Summary
이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질 준비
Abstract
Liposomes는 광범위하게 단백질 - 단백질과 단백질 - 지질 상호 작용 3, 모니터 약물 전달 4,5, 그리고 캡슐 4 공부하는 플랫폼을 흉내낸 세포막로 사용되는 천연 및 합성 phospholipids로 이루어진 인위적으로 준비 vesicles 있습니다. Phospholipids 자연스럽게 마이셀에서 자신을 구별, 곡선 지질 bilayers을 작성 6. Liposomes은 전통적으로 bilayers, 즉 대형 unilamellar vesicles (LUVs), 작은 unilamellar vesicles (포드 SUV 차량용) 및 multilamellar vesicles (MLVs) 7의 크기와 수에 의해 분류됩니다. 특히, 다양한 크기의 균질 liposomes의 준비는 엔도와 exocytosis, 멤브레인 융합, 그리고 단백질 밀매 8, 세포 신호 전달에 중요한 역할을 막 곡률을 공부하는 것이 중요합니다. 400 - 여러 그룹은 단백질이 막 곡률을 포함하기 때문에 직경의 liposomes 준비 과정 <100 조절하는 데 사용되는 방법 분석세포의 기능 3 자신의 행위를 파악하고 NM. 기타 차량에 관심 9 마약을 운반하고 전달로 liposomes을 공부하고, 리포좀은 마약 캡슐에 초점. 리포좀 형성 9시 보고된으로 약물 캡슐이 형성될 수 있습니다. 우리 압출 단계는 두 가지 이유로 캡슐화된 약물에 영향을 미치지 않습니다, 즉 (1) 약물 캡슐이 단계 이전에 달성되어야하고 (2) liposomes 안전 수성 코어에서 마약을 운반, 그들의 자연적인 biophysical 안정성을 유지한다. 이러한 연구 목표는 더욱 안정적인 서브 마이크론 지질 vesicles을 설계하기위한 최적의 방법에 대한 필요성을 제안합니다.
그럼에도 불구하고, 현재 리포좀 준비 기술 (sonication 10, 냉동 및 해동 10, 침전)이 biophysical를 제한 높은 일관성 및 효율성 10,5와 높은 곡면 (예 : 직경 <100 nm의)에 liposomes의 준비를 허용하지 않습니다 emergi의 연구막 곡률 감지의 NG 분야. 여기, 우리는 생물 학적 관련 liposomes 다양한위한 강력한 준비 방법을 제시한다.
가스 기밀 주사기와 폴리 카보 네이트 점막 10,5를 사용하여 수동 압출은 일반적인 관행이지만 구멍 크기가 적용된 매뉴얼의 압력 변화로 인해로 인해 <100 nm의 사용시 이질이 자주 관찰된다. 우리는 직경 30 nm의 400 사이의 범위 합성 liposomes를 준비하는 일정한 압력 제어 압출 장치를 채용. 동적 광 산란 (DL을) 10, 전자 현미경 11 nanoparticle 추적 분석 (NTA) 12 우리의 프로토콜에 설명된대로 상용 폴리스티렌 (PS) 교정 표준으로 사용되는 구슬과 함께 리포좀 크기를 계량하는 데 사용되었다. 근처의 선형 상관 관계는 우리의 압력 제어 리포좀 준비 높은 충실도를 나타내는업자 기공 크기와 실험적으로 결정 liposomes 사이에 관찰 충족되었다석탄통. 더 나아가, 우리는이 지질 소포 준비 방법은 여러 가지 리포좀 크기의 독립, 일반적으로 적용하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 우리는 또한 최대 16 시간 동안이 준비된 liposomes 안정 것을 시간 코스 연구에서 증명하고있다. 대표적인 나노 크기의 리포좀 준비 프로토콜은 다음과 시연한다.
Protocol
1. 리포좀 준비
- 테플론 늘어선 모자와 함께 20 ML의 유리관을 검색합니다.
- 오염을 방지하기 위해 사용하는 사전 클로로포름 모든 유리 제품과 주사기를 청소합니다.
