Konstant tryk-styret Ekstrudering fremgangsmåde til fremstilling af nano-størrelse lipidvesikler

Summary

Denne protokol beskrives en ekstrudering fremgangsmåde til fremstilling af lipidvesikler af sub-micron størrelser med en høj grad af homogenitet. Denne fremgangsmåde anvender en trykstyret system med kontrolleret nitrogen strømningshastigheder for liposompræparat. Lipid præparat

Abstract

Liposomer er kunstigt fremstillet vesikler bestående af naturlige og syntetiske phospholipider, som er almindeligt anvendt som en cellemembran efterligner platform til at undersøge protein-protein og protein-lipid-interaktioner ^3, monitor drug delivery ^4,5, og indkapsling ^4. Phospholipider naturligt skabe buede lipiddobbeltlag, adskille sig fra en micelle. ⁶ Liposomer traditionelt klassificeres efter størrelse og antallet af dobbeltlag, dvs store unilamellare vesikler (LUV'er) og små unilamellære vesikler (SUV'er) og multilamellare vesikler (MLVer) ^7. Især er fremstillingen af homogene liposomer af forskellige størrelser vigtigt at studere membran krumning, der spiller en afgørende rolle i cellesignalering, endo-og exocytose, membranfusion, og protein handel ^8. Adskillige grupper analysere, hvordan proteiner anvendes til at modulere processer, der involverer membran krumning og derved fremstille liposomer med diametre under 100 - 400nm undersøge deres adfærd på cellefunktioner ^3. Andre fokuserer på liposom-medikamentindkapslingseffektivitet, studere liposomer som køretøjer til at gennemføre og levere et lægemiddel af interesse ^9. Drug indkapsling kan opnås som angivet under liposomdannelse ^9. Vores ekstruderingstrin bør ikke påvirke det indkapslede lægemiddel til to grunde bør nemlig (1) lægemiddelindkapsling opnås inden for dette trin og (2) liposomer bør bevare deres naturlige biofysiske stabilitet sikkert bærer lægemidlet i den vandige kerne. Disse forskningsmål yderligere antyder behovet for en optimeret fremgangsmåde til at designe stabile sub-micron lipidvesikler.

Ikke desto mindre har de nuværende liposompræparat teknologi (lydbehandling ^{10, fryse-og-optønings-10,} sedimentering) ikke tillader fremstilling af liposomer med stærkt krum overflade (dvs. diameter <100 nm) med høj konsistens og effektivitet ^10,5, hvilket begrænser biofysiske studier af en emerging området membran krumning sensorer. Heri, præsenteres en robust fremstillingsmetode til en række forskellige biologisk relevante liposomer.

Manuel ekstrudering med gastætte sprøjter og polycarbonatmembraner ^10,5 det er almindelig praksis, men heterogenitet ofte observeres ved anvendelse af porestørrelser under 100 nm på grund af grund af variationer af manuelt påført tryk. Vi anvendte en konstant trykstyret ekstruderingsapparat til fremstilling af syntetiske liposomer, hvis diametre ligger mellem 30 og 400 nm. Dynamisk lysspredning (DLS) ^10, elektronmikroskopi ¹¹ og nanopartikler sporing analyse (NTA) ¹² blev anvendt til kvantificering af liposomstørrelser som beskrevet i vor protokol med kommercielt polystyren (PS) perler, der anvendes som en kalibreringsstandard. En næsten lineær korrelation blev observeret mellem de anvendte porestørrelser og bestemmes eksperimentelt liposomer, hvilket indikerer high fidelity for vores trykstyret liposomfremstilling opfyldtHøder. Vi har desuden vist, at denne lipidvesikelpræparat metode er generelt anvendelig, uafhængigt af forskellige liposom størrelser. Endelig har vi også vist i en tidsforløbsundersøgelse at disse fremstillede liposomer var stabile i op til 16 timer. Et repræsentativt nanostørrelse liposompræparat protokol er vist nedenfor.

Protocol

1. Liposompræparatet

1. Hent et 20 ml hætteglas med en Teflon-foret hætte.
2. Rengør alle glasvarer og sprøjter med chloroform før brug for at forebygge forurening.
3. Overfør 100 ul af reagenskvalitet chloroform til hætteglasset under anvendelse af en 250 ul lufttæt glassprøjte.
4. Tilsættes 30 pi methanol af reagenskvalitet samme hætteglas under anvendelse af en 100 gl lufttæt glassprøjte.
5. Til fremstilling af en 2 mM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholin (POPC): phosphatidylethanolamin (POPE): cholesterol lipidopløsning, overfører 216 pi 10 mg / ml POPC, 42 pi 10 mg / ml POPE og 20 pi 11 mg / ml cholesterol opløsninger i _CHCl3 til 20 ml hætteglas.
6. Inddampes organiske opløsningsmidler med langsom strømning argon eller nitrogen-gas, indtil en tynd film af lipider er observeret på bunden af ​​hætteglasset.
7. Anbring det ikke-reducerede hætteglas i en vakuumekssikkator i mindst 30 minutter for at fjerne resterende opløsningsmiddel.
8. Transfer 2 ml buffer, tidligere passeret gennem et 0,2 mikron filter til hætteglasset for at hydratisere lipiderne.
9. Inkuberes blandingen ved 4 ° C natten over og anvendes inden for 48 timer.

