Summary
Vi beskriver ett förfarande för affinitets-märkta rening av rekombinanta proteiner med användning av vätske-hantering robotteknik. Denna metod är allmänt tillämpbar på den småskaliga rening av lösliga His-märkta proteiner i en hög genomströmning formatet.
Abstract
Röntgenkristallografi är den metod som föredras för att erhålla en detaljerad vy av strukturen av proteiner. Sådana studier måste kompletteras med ytterligare biokemiska analyser för att få detaljerade insikter i struktur / funktion relationer. Framsteg inom oligonukleotid-och gensyntes teknik göra stora mutagenes strategier alltmer möjligt, inklusive substitution av målrester av alla 19 andra aminosyror. Vinst-eller förlust-av-funktion fenotyper kan sedan systematiskt slutsatser, såsom bidrag särskilda rester till katalytisk aktivitet, protein stabilitet och / eller protein-proteininteraktion specificitet.
För att tillskriva de olika fenotyper till naturen av mutationen - snarare än till en fluktuerande experimentella förhållanden - det är viktigt att rena och analysera proteinerna på ett kontrollerat och reproducerbart sätt. Hög kapacitet strategier och automatisering av manuella protokoll omrobotic flytande hantering plattformar har skapat möjligheter att utföra sådana komplexa molekylärbiologiska förfaranden med lite mänsklig inblandning och minimal felprocent 1-5.
Här presenterar vi en generell metod för rening av His-märkta rekombinanta proteiner i en hög genomströmning sätt. I en nyligen genomförd studie, tillämpade vi denna metod till en detaljerad struktur-funktion undersökning av TFIIB, en komponent i basala transkriptionsmaskineriet. TFIIB är oumbärligt för promotor riktad transkription in vitro och är en förutsättning för rekrytering av RNA-polymeras i en preinitiation komplex 6-8. TFIIB innehåller en flexibel linker-domän som penetrerar det aktiva stället klyftan av RNA-polymeras 9-11. Denna linkerdomänen ger två biokemiskt kvantifierbara aktiviteter på TFIIB, nämligen (i) stimulering av den katalytiska aktiviteten under "misslyckade" stadium avskrift initiering, och (ii) en kompletterande bidrag tillspecifik rekrytering av RNA-polymeras i preinitiation komplexa 4,5,12. Vi utnyttjade hög genomströmning reningsmetod för att generera enkel-, dubbel och trippel substitution och strykningar mutationer inom TFIIB länkaren och därefter analysera dem i funktionella analyser för deras stimulerande effekt på den katalytiska aktiviteten av RNA-polymeras 4. Sammantaget, vi genererade, renas och analyseras 381 mutanter - en uppgift som skulle ha varit tidskrävande och arbetsamt att utföra manuellt. Vi producerade och analyserade proteiner i multiplicates som tillät oss att uppskatta eventuella experimentella variationer och gav oss en klar uppfattning om reproducerbarheten av våra resultat.
Denna metod fungerar som en generisk protokoll för rening av His-inmärkta proteiner och har med framgång använts för att rena andra rekombinanta proteiner. Det är för närvarande optimerad för rening av 24 proteiner, men kan anpassas för att rena upp till 96 proteiner.
Protocol
DEL A: hög kapacitet tillväxt av bakteriekulturer.
1. Odla bakterier Övernattning i 2 ml autoinduktionen medium med 24-brunnsplattor
- Sterilisera de 24-brunnsplattor genom mikrovågsbehandling.
- Inokulera 1,5 ml autoinduktion medium (Overnight Express Medium) med färskt odlade bakteriekolonier eller frysta lager glycerol. Vi ympa normalt tre brunnar per mutant med tre klonade individuella kolonier. Reserv sex brunnar för positiva och negativa kontroller. För de positiva kontrollerna vi växer upp tre vild typ kloner och för de negativa kontrollerna som vi växer upp 2 kloner som har transformerats med en icke-uttryckande plasmid. Kontrollera om tillräcklig sterilisering av plattan genom att lämna en väl tomt på medellång enda kontroll.