- 250 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 유리관에 시약 등급의 클로로포름 100 μL를 전송합니다.
- 100 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 동일한 유리관에 시약 등급의 메탄올 30 μL를 추가합니다.
- phosphatidylethanolamine (교황) : 2 MM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC) 준비하려면 콜레스테롤 지질 솔루션을, 11 밀리그램 / ML 10 밀리그램 / ML 교황과 20 μL의 μL 10 밀리그램 / ML POPC, 42의 216 μL를 전송 20 ML의 유리관에 CHCl 3 콜레스테롤 솔루션.
- lipids의 박막은 유리병의 바닥에서 발견된 때까지 느린 흐름 아르곤 또는 질소 가스를 사용하는 유기 용제를 증발.
- 잔류 용매를 제거하려면 최소 30 분 동안 진공 건조기에서 uncapped 유리관를 놓습니다.
- TR버퍼의 ansfer이 ML은 이전에 하이드 레이트 lipids를로 유리관에, 0.2 미크론 필터를 통과했다.
- ° C에서 하룻밤 4에 혼합 부화하고 48 시간 이내에 사용합니다.
2. 냉동 및 해동 : 30의 리포좀 크기 - 100 nm의 전용
- 15 초동안 액체 질소의 리포좀 정지 고정.
- 42에서 가열 블록을 사용하여 리포좀 서스펜션을 녹여 ° ~ 3 분정도 C의 온도.
- 5 사이클 총 단계 2.1 및 2.2를 반복합니다.
3. 밀어냄
정확하게 그들의 가이드북에서 악기 개요를 사용 Liposofast LF-50 압출기를 조립하는 Avestin 지침을 따릅니다.
- 지원 필터 자료의 대형 홀 지원 화면 (원형 구멍이있는) 장소, 원형 소결 접시 (구멍없이) 한 배수 디스크 (직경 25 ㎜), 하나의 폴리 카보 네이트 막 (직경 25 ㎜)으로 따라갔다.
- 작고 검은 놓으십시오지원 필터 기지로 확보하기 멤브레인 위에 O-링.
- 4 해당 구멍에 4 개의 나사를 조이고으로 가기 필터 압출기을 첨부합니다.
- 대형 압출기 배럴 아래로 필터 압출기 유닛을 조립. 실린더 배럴로 리포좀 솔루션을 추가합니다. 순서 압출 배럴 위에 다음을 추가하십시오 대형 원형 O-링, 좁은 모자, 큰 원형 O-링, 둥근 모자.
- 압출기 배럴 위쪽에 가스 레귤레이터를 부착하여 압력 릴리프 밸브를 포함한 공기 누출을 방지하기 위해 모든 밸브를 닫습니다. 20 ML의 유리관 또는 압출기 필터 유닛 이하 50 ML Erlenmeyer 플라스크를 놓습니다. 안전 밸브 조절기에 연결되어 있고 압력이 600 PSI를 초과하는 경우에 공개할 것입니다. 질소 가스를 켜고 압출기에 연결된 가스 밸브를 엽니다.
- 질소 압력이 400 나노미터 liposomes, 100 나노미터 liposomes을위한 125 PSI, 30 나노미터 liposomes 용 400-500 PSI 25 PSI로 늘립니다.
- 리포좀 susp 조심질소에 의해 강요되는 동안 ension 그것은 용기에 배출로. 더 이상 유리관에 압출기 필터를 통해 액체 전달을 관찰 않을 때까지 질소가 흐르는 유지.
4. 동적 라이트 산란 (DL을) 분석
- 20 μm의 리포좀 용액의 50 μL를 준비합니다.
- 전원 및 램프 소스를 켭니다.
- DynaPro 소프트웨어를 엽니다.
- 30 nm의 100 nm의와> 100 나노미터 liposomes을 감지하는 알고리즘 MS800 모델의 liposomes를 검색하는 MS / X 알고리즘 모델에 소프트웨어를 설정합니다.
- 하드웨어에 연결합니다.
- 셀 홀더에 석영 cuvette 및 삽입 리포좀 샘플의 Pipet 14 μL.
