Summary
אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.
Abstract
רנטגן קריסטלוגרפיה היא שיטת בחירה של קבלת תצוגה מפורטת של המבנה של חלבונים. מחקרים כאלה צריכים להיות מושלמים על ידי ניתוחים ביוכימיים נוספים על מנת לקבל מידע מפורט לגבי יחסי מבנה / תפקוד. התקדמות בטכנולוגיית סינתזת oligonucleotide וגן עושה אסטרטגיות בקנה מידה גדולה יותר ויותר mutagenesis אפשריות, כולל ההחלפה של שאריות היעד על ידי כל 19 חומצות אמינו אחרות. פנוטיפים רווח או פסד--of-פונקציה אז ייאפשרו מסקנות שיטתיות לביצוע, כגון תרומה של שאריות מסוימות לפעילות, יציבות קטליטי חלבון ו / או סגולי אינטראקציה בין חלבונים.
כדי לייחס פנוטיפים השונים לאופי המוטציה - ולא לתנאי ניסוי משתנים - הוא חיוני, כדי לטהר ולנתח את החלבונים באופן מבוקר ושחזור. אסטרטגיות תפוקה גבוהה והאוטומציה של פרוטוקולים ידניים עלפלטפורמות רובוטיות נוזל טיפול יצרו הזדמנויות לביצוע נהלים מורכבים כאלה מולקולריים ביולוגיים עם התערבות קטנה אנושית ושיעורי שגיאה מינימאליים 1-5.
כאן, אנו מציגים שיטה כללית לטיהור החלבונים רקומביננטיים בתיוג באופן תפוקה גבוהה. במחקר שנערך לאחרונה, אנחנו מוחלים בשיטה זו לחקירה מפורטת מבנה לתפקוד של TFIIB, מרכיב של מנגנון השעתוק הבסיסי. TFIIB הוא הכרחי לשעתוק אמרגן מכוון במבחנה היא חיוני לגיוס פולימראז RNA למורכב preinitiation 6-8. TFIIB מכיל תחום מקשר גמיש החודר את האתר הפעיל מפשעה של RNA פולימראז 9-11. תחום מקשר זה מקנה שתי פעילויות מדידות ביוכימית TFIIB, כלומר (אני) הגירוי של הפעילות הקטליטית בשלב 'הנפל' חניכת תמליל, וכן (ii) תרומה נוספת לגיוס ספציפי של RNA פולימראז לpreinitiation 4,5,12 המורכבים. אנחנו נצלנו את שיטת טיהור התפוקה גבוהה כדי לייצר מוטציות מחיקות החלפה אחת, כפולה, משולשת ובתוך מקשר TFIIB ולאחר מכן לנתח אותם במבחנים פונקציונליים להשפעת הגירוי שלהם על הפעילות הקטליטית של RNA פולימראז 4. בסך הכל, אנחנו נוצרנו, מטוהרים ונתח 381 מוטציות - משימה שהייתה זמן רב ומייגע לבצע באופן ידני. שהפקנו וassayed את החלבונים בmultiplicates שאפשר לנו להעריך את כל וריאציות ניסיוניות ונתן לנו מושג ברור על השחזור של התוצאות שלנו.
שיטה זו משמשת כפרוטוקול גנרי לטיהור של החלבונים בתיוג ושמש בהצלחה לטיהור חלבונים רקומביננטיים אחרים. הוא מותאם כיום לטיהור של 24 חלבונים אך יכול להיות מותאם כדי לטהר עד 96 חלבונים.
Protocol
חלק א: צמיחת תפוקה גבוהה של תרבויות חיידקים.
1. לגדול חיידקי לינה ב2 מ"ל של מדיום Autoinduction באמצעות צלחות 24 גם
- Sterilise הצלחות 24 גם במיקרוגל.
- לחסן 1.5 מ"ל של מדיום autoinduction (בינוני אקספרס לינה) עם מושבות חיידקים שגודלו טרי או מניות גליצרול קפואות. בדרך כלל אנחנו לחסן שלוש בארות למוטציה עם שלוש מושבות משובטות בודדות. מילואי שש בארות לבקרות חיוביות ושליליות. עבור בקרות החיוביות אנו גדלים 3 שיבוטי wildtype ועבור הפקדים השליליים אנו גדלים 2 שיבוטים שכבר הפכו עם פלסמיד שאינם מבטא. בדקו לעיקור מספק של הצלחת על ידי השארת באר אחת ריק לשליטה בינונית בלבד.