- Odla cellerna i 18 timmar vid 37 ° C och skakning vid 250 varv per minut. Vi använder lac-inducerbara BL21 (DE3) Rosetta 2-celler. Autoinduktionen medium innehåller en blandning av glukos och laktos. Bakterierna initialtlivnär sig på glukos och sedan börja använda laktos, som också leder till uttryck av de rekombinanta proteinerna.
- Ta av locket och placera plattan på robot-plattformen.
DEL B: Robotic rening av rekombinanta proteiner.
2. Förbered Robotic plattformen
Fyll tvättbuffert bestående av 20 mM imidazol, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetat, 7,9 pH, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol, och elueringsbufferten bestående av 0,5 M imidazol, 0,1% Triton X-100, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-acetat, 7,9 pH, 10 mM MgOAc 2, 0,7 mM ZnOAc 2, 10% glycerol. Dessa buffertar används för att tvätta pärlorna efter de märkta proteinerna har bundits till dem, eller att eluera proteinerna från kulorna, respektive.
- Späd den bakteriella utspädningsmedlet (100 ml destillerat vatten med 15 pl skumdämpande reagens). Denna lösning kommer att användasatt utspädningar av de bakteriella natten kulturer för optisk densitet (A600) mätningar. Närvaron av skumdämpningsmedel i utspädningsmedlet förhindrar bildningen av luftbubblor som skulle kunna störa mätningarna plattläsare.
- Fyll lys lösning som består av 10x FastBreak reagens, 2 pl lysonase per prov och 15 mM MgOAc 2. FastBreak innehåller en blandning av rengöringsmedel och salter som bryter mot bakteriella cellväggar och underlätta frisläppandet av intracellulära proteiner. Lysonase är en egen blandning av lysozym och nukleas. Lysozym hjälper störa cellväggen och nukleaset digererar de frisatta bakteriella nukleinsyror.
- Tillval: Gör upp en 6 M guanidinhydroklorid lösning. Några rekombinanta proteiner tenderar att hålla sig till teflonbelagda pipetteringssteg nålar. De guanidinhydrokloridlösning denaturerar proteiner och tvättar dem mer effektivt än vatten som rutinmässigt används för att skölja tvättbara robot pipettering tips efter varje mep.
- Förbered BCA (bicinkoninsyra) reagens-protein kvantifiering genom blandning bicinkoninsyra lösning (reagens A) och kopparsulfatlösning (reagens B): peptidbindningar reducerar Cu 2 + från CuSO 4 komponenten närvarande i BCA reagenset till Cu 1 + varigenom mängden Cu 1 + är proportionell mot antalet peptidbindningar närvarande i lösningen. I ett andra steg, två molekyler bicinkoninsyra kelat Cu 1 + resulterar i en absorbans skifte till 562 nm, vilket resulterar i en lila färg. Färgreaktionen är tidsberoende och oftast behöver flera timmar för att vara definitiv. Efter att färgen är stabil under flera timmar.
- Fyll tråg eller plattor av rätt storlek och placera dem i deras redan har avdelats positioner på robot-plattformen.
- Placera en 24-brunnsplatta för guanidinhydroklorid avfallet, två tydliga 96-brunnars plattor för OD 600 och mätningar absorbans och en blå 96-brunnsplatta för the renade proteiner på sina positioner på plattformen. Placera en 96-Deepwell skylt på den magnetiska monter.
- Späd MagneHis Ni-partiklar som binder proteiner genom att bilda kelat med sina His-taggar 5-faldiga i destillerat vatten och fyll dem till pärlan-omrörning enhet. Slå omröraren på att hålla kulorna i suspension.
- Slå på robotanordningen plattformen och spola pipettering nålar för flera minuter för att avlägsna luftbubblor som annars skulle störa pipettering noggrannhet. De återanvändbara pipettering nålar spolas mellan enskilda pipetteringssteg. Alternativt skulle engångsspetsar användas. Alla efterföljande steg utförs robot. Den robotliknande protokollet finns tillgänglig på begäran.
3. Cell Tillväxten kontrolleras genom mätning av OD600
- 10 il nattgammal kultur späds i 90 pl utspädningslösning.
- Mät OD 600 för att säkerställa att bakterierna har vuxit till liknande densiteter(Figur 1).
4. Cellerna bryts upp för att frigöra proteiner och tillåta Bead-bindande
- 100 pl av magnetisk Ni-pärlsuspension fördelas i varje brunn i en andra 24-brunnsplatta.
