Konstant tryck kontrollerad Extrusion metod för framställning av Nano-storlek lipidvesiklar

Summary

Detta protokoll beskriver en extruderingsmetod för framställning lipidvesiklar av sub-mikron storlek med en hög grad av homogenitet. Denna metod använder en tryckstyrd system med kontrollerad takt kväveflöde i liposomberedningen. Lipiden beredning

Abstract

Liposomer är artificiellt framställda vesikler bestående av naturliga och syntetiska fosfolipider som ofta används som ett cellmembran härma plattform för att studera protein-protein och protein-lipid interaktioner ³ monitor drug delivery ^4,5, och inkapsling ^4. Fosfolipider skapar naturligt böjda lipidbiskikt, skilja sig från en micell. ⁶ Liposomer traditionellt klassificeras efter storlek och antal biskikt, dvs stora unilamellära vesiklar (LUV), små unilamellära vesiklar (SUV) och multilamellära vesiklar (MLV) ^7. I synnerhet är framställningen av homogena liposomer av olika storlekar viktigt för att studera membran krökning som spelar en viktig