- לגדל את התאים ל18 שעות על 37 מעלות צלזיוס ורועדת ב 250 סל"ד. אנו משתמשים Lac-BL21 מושרה (DE3) רוזטה 2 תאים. בינוני Autoinduction מכיל תערובת של גלוקוז ולקטוז. החיידקים בתחילהלהאכיל על גלוקוז ולאחר מכן להתחיל להשתמש לקטוז, שגם גורם לביטוי של החלבונים רקומביננטיים.
- הסר את המכסה והנח את הצלחת על הפלטפורמה רובוטית.
חלק ב: טיהור של חלבונים רקומביננטיים רובוטית.
2. הכן את הפלטפורמה רובוטית
איפור החיץ לשטוף בהיקף של 20 המ"מ imidazole, 0.1% Triton X-100, 0.5 מ 'NaCl, 20 המ"מימ טריס יצטט, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 המ"מ ZnOAc 2, גליצרול 10%, וחיץ elution מורכב של 0.5 מ 'imidazole, 0.1% Triton X-100, 0.5 מ' NaCl, 20 מ"מימ טריס יצטט, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 המ"מ ZnOAc 2, גליצרול 10%. מאגרים אלו ישמשו כדי לשטוף את החרוזים לאחר החלבונים המתויגים היו קשורים אליהם, או לelute את החלבונים מהחרוזים, בהתאמה.
- איפור diluent החיידקים (מים מזוקקים 100 מ"ל עם ריאגנט antifoam 15 μl). פתרון זה ישמשכדי להפוך את הדילולים של התרבויות במהלך לילה החיידקים לצפיפות אופטית (A600) מדידות. הנוכחות של antifoam בdiluent מונעת היווצרות של בועות אוויר שעשוי להפריע למדידות קורא הצלחת.
- המצא פתרון תמוגה המורכב מגיב 10x FastBreak, lysonase μl 2 לדוגמה ו15 המ"מ MgOAc 2. FastBreak מכיל תערובת של חומרי ניקוי ומלחים ששוברים את קירות תא החיידק ולאפשר את שחרורו של חלבונים תאיים. Lysonase היא תערובת קניינית של Lysozyme וnuclease. Lysozyme מסייע בשיבוש דופן התא וnuclease מעכל את חומצות הגרעין של החיידקים שפורסמו.
- אופציונלי: הפוך את פתרון הידרוכלוריד guanidine M 6. החלק מהחלבונים רקומביננטיים נוטים להיצמד למחטי pipetting מצופות טפלון. חלבוני guanidine הידרוכלוריד פתרון denatures ורוחץ אותם בצורה יעילה יותר מאשר מים המשמשים באופן שגרתי כדי לשטוף את טיפי pipetting רובוטיות רחיץ לאחר כל רחep.
- הכן את מגיב BCA (חומצת bicinchoninic) חלבון quantitation ידי פתרון ערבוב bicinchoninic חומצה (מגיב) ופתרון נחושת סולפט (מגיב ב '): אג"ח פפטיד להפחית Cu 2 + 4 ממרכיב ההווה בריאגנט BCA CuSO עד 1 Cu + לפי הסך של 1 Cu + הוא פרופורציונלי למספר קשרים המצויים בתמיסת פפטיד. בשלב שני, שתי מולקולות של חומצת bicinchoninic chelate 1 Cu + כתוצאה ממשמרת ספיגה ל562 ננומטר, וכתוצאה מצבע סגול. תגובת הצבע היא תלויה זמן ובדרך כלל זקוק לכמה שעות כדי להיות סופי. לאחר שהצבע יציב במשך כמה שעות.
- מלא שקתות או צלחות של הגודל הנכון ולמקם אותם בתפקידים שהוקצו מראש-על הפלטפורמה רובוטית.
- מקום אחד צלחת 24 גם לפסולת הידרוכלוריד guanidine, שתי צלחות 96-כן ברורות לOD 600 ומדידות ספיגה ואחת כחולה 96-צלחת גם עבור הדואר מטוהר חלבונים על עמדותיהם על הרציף. מקום אחד צלחת 96-deepwell על הדוכן המגנטי.