2. Fryse-og-optønings: for liposom Størrelser af 30 - 100 nm kun

1. Frys liposomsuspensionen i flydende nitrogen i 15 sekunder.
2. Optø liposomsuspension anvendelse af en varmeblok ved 42 ° C temperatur i ~ 3 min.
3. Gentage trin 2.1 og 2.2 for en total af 5 cyklusser.

3. Ekstrudering

Følg Avestin instruktionerne for korrekt samler den Liposofast LF-50 ekstruder, ved hjælp af instrumentet skitse i deres guidebog.

1. Anbring det store hul støtte skærm (med cirkulære huller) i understøtningen filteret base efterfulgt af den cirkulære sintrede skålen (uden huller), et dræn skive (25 mm i diameter) og en polycarbonatmembran (25 mm i diameter).
2. Placer den lille, sorteO-ringen på toppen af ​​membranen for at fastgøre den til understøtningen filteret base.
3. Fastgør øverste filter ekstruder ved at spænde 4 skruer i de 4 tilsvarende huller.
4. Samle filteret ekstruderen enheden til under den store ekstrudercylinderen. Tilsættes liposomet løsning på cylinderen. Placere følgende oven på ekstrudering cylinderen i rækkefølge: stort cirkulært O-ring, smal hætte, stor cirkulær O-ring, cirkulær hætte.
5. Fastgøre gasregulator til ekstrudercylinderen øverste og lukke alle ventiler til at forhindre luftlækage, herunder overtryksventilen. Anbring en 20 ml hætteglas eller 50 ml Erlenmeyer-kolbe under ekstruderen filterenheden. En sikkerhedsventil er forbundet med regulatoren og vil frigive hvis trykket overstiger 600 psi. Tænde luftformig nitrogen og åbne gasventilen forbundet til ekstruderen.
6. Øge nitrogentryk på 25 psi i 400 nm liposomer, 125 psi til 100 nm liposomer og 400-500 psi til 30 nm liposomer.
7. Se liposom suspension som det udstøder i beholderen, mens den skubbes af nitrogen. Hold kvælstof flyder, indtil du ikke længere observere noget væske, der passerer gennem ekstruderen filtret ind i hætteglas.

4. Dynamisk lysspredning (DLS) Analyse

1. Fremstilling af 50 ul af en 20 uM liposom-opløsning.
2. Tænd for strømforsyningen og lampen kilde.
3. Åbne DynaPro software.
4. Indstil software til MS / X algoritme model til at opdage liposomer med 30 nm og 100 nm og MS800 algoritme model til at opdage> 100 nm liposomer.
5. Tilslut til hardware.
6. Afpipettér 14 pi liposom prøve i kvartscuvette og indsæt ind i cellen holderen.
7. Tryk på start.
8. Tryk stopper efter ~ 20 - 30 opkøb.
9. Analyser de gennemsnitlige liposom diameter toppe optaget på histogrammet.

5. Nanopartikel Tracking Analyse (NTA)

1. Forbered en 500 ul, 0,1 uM liposomopløsning.
2. Skyl prøverummet med vand og ethanol.
3. Tør prøve rum med en fnugfri papirserviet.
4. Tænde laser strømkilden og computeren.
5. Levere 300 pi 0,1 uM liposom opløsning til prøven rum.
6. Åbn Temperaturkontrol og Nanopartikel Tracking Analyse software.
7. Tryk Optag knappen for at tænde laseren.
8. Anvender de vandrette og lodrette justering at bevæge objektbordet og justere mikroskopet fokuseret.
9. Indstil den ønskede temperatur (20 ° C) og optagelsestid (mindst 30 sekunder).
10. Tryk på knappen Optag for at tage flere billedrammer af liposompartikler for et bestemt beløb af tid. Analysere toppe svarende til diameteren liposom størrelser på histogrammet, som det følger bevægelsen af ​​hver partikel.