- 시작을 누릅니다.
- 30 인수 - ~ 20 이후에 중지를 누르십시오.
- 히스토그램에 기록된 평균 리포좀 직경 봉우리를 분석합니다.
5. Nanoparticle 추적 분석 (NTA)
- 500 μL, 0.1 μm의의 리포좀을 준비솔루션입니다.
- 물과 에탄올과 샘플 격실을 씻어.
- 보푸라기가없는 종이 타월로 샘플 격실을 건조합니다.
- 레이저 전원과 컴퓨터를 켭니다.
- 샘플 구획에 0.1 μm의 리포좀 용액 300 μL를 제공합니다.
- 온도 제어 및 Nanoparticle 추적 분석 소프트웨어를 엽니다.
- 레이저를 설정 버튼을 캡처 누르십시오.
- 무대를 이동하고 현미경의 초점을 조정하기 위해 수평 및 수직 조정을 사용합니다.
- 원하는 온도 (20 ° C)와 녹화 시간 (최소 30 초)로 설정합니다.
- 시간의 지정된 금액에 대한 리포좀 입자의 여러 그림 프레임을 데리고 녹음 버튼을 누릅니다. 그것이 각 입자의 움직임을 추적으로 히스토그램의 직경 리포좀 크기에 해당하는 봉우리를 분석.
6. 대표 결과
압출 방법을 요약 스키마 P입니다그림 1에서 높았다. , 최적의 결과를 얻을 수 30 nm의의 직경과 liposomes의 준비는 ~ 500 PSI 및 100 nm의 직경의 높은 압력을 필요로하는 것은 빠른 필터 속도를 달성하기위한 125 PSI의 압력이 필요합니다. 400 nm의 직경을 보려면 ~ 25 PSI의 낮은 압력 vesicles가 크고 균질 liposomes을 길어지다 및 형성 있도록 느린 필터 율을, 달성하는 것이 좋습니다. 우리는 일관성있는 서브 마이크론 소포 크기를 생산을위한 최적의 압력을 결정하기 위해 일련의 실험을 실시 하였다. 우리는 압력뿐만 아니라 압출은 기공 크기 30, 100, 400 nm의 폴리 카보 네이트와 필터를 통과의 수를 다양하고 각각의 원하는 크기에 적절한 압력을 발견했다. 30 나노미터 모공의 경우, 500 PSI 아래의 압력은 신장 때문에 큰 소포 크기를 초래, 유속이 줄어 듭니다. 100 나노미터 모공의 경우 지속적인 흐름이 125 PSI에 달성되었다. 400 나노미터 모공의 경우, 낮은 압력 (25 PSI)는 vesicles가 큰 소포의로 길어지다하실 수 있습니다izes. 느린 드롭 현명한 여과 유량이 큰 서브 마이크론 vesicles 13 만들 최적입니다.
우리는 세 가지 직경의 크기, 즉 30, 100 400 nm의를 통해 압출 리포좀 크기를 결정하기 위해 DL을 수행했습니다. DL을이 입자 직경을 결정하기 위해 흩어져 빛을 수집 설립 방법입니다. 필터 구멍을 통해 오 패스 2 25 PSI에서 400 nm의 폴리 카보 네이트 막과 125 PSI에서 100 nm의 폴리 카보 네이트 멤브레인, 필터 기공을 통해 오 패스 500 PSI에 폴리 카보 네이트 30 nm의 막 통해 2 mm의 우리는 압출 충분 liposomes 필터 구멍을 통해 전달합니다. 30, 100 400 nm의 기공 크기 liposomes와 DL을 기준으로 측정의 직경 66 줄 ± 28, 138 ± 18 360 ± 25 nm의 (그림 2). 그것이 47 ± 16 nm의 직경을 기록한 그림 2와 같이 50 나노미터 폴리스티렌 구슬의 정지 보정 표준으로 사용되었다. 퍼센트 polydispersity은 리포좀 크기 사이에는 중복이 없다는 것을 보여줍니다. 그것은이 악기가 큰 입자를 12으로 가지고 알려진 편견으로 인해 DL을 분석을 사용할 때 30 nm의 이상의 직경을 관찰하는 것이 일반적입니다. 크고 작은 입자의 빛 산란 강도는 서스펜션 12 liposomes를 해결하는 하나의 검출 방법에서 동시에 수집하기 때문에 어렵습니다. 이 기악 제한에도 불구하고, 교정 곡선은 가까운 선형 상관 관계에 대해 설명합니다.
NTA는 입자 굴절률이나 밀도 독립 액체 매질에서 확산의 직접적인 관찰에서 각 입자의 크기를 측정하는 새로운 기술입니다. 이것은 고해상도 기술은 DL을 가진 liposomes의 측정을 보완하는 데 사용할 수 있습니다. NTA는 교정에 사용되었다 직경 95 ± 48 356 ± 51 nm의 두 100 nm의 400 나노미터 폴리스티렌 솔루션을 기록했다. 30 nm의 100 nm의의 지질 솔루션은 더 검색을 가지고 관찰되었다 등 29 평균 크기는 ± 14, 95 ± 17, 359 ± 73 nm의 생산을, 그림 3에 표시된 DL을 비교한 경작할 직경. 1000 NM - NTA는 감도가 50의 입자를 측정할 수 있기 때문에 미세한 입자를 계량하기위한보다 일반적인 특성화 기법이 될 수 있습니다. 교정 곡선은 녹화된 NTA 직경 대 폴리 카보 네이트 멤브레인 모공 사이에 선형 상관 관계를 보여줍니다.
| 리포좀의 크기 | 감지 임계값 | 예상 최소 입자 크기 (NM) |
| 30 nm의 | 11 | 30 |
| 100 nm의 | 11 | 100 |
| 400 nm의 | 21 | 400 |
표 1. Nanosight 매개 변수.
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그림 1. 설명 압출 방식의 플로우 차트, 어떻게 압력과 질소 유량은 다른 리포좀 지름의 균질성을 제어합니다. 리포좀 수화에 따라 다양한 크기의 unilamellar vesicles 다른 압력에서 다른 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터 모공을 통해 압출 있습니다.
그림 2. 압출에 따라 양적 리포좀 크기를 설명하는 동적 라이트 산란 (DL을) 데이터. () 막대 그래프는 세 리포좀 샘플의 직경을 설명하기 위해 표시됩니다. 50 나노미터 폴리스티렌 (PS) 구슬의 보정 기준은 참고 자료로 사용되었다. 평균 리포좀 지름은 각 샘플에 대한 막대 위에 표시됩니다. x 축은 솔루션을 통해 압출 있었다 그중 기공 크기를 설명합니다. y 축은 DL을 녹음한 직경에 대해 설명합니다. 비록 30 nm의 100 nm의 크기 레코드더 큰 400 nm의 크기가 약간 낮은 크기를 기록하면서 에드는 자신의 기공 크기보다 높은 가치, 교정 곡선 (B)는 X-축은 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공 크기를 표현 근처 선형 상관 관계를 보여주고, y 축은 설명 DL을하여 리포좀 직경을 기록했다.
압출 다음 리포좀 크기를 설명하는 그림 3. Nanoparticle 추적 분석 (NTA) 데이터. () 막대 그래프는 각 리포좀 시료의 직경을 나타냅니다. x 축은 솔루션을 통해 압출 있었다 그중 기공 크기를 설명합니다. y 축은 NTA에 의해 기록된 크기의 직경을 설명합니다. 평균 리포좀 지름은 각 샘플 위에 분류됩니다. (B) NTA 교정 곡선은 기록 직경 대 필터 멤브레인 기공 크기 사이에 DL을 교정 곡선보다 더 선형 상관 관계를 보여줍니다. x 축은 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공 크기를 설명. y 축은 NTA에 의해 기록된 리포좀 직경에 대해 설명합니다.