- דלל MagneHis Ni-חלקיקים שנקשרים לחלבונים על ידי גיבוש chelates עם תגיו 5 מתקפלים במים מזוקקים ולמלא אותם ליחידת חרוז ומסעיר. לעבור על stirrer לשמור את החרוזים בהשעיה.
- הפעל את הפלטפורמה רובוטית ולשטוף את מחטי pipetting לכמה דקות כדי להסיר בועות אוויר שאחרת להפריע לדיוק pipetting. מחטי pipetting מחדש השמישות סמוקות בין צעדי pipetting בודדים. לחלופין, טיפים חד פעמיים יכולים לשמש. כל השלבים הבאים מתבצעים כמו רובוט. הפרוטוקול רובוטית זמין על פי בקשה.
3. צמיחת תא מסומן על ידי מדידת OD600
- 10 μl של תרבות הלילה מדולל ב90 μl של פתרון diluent.
- מדוד את OD 600 כדי להבטיח שהחיידקים גדלו צפיפות דומה(איור 1).
4. התאים הם נפרדו כדי לשחרר את החלבונים ואפשר חרוז מחייב
- 100 μl של השעית חרוז Ni מגנטית מופץ לכל אחד גם מצלחת שנייה 24 כן.
- 900 μl של כל תרבות חיידקים בקנה מידה הקטנה מועבר לתוך הצלחת 24 היטב המכילה את החרוזים. הוסף 100 μl של תמהיל 10x FastBreak / lysonase.
- צלחת 24 גם הוא הועבר לפלטפורמה הרועדת לטלטול מהיר (800 סל"ד) למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. קירות תא חיידק הם מופרים על ידי שילוב של כוחות מכאניים ופעולה כימית והחלבונים שמייצרים recombinantly משתחררים לפתרון. עם תגי זיקתם הם נקשרים באופן מיידי את חרוזי ניקל chelating פאראמגנטיים.
5. את החרוזים נשטפים
- את lysates התא המכיל את החרוזים המגנטיים resuspended מועברים לצלחת 96-deepwell אשר ממוקמת על הסטנד עם מ 'מוטות agnetic שגולש בין הבארות. הצלחות גם 96-יש לי תחתית מרובעת בצורה חרוטה המאפשרת הסרה קלה של supernatant. הבארות יכולות להחזיק כרכים של עד 2.1 מ"ל, אבל מלאות בכמויות קטנות בהרבה. זה מאפשר לנו לבצע צעדים נמרצים רועדים ללא זיהום צולב מדגם בהתזה.
- עצות פיפטה נשטפות בין שלבי pipetting פרטניים עם 6 מיליון guanidine-HCl. צעד זה הוא חיוני לטיהור TFIIB וחלבונים אחרים "דביקים" כדי למנוע זיהום צולב. עם חלבונים אחרים זה עשוי להיות מספיק כדי לשטוף את המחטים בהרחבה במים בין צעדי pipetting.
- המוטות המגנטיות של הדוכן המגנטי למשוך את חרוזי פאראמגנטיים, מושכות אותם מהמרכזים של הבארות ולאפשר את מחטי pipetting גישה חופשיה לsupernatant. Supernatant נמחק.
- 500 μl של חיץ לשטוף מתווסף לראשונה לצלחת 24 היטב, ולאחר מכן הועבר לצלחת 96 היטב לדוארnsure העברה המלאה של החרוזים. הצלחת 24 גם היא להסיר את המלחייה.
- עוד 500 μl של חיץ לשטוף מתווסף ישירות לצלחת 96 היטב, הצלחת מועברת לייקרה ונמרץ מזועזע לדקות 1. הצלחת תועבר חזרה לדוכן המגנטי והחיץ לשטוף מושלך.
- צעד זה חוזר על עצמו פעמים והוא סיים לשטוף הליך על ידי הסרת כל שאריות חיץ מהצלחת.
6. Elute חלבונים במאגר elution
- 100 μl של חיץ elution מתווסף לחרוזים, הצלחת מועברת לייקרה ונמרץ מזועזע למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- הצלחת תועבר חזרה לייקרה וeluate, המכילה חלבון רקומביננטי המטוהר, מועבר לצלחת חדשה.