6. Repræsentative resultater

En ordning skitserer ekstruderingsmetoden er psenterede i figur 1. At opnå optimale resultater, fremstilling af liposomer med en diameter på 30 nm kræver et højt tryk på ~ 500 psi og diametre på 100 nm kræver et tryk på 125 psi til opnåelse af en hurtig filter hastighed. For en diameter på 400 nm, er et lavt tryk på ~ 25 psi anbefales for at opnå en langsommere filter hastighed, der tillader vesiklerne til at forlænges og danne store, homogene liposomer. Vi har gennemført en række eksperimenter for at bestemme det optimale tryk for at producere ensartede sub-micron vesikler størrelser. Vi varieres trykket samt det antal ekstrudering passerer gennem polycarbonatfiltre med porestørrelser på 30, 100 og 400 nm, og opdagede passende tryk for hver ønsket størrelse. For 30 nm porer, vil trykket under 500 psi reducere strømningshastigheden, forårsager forlængelse og dermed større vesikel størrelser. For 100 nm porer, blev en lind strøm opnået på 125 psi. Til 400 nm porer tillader lavt tryk (25 psi) vesiklerne til at forlænges i større vesikel shar speciale. En langsom drop-wise filtrering flow er optimalt at skabe større sub-micron vesikler ^13.

Vi udførte DLS at bestemme liposomstørrelser ekstruderet gennem tre forskellige diametre størrelser, dvs 30, 100 og 400 nm. DLS er en etableret metode, der indsamler spredt lys til at bestemme partikeldiameter. Vi ekstruderede hydratiserede liposomer med 2 mM gennem et polycarbonat 30 nm membranen ved 500 psi med 5 passerer gennem filteret pore, et 100 nm polycarbonatmembran på 125 psi med 5 passerer gennem filteret pore og en 400 nm polycarbonatmembran på 25 psi med 2 passerer gennem filteret pore. Diametrene af liposomerne og målt ved DLS i 30, 100 og 400 nm pore-størrelse var 66 ± 28, 138 ± 18 og 360 ± 25 nm (fig. 2). En suspension af 50 nm polystyrenperler blev anvendt som en kalibreringsstandard, som vist i figur 2, hvor den registreres en diameter på 47 ± 16 nm. Den procentiske polydispersity viser, at der ikke er nogen overlapning inden liposom størrelser. Det er typisk at iagttage diametre større end 30 nm ved anvendelse af DLS-analyse på grund af kendte forspændingen dette instrument til større partikler ^12. Lysspredningsegenskaber intensiteter fra store og små partikler opsamles samtidig fra en påvisningsfremgangsmåde og således vanskeligere at løse liposomer i suspension ^12. På trods af denne instrumental begrænsning, beskriver kalibreringskurven en næsten lineær sammenhæng.

NTA er en ny teknologi, der måler størrelsen af ​​hver partikel i direkte observationer af diffusion i et flydende medium, uafhængigt af partikel brydningsindekset eller densitet. Dette høj opløsning teknik kan anvendes til at supplere måling af liposomer med DLS. NTA registrerede diametre på 95 ± 48 og 356 ± 51 nm to 100 nm og 400 nm polystyren opløsninger blev anvendt til kalibrering. Lipidopløsninger til 30 nm og 100 nm blev observeret at have en mere comp markafgrøder diameter i forhold til de DLS som vist i figur 3, der producerer gennemsnitlige størrelser på 29 ± 14, 95 ± 17 og 359 ± 73 nm. NTA kan være en mere generel beskrivelse teknik til kvantificering mikroskopiske partikler, idet dens følsomhed gør det muligt at måle partikler af 50 - 1000 nm. Kalibreringskurven viser en lineær sammenhæng mellem polycarbonat membranporerne kontra det optagne NTA diameter.

Liposomstørrelser	Detektionsgrænsen	Forventet Minimum Partikelstørrelse (nm)
30 nm	11	30
100 nm	11	100
400 nm	21	400

Tabel 1. NanoSight Parametre.

ad/4151/4151fig1.jpg "/>
Figur 1. Rutediagram over ekstruderingsmetoden og beskriver, hvordan trykket og nitrogenstrømmen styrer homogeniteten af forskellige liposom diametre. Efter liposom hydratisering, er unilamellare vesikler med forskellige størrelser ekstruderet gennem forskellige polycarbonatmembranfilter porer ved forskellige tryk.

Figur 2. Dynamisk lysspredning (DLS) data, der beskriver de kvantitative liposom størrelser efter ekstrudering. (A) Søjlediagrammer er vist at beskrive diametrene af de tre liposom prøver. En kalibreringsstandard 50 nm polystyren (PS) perler blev anvendt som en reference. De gennemsnitlige liposom diametre er angivet ovenfor for søjle for hver prøve. X-aksen beskriver porestørrelser i hvilke opløsningerne blev ekstruderet gennem. Y-aksen beskriver diameter optaget af DLS. Skønt de 30 nm og 100 nm størrelser optageED-værdier højere end deres porestørrelser, medens den større 400 nm størrelse registreres en lidt mindre størrelse, kalibreringskurven (b) viser en næsten lineær korrelation, hvor x-aksen udtrykker polycarbonatmembran porestørrelser, og y-aksen beskriver registreres liposom diameter af DLS.

