnetische bead-based celscheiding maakt zowel positieve selectie (of cel depletie) als negatieve selectie. Hier tonen we negatieve selectie van de ongerepte of na ve CD4 + helper T-cellen. Met behulp van deze standaard protocol we meestal zuiveren cellen die ≥ 96% zuiver CD4 + / CD3 +. Hoewel we FACS-analyse niet aan te tonen in dit protocol video, is het sterk aanbevolen om de totale zuiverheid van de geïsoleerde cellen met behulp van de juiste antilichamen via FACS te controleren. Daarnaast tonen we de niet-steriele methode van T-cel isolatie. Als steriele cellen nodig zijn voor uw specifieke end-user applicatie, moet u alle van de aangetoonde procedures in de weefselkweek kap doen onder standaard steriele omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen Rebecca Paquett bedanken voor de bereiding van MACS buffer.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