7. מדוד את הריכוזים של החלבונים המטוהרים
- 190 μl תמהיל מגיב BCA מועבר לצלחת ברורה 96-10 וגם μl של פרופתרון טיין הוסיף.
- לאחר כמה שעות של דגירה (בדרך כלל 5-6 או לילה), למדוד את הספיגה ולהשוות אותו לסטנדרטי BSA לקביעת ריכוזים של כל אחד מתכשירי החלבון המטוהרים (איור 2).
- החלבונים המטוהרים כעת יכולים לשמש ליישומים במורד זרם בריכוזים המתאימים (איור 3).
8. נציג תוצאות
פרוטוקול הטיהור מציע שני שלבי בקרת איכות, דוגמאות שמוצגות. אנו מסוגלים לזהות ולתעד את בעיות פוטנציאליות בשלב התפתחות החיידקים (איור 1), ומאוחר יותר על הערכת התשואות של החלבונים המטוהרים (איור 2). אנחנו בדרך כלל לטהר חלבונים ולבחון אותם בשלושה העתקים. זה, בשילוב עם שני שלבי בקרת האיכות, נותן לנו ביטחון שכל וריאציה שנצפינו במבחנים התפקודיים שלנו היא תוצאה של מוטצית phenotypדואר (איור 3), ולא נובע משינויים ניסיוניים או טהרה נכשלה. התשואות שהושגו בדרך כלל טווח 50-200 מיקרוגרם ויותר מדרוש למבחנים פונקציונליים שונים.
איור 1. היסטוגרמה של מדידות OD של צלחת גם 24 עם תרבויות לילה. שלושה שיבוטים של כמו גם של wildtype TFIIB 6 גרסות מוטצית TFIIB כבר גדל. שני שיבוטים נושאים שאינם מבטא פלסמיד וגם עם מדיום ישמשו אך ורק כקבוצת ביקורת שלילית. מדידות OD להראות שיש שינויים קטנים בשיעורי הצמיחה בין תרבויות השונות.
איור 2. תשואות חלבון המתקבלות מהתרבויות האלה, כפי שנקבע על ידי assay BCA ואושר על ידי SDS PAGE. אחת הגרסות אינה מתבטא ברמות גבוהות. בcombination עם איור 1, אנו יכולים להסיק כי זה לא היה בגלל צמיחת תאי הפרש אך בשל ביטוי חלבון אינו מושרה כראוי.
איור 3. תוצאת נציג assay שעתוק. אנחנו מדדנו את פעילות הגירוי של וריאנטים TFIIB בייצור של תמלילי נפל קטנים על ידי RNAP. הנה, את ההשפעות של גירוי ספרייה מלאה בחומצת אמינו אחת החלפות של שאריות TFIIB K87 מוצגות. הרמה הגבוהה של שחזור היא אושר על ידי שיעורי טעות קטנות. ג'ל מדגם המציג את הביצועים של שלוש מוטציות לעומת wildtype (wt) פקדים, שליליים (NC) וחיץ elution שולט רק מתואר מתחתיו.
Discussion
השיטה האוטומטית רקומביננטי חלבון הטיהור המתוארת כאן מאפשרת ייצור והטיהור של מספר גדול של חלבוני מוטציה בפורמט קטן בקנה מידה בתנאים לשעתקו מאוד עם התערבות אנושית מינימאלית. איורי 1 ו 2 תוצאות מראות של-בקרת איכות שיטתית ודוגמאות של מטוהר חלבונים. איור 3 מראה כי גורמי השעתוק המטוהר המשמשים בדוגמה זו לבצע באופן לשעתק מאוד במבחנים תפקודיים.
למרות שההליך פותח לטיהור archaeal TFIIB, זה ישים לטיהור חלבוני זיקה מתויגת-. השימוש בפרוטוקולי טיהור אוטומטיים כאלה באופן משמעותי ובכך יקל על האנליזה הביוכימית של חלבונים רקומביננטיים ובכך לקדם את ההבנה של אינטראקציות בין חלבונים בקנה מידה שקשה להשיג באופן ידני שלנו.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Wellcome פרויקט גרנט (078043/Z/05/Z) לROJW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
- Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
- Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
- Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40 (2008).
- Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
- Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C.
- Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
- Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
- Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
- Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
- Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
- Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
- Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).