Figur 3. Nanopartiklers tracking analyse (NTA) data, der beskriver de liposom størrelser efter ekstrudering. (A) søjlegrafer repræsenterer diameteren af ​​hver liposom prøve. X-aksen beskriver porestørrelser i hvilke opløsningerne blev ekstruderet gennem. Y-aksen beskriver størrelsen diameter registreret af NTA. De gennemsnitlige liposom diametre er mærket over hver prøve. (B) NTA Kalibreringskurven viser en mere lineær korrelation end DLS kalibreringskurven mellem filtermembranen porestørrelserne versus registreres diameter. X-aksen beskriver polycarbonatmembran porestørrelser. Y-aksen beskriver optagne liposomet diameter NTA.

Figur 4. Negative plet transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder, der viser hver liposomstørrelse (500 uM), efterfulgt af ekstrudering. Carbon Formvar trådnet var negativt udledt før prøven farvning, hvor 1% uranylacetat i vand blev anvendt til farvning af prøver før tørring og billeddannelse ved 34 tusind gange forstørrelse. Størrelser 30, 100 og 400 nm er klart adskilt fra hinanden. Forstørrelsen blev sat til 25.000 x. Målestokken er 0,5 um.

Figur 5. En tidsforløbet forsøg blev udført med tre liposomstørrelser. Dynamisk lysspredning (DLS) blev målt for hver liposom opløsning umiddelbart efter ekstrudering. Alle liposom opløsninger blev opbevaret ved 4 °C natten over. Deres diametre blev registreret ved DLS efter en inkubation natten over. Lidt eller ingen ændring blev observeret efter en 16 timers inkubationsperiode.

Discussion

Ved hjælp af Avestin Liposofast LF-50 ekstruder, vi vist, hvordan lille størrelse, er syntetiske liposomer fremstillet ved en tryk-styret system. Det er vigtigt at bemærke, at multilamellare vesikler dannes spontant efter liposom hydratisering, hvilket kan føre til produktion af små nanopartikler. Disse små multilamellare vesikler vil uundgåeligt strømme gennem det større polycarbonatmembran porestørrelse, hvilket heterogenitet i opløsninger af unilamellare vesikler fremstillet af et stort filter pore. Derfor anbefales det at reducere nitrogenstrømmen trykket når store porestørrelser, anvendes (dvs. 25 psi til 400 nm diameter porer, som beskrevet ovenfor) for at give lipiderne tilstrækkelig tid til at smelte og aflange i større vesikler, øge homogeniteten af opløsningen. For liposomer med en diameter på under 100 nm og højt tryk (dvs. 400-500 psi i 30 og 100 nm som beskrevet ovenfor) anvendes til hurtig ekstrudering for at øge lipid indeslutningseffektivitetog størrelse homogenitet.

Nogle få bemærkelsesværdige trin anbefales at sikre en nøjagtig, reproducerbar liposompræparat. Det er bedst at fremstille vesikler med minimale volumen af ​​3,0 ml prøve til ekstrudering under anvendelse af den beskrevne fremgangsmåde. Prøver med lipid koncentrationer over 2 mM vil kræve højere nitrogentryk på> 500 psi i diameter <100 nm, som skal udføres med forsigtighed i betragtning, at et sådant tryk er over den instrumentale øvre grænse. En anbefaling af gentagne passager (5 ~ 7 gentagelser) gennem ekstruderen filteret vil forbedre vesikel løsning homogenitet. Brug af hætteglas og sprøjter for prøveforberedelse vil forhindre enhver udvaskning fra polypropylen-rør, der kunne forurene liposom prøven. Det er også kritisk at filtrere de resulterende liposomer for at fjerne eventuelle resterende støvpartikler.

I den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, har vi anvendt to metoder til at karakterisere liposom størrelser, namEly DLS og NTA. Begge teknikker viste en næsten lineær korrelation mellem de porestørrelserne versus faktiske observerede liposomet diameter. Ikke desto mindre bør man huske på, at en statistisk signifikant, men uvæsentlige heterogenitet af lipidvesikler blev observeret med begge karakteriseringsmetoder. Sammenfattende har vi beskrevet en velkontrolleret fremgangsmåde til fremstilling af nano-størrelse syntetiske liposomer med høj konsistens og effektivitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter