Summary
Isolement des lymphocytes utilisant le MAC Miltenyi kit est un moyen fiable pour purifier les cellules de l'ensemble des homogénats de tissu lymphoïde. Les cellules purifiées en utilisant le système Miltenyi sont typiquement ≥ 96% pur. Ici, on justifie les mesures prises pour isoler les cellules CD4 + T, l'une des nombreuses trousses offertes par Miltenyi.
Abstract
Isolement de cellules provenant de la source primaire est une étape nécessaire dans de nombreux protocoles plus complexes. Miltenyi propose des kits d'isoler les cellules de plusieurs organismes, y compris les humains, les primates non humains, le rat et, comme nous le décrivons ici, chez la souris. Séparation magnétique des cellules à base de billes permet soit la sélection positive (ou la déplétion des cellules) ainsi que la sélection négative. Ici, nous démontrons une sélection négative des cellules CD4 avez intacte ou Na + cellules T auxiliaires. En utilisant ce protocole standard, nous purifie généralement les cellules qui sont ≥ 96% de CD4 pur + / CD3 +. Ce protocole est utilisé en conjonction avec le protocole de dissection et de 2-Photon Imaging des ganglions lymphatiques périphériques dans des souris publiée dans le numéro 7 de Jupiter, pour la purification des cellules T et d'autres types cellulaires au adoptive transfert à des fins d'imagerie. Bien que nous n'ayons pas démontrer analyse FACS dans cette vidéo de protocole, il est fortement recommandé de vérifier la pureté globale des cellules isolées en utilisant les anticorps appropriés par FACS. En outre, nous démontrons la méthode non-stériles de l'isolement de lymphocytes T. Si les cellules stériles sont nécessaires pour votre particulière de l'utilisateur final demande, être sûr de faire toutes les procédures ont démontré dans la hotte de culture de tissus dans des conditions standard stériles. Merci pour regarder et bonne chance avec vos propres expériences!
Protocol
S'il vous plaît lire et suivre le protocole inclus dans le kit Miltenyi ou en ligne à http://www.miltenyibiotec.com/ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolement de cellules provenant de la source primaire est une étape nécessaire dans de nombreux protocoles plus complexes. Miltenyi propose des kits d'isoler les cellules de plusieurs organismes, y compris les humains, les primates non humains, le rat et, comme nous le décrivons ici, chez la souris. Séparation magnétique des cellules à base de billes permet soit la sélection positive (ou la déplétion des cellules) ainsi que la sélection négative. Ici, nous démontrons une sélection négative des cellules CD4 avez intacte ou Na + cellules T auxiliaires. En utilisant ce protocole standard, nous purifie généralement les cellules qui sont ≥ 96% de CD4 pur + / CD3 +. Bien que nous n'ayons pas démontrer analyse FACS dans cette vidéo de protocole, il est fortement recommandé de vérifier la pureté globale des cellules isolées en utilisant les anticorps appropriés par FACS. En outre, nous démontrons la méthode non-stériles de l'isolement de lymphocytes T. Si les cellules stériles sont nécessaires pour votre particulière de l'utilisateur final demande, être sûr de faire toutes les procédures ont démontré dans la hotte de culture de tissus dans des conditions standard stériles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Rebecca Paquett pour la préparation d'un tampon MACS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS Buffer | Reagent | None | None | Prepare as described by Miltenyi. |
| CD4+ T cell Isolation Kit: Untouched Isolation | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-860 | For use with the Miltenyi system. |
| Sterile Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Reagent | For use in the preparation of MACS buffer. | ||
| Corning 35mm Not TC-Treated Culture Dish | Other | Corning | 430588 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 70 micron Cell Strainer | Tool | BD Biosciences | 352350 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 6 mL Syringe | Tool | Tyco Healthcare, Covidien | 8881516051 | Used in the preparation of a single cell suspension. |
| 10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Reagent | Invitrogen | 14200-075 | For use in RBC lysis. |
| Sterile Water | Reagent | Sigma-Aldrich | W4502 | For use in RBC lysis. |
References
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Matheu, M. P., Deane, J. A., Parker, I., Fruman, D. A., Cahalan, M. D. Class IA phosphoinositide 3-kinase modulates basal lymphocyte motility in the lymph node. J Immunol. 179, 2261-2269 (2007).