그림 4. 압출 다음 각 리포좀의 크기 (500 μm의)를 보여주는 부정적 얼룩 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지. 물에 1 % Uranyl 아세트산 전에 34,000 × 확대 건조 및 이미징에 샘플을 착색하는 데 사용된 곳을 탄소 Formvar 메쉬 격자는 부정, 샘플 염색법 이전에 퇴원했다. 크기 30, 100, 400 nm의은 분명히 서로 별개입니다. 배율은 25,000 ×로 설정되었다. 눈금 막대는 0.5 μm의를 나타냅니다.
그림 5. 시간 코스 실험은 세 리포좀 크기와 함께 실시되었다. 동적 광 산란 (DL을)이 각각 리포좀 용액 후 즉시 압출을위한 측정되었다. 모든 리포좀 솔루션은 4에 저장된 °C 하룻밤. 그들의 지름은 하룻밤 배양 후 DL을하여 기록되었다. 아니 변화에 리틀은 16 시간 잠복기 후에 관찰되었다.
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Discussion
Avestin Liposofast LF-50 압출기를 사용하여, 우리는 얼마나 작은 크기, 합성 liposomes는 압력 제어 시스템을 통해 준비가되어 보여주었다. 그것은 multilamellar vesicles 작은 nanoparticles의 생산으로 이어질 수 리포좀 보습, 따라 자발적으로 형성 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 작은 multilamellar vesicles은 필연적으로 대형 필터 기공 제작한 unilamellar vesicles의 솔루션에 이질의 원인, 대형 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공의 크기를 통해 흐를 것이다. 따라서, 그것의 균질성 향상, 큰 기공 크기는 lipids에게 융합과 큰 vesicles로 길어지다 충분한 시간을주기 위해 (위의 설명에 400 nm의 직경 모공을위한 즉, 25 PSI)를 사용하는 경우 질소 흐름의 압력을 줄일 것을 권장합니다 솔루션입니다. <100 nm의, 고압 (위에서 설명된 바와 같이 30과 100 nm의에 대한 즉, 400-500의 PSI)의 직경과 liposomes 들어 지질 트래핑 효율을 높이기 위해 빠른 압출에 대해 적용됩니다그리고 크기 균질성.
몇 가지 주목할만한 단계는 정확하고 재현성 리포좀 준비를하도록 권장합니다. 그것은 설명한 방법을 사용하여 압출을위한 시료의 3.0 ML의 최소 볼륨과 vesicles을 준비하는 것이 좋습니다. 2 밀리미터 이상 지질 농도와 샘플은 직경에 대한> 500 PSI의 높은 질소 압력 <100 nm의, 그러한 압력 수단 상한 넘어 고려하여 신중하게 실시해야 필요합니다. 압출기 필터를 통해 반복적인 패스의 추천 (5 ~ 7 reiterations)는 소포 솔루션 균질성 향상됩니다. 샘플 준비를 위해 유리 튜브와 주사기를 사용하여 리포좀 샘플을 오염시킬 수있는 폴리 프로필렌 튜브로부터 침출을 방지합니다. 그것은 또한 모든 가능한 잔여 먼지 입자를 제거하는 결과 liposomes를 필터링하는 것이 중요합니다.
위에서 설명한 방법에서 우리는 리포좀 크기 남구을 특성화하기 위해 두 가지 방법을 고용했습니다엘리 DL을하고 NTA. 두 기술은 실제 관찰된 리포좀 직경 대 기공 크기 사이에 가까운 선형 상관 관계를 보여주었다. 그럼에도 불구하고, 하나는 지질 vesicles의 통계적으로 의미하지만, 실체가 이질이 특성화 방법을 모두 사용하여 관찰한 것을 명심한다. 요약에서 우리는 높은 일관성과 효율성을 가진 나노 크기의 합성 liposomes을 생산 잘 제어 방법을 설명했습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) 공동 혁신 수상에 의해 지원되었다. 램 시그널링 및 건강 교육 기금의 셀룰러 규정 국립 연구소 (T32 GM008759)와 NIH 루스 L. Kirschstein 사전 박사 연구원 (CA165349-01)에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 소중한 의견 교수 마이클 스토 웰 (CU 볼더), 교수 더글러스 말하지 그래과 교수 롭 필립스 (Caltech)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
References
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