- 900 pl av varje liten skala bakteriekultur överföres till 24-brunnars platta innehållande pärlorna. Tillsätt 100 ul av 10x FastBreak / lysonase mix.
- Den 24-brunnsplatta överförs till skakplattform för snabb skakning (800 rpm) under 30 minuter vid rumstemperatur. Bakteriernas cellväggar störs av en kombination av mekaniska krafter och kemisk påverkan och de rekombinant producerade proteinerna frigörs i lösning. Med sina affinitetsmarkörer de binder omedelbart paramagnetiska kelatbildande nickel pärlor.
5. Kulorna sköljs
- De cell-lysat innehållande de återsuspenderade magnetiska pärlorna överförs till en 96-Deepwell platta som är placerad på ett stativ med magnetic stavar som glider mellan brunnarna. De 96-brunnars plattor har fått en kvadratisk konformad botten som medger lättare avlägsnande av supernatanten. Brunnarna kan hålla volymer av upp till 2,1 ml men är fyllda med mycket mindre volymer. Detta ger oss möjlighet att utföra kraftig skakning steg utan prov korskontaminering genom stänk.
- Pipettspetsarna tvättas mellan enskilda pipetteringssteg med 6 M guanidin-HCl. Detta steg är avgörande för rening av TFIIB och andra "klibbiga" proteiner för att undvika korskontaminering. Med andra proteiner kan det vara tillräckligt att skölja nålarna rikligt med vatten mellan pipetteringssteg.
- De magnetiska stavar i den magnetiska stativet attrahera de paramagnetiska pärlorna, dra dem bort från centrum i brunnarna och låta pipettering nålar fri tillgång till supernatanten. Supernatanten kastas.
- 500 pl tvättbuffert tillsätts först till 24-brunnars platta och därefter överföras till 96-brunnars platta till eNsure fullständig överföring av pärlorna. Den 24-brunnsplatta avlägsnas från skakapparaten.
- Ytterligare 500 pl tvättbuffert sättes direkt till 96-brunnsplatta, är plattan överförs till skakapparaten och skakas kraftigt i 1 min. Plattan flyttas tillbaka till den magnetiska stativet och tvättbufferten kasseras.
- Detta steg upprepas två gånger och tvättförfarandet avslutas genom att avlägsna eventuella rester buffert från plattan.
6. Eluera Proteiner i elueringsbuffert
- 100 pl elueringsbuffert sättes till pärlorna, plattan förflyttas i skakapparaten och skakas kraftigt under 30 min vid rumstemperatur.
- Plattan flyttas tillbaka i skakapparaten och eluatet, innehållande det renade rekombinanta proteinet, överförs till en ny platta.
7. Mät koncentrationerna av de renade proteinerna
- 190 pl av BCA-reagens blandningen överförs till en tydlig 96-brunnars platta och 10 pl av den proTEIN lösning tillsattes.
- Efter flera timmars inkubation (typiskt 5-6 eller över natten), mät absorbansen och jämför den med BSA standarder för att bestämma koncentrationerna av var och en av de renade proteinberedningar (figur 2).
- De renade proteinerna kan nu användas för nedströms tillämpningar i lämpliga koncentrationer (Figur 3).
8. Representativa resultat
Reningsprotokollet erbjuder två steg kvalitetskontroll, av vilka exempel visas. Vi kan identifiera och dokumentera eventuella problem på bakterietillväxten stadiet (figur 1) och senare vid bedöma halterna av renade proteiner (Figur 2). Vi renar vanligtvis proteiner och testa dem i tre exemplar. Detta, i kombination med de två stegen kvalitetskontroll, ger oss tillförsikt att varje variation vi observerade i våra funktionella analyser beror på den mutanta phenotype (Figur 3) och inte på grund av experimentella variationer eller misslyckade reningar. Avkastningen som erhålls vanligtvis intervallet 50 till 200 g och är mer än tillräckligt för olika funktionella analyser.
Figur 1. Histogram av OD mätningar av en 24-brunnsplatta med övernattkulturer. Tre kloner av sex TFIIB mutantvarianter samt av vildtyp TFIIB har odlats. Två kloner som bär en icke-uttryckande plasmiden och en brunn med medium tjänar endast som negativa kontroller. OD mätningar visar att det finns små variationer i tillväxttakt mellan olika kulturer.
