Summary
Isolamento dei linfociti utilizzando il kit di Miltenyi MAC è un modo affidabile per purificare le cellule da tutta omogenati di tessuto linfoide. Cellule purificate utilizzando il sistema Miltenyi sono tipicamente ≥ 96% puro. Qui, le misure prese per isolare cellule T CD4 +, uno dei tanti kit offerto da Miltenyi.
Abstract
L'isolamento di cellule dalla fonte primaria è un passo necessario in molti protocolli più complessi. Miltenyi offre kit per isolare cellule di diversi organismi compresi gli esseri umani, primati non umani, ratto e, come abbiamo descritto qui, topi. Perla magnetica a base di separazione cellulare permette a ciascuna selezione positiva (o deplezione delle cellule), così come selezione negativa. In questo studio dimostriamo selezione negativa dei CD4 ve intatta o na + cellule T helper. Utilizzando questo protocollo standard che di solito purificare le cellule CD4 che sono ≥ 96% puro + / CD3 +. Questo protocollo è utilizzato in combinazione con il protocollo di dissezione e 2-Photon Imaging dei linfonodi periferici in topi pubblicato nel numero 7 di Giove, per la purificazione delle cellule T e altri tipi di cellule per trasferire adoptively per scopi di imaging. Anche se non ha dimostrato l'analisi FACS in questo video protocollo, si consiglia vivamente di verificare la purezza complessivo di cellule isolate utilizzando gli anticorpi adeguati tramite FACS. Inoltre, dimostrare la non-sterili metodo di isolamento delle cellule T. Se le cellule sterili sono necessari per il vostro particolare end-user, essere sicuri di fare tutte le procedure dimostrato nel cofano coltura tissutale riferiti alle seguenti condizioni sterili. Grazie per la visione e buona fortuna con i vostri esperimenti!
Protocol
Si prega di leggere e seguire il protocollo incluso nel kit Miltenyi oppure online su http://www.miltenyibiotec.com/ .
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Discussion
Isolamento di cellule dalla fonte primaria è un passo necessario in molti protocolli più complessi. Miltenyi offre kit per isolare cellule di diversi organismi compresi gli esseri umani, primati non umani, ratto e, come abbiamo descritto qui, topi. Perla magnetica a base di separazione cellulare permette a ciascuna selezione positiva (o deplezione delle cellule), così come selezione negativa. In questo studio dimostriamo selezione negativa dei CD4 ve intatta o na + cellule T helper. Utilizzando questo protocollo standard che di solito purificare le cellule CD4 che sono ≥ 96% puro + / CD3 +. Anche se non ha dimostrato l'analisi FACS in questo video protocollo, si consiglia vivamente di verificare la purezza complessivo di cellule isolate utilizzando gli anticorpi adeguati tramite FACS. Inoltre, dimostrare la non-sterili metodo di isolamento delle cellule T. Se le cellule sterili sono necessari per il vostro particolare end-user, essere sicuri di fare tutte le procedure dimostrato nel cofano coltura tissutale riferiti alle seguenti condizioni sterili.
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Acknowledgments
Ringraziamo Rebecca Paquett per la preparazione del tampone MACS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