Figur 2. Proteinutbyten erhållna från dessa odlingar såsom bestämts genom en BCA-analys och bekräftades genom SDS-PAGE. En av varianterna inte uttrycks vid höga nivåer. I comkombination med figur 1, kan vi konstatera att detta inte var på grund av differentiell celltillväxt men på grund av proteinuttryck inte induceras ordentligt.
Figur 3. Representativt resultat av en transkriptionsanalys. Vi mätte stimuleringen verksamhet TFIIB varianter på produktionen av små misslyckade utskrifter av RNAP. Här är stimulering effekterna av en fullständig bibliotek av enstaka aminosyrasubstitutioner av TFIIB rest K87 visas. Den höga graden av reproducerbarhet bekräftas av låga felnivåer. Ett prov gel som visar prestandan hos tre mutanterna jämfört med vildtyp (wt), negativa kontroller (NC) och elueringsbuffert endast kontrollerar avbildas under.
Discussion
Den automatiserade rekombinanta proteinet reningsmetod beskrivs här möjliggör produktion och rening av ett stort antal muterade proteiner i en småskalig formatet under starkt reproducerbara förhållanden med minimal mänsklig inblandning. Figurerna 1 och 2 visar resultaten av systematiska kvalitets-kontroller och exempel på renade proteiner. Figur 3 visar att de renade transkriptionsfaktorer som användes i detta exempel göra på ett mycket reproducerbart sätt i funktionella analyser.
Även om förfarandet var utvecklad för rening av archaeal TFIIB är det allmänt tillämpas för rening av affinitet-märkta proteiner. Användningen av sådana automatiserade reningsprotokoll kommer således avsevärt underlätta biokemisk analys av rekombinanta proteiner och därmed öka vår förståelse av protein-proteininteraktioner i en skala som är svårt att uppnå manuellt.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en Wellcome projektbidrag (078043/Z/05/Z) till ROJW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Overnight Express Instant TB Medium | Merck Chemicals Ltd | 71491-4 | |
| FastBreak | Promega Ltd. | V8573 | |
| Lysonase Bioprocessing Reagent/ 1 ml | Merck Chemicals Ltd | 71230 | |
| Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Company Ltd | A6426 | |
| MagneHis Ni-Particles | Promega | V8565 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich Company Ltd | 56750 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich Company Ltd. | 93362 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Bicinchoninic Acid protein determination | Sigma-Aldrich Company Ltd | BCA1-1KT | |
| Deep Well Plate 2.2 ml Square Wells PP pk10 | Anachem Ltd | 1810-00 | |
| Microplate MicroWell 96 well flat bottom polystyrene not treated 12 sleeves of 5 plates clear 0.4 ml well volume 128 mm x 86 mm Thermo Scientific Nunc | Fisher Scientific Ltd. | DIS-984-090M | |
| Microplate Blue | VWR | NUNC367001 | |
| 24-Well Blocks RB (24) | Qiagen | 19583 | |
| Guanidine hydrochloride | VWR | ALFAA13543.0B | |
| Washable needle for TheOnyx | Aviso GmbH | 8152-317001 | |
| Reagent Rack for Magnetic Beads | Aviso GmbH | 8152-035003 | |
| Plate Reader Synergy HT | BioTek | 4200-000043 | |
| Robotic Platform TheOnyx 44OH/150/100 | Aviso GmbH | 8145-050046 | |
| Microplate Shaker Variomag Teleshaker | Inheco | 3800047 | |
| 96-well Magnet Type A | Qiagen | 36915 |
References
- Weinzierl, R. O. The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain. BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).
- Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes. Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).
- Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases. J. Biol. 7, 40 (2008).
- Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions. Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).
- Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C.
- Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. Basal and regulated transcription in Archaea. Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).
- Parvin, J. D., Sharp, P. A. DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II. Cell. 73, 533-540 (1993).
- Tyree, C. M. Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II. Genes. 7, 1254-1265 (1993).
- Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).
- Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism. Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).
- Kostrewa, D. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation. Nature. 462, 323-330 (2010).
- Werner, F., Weinzierl, R. O. Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors. Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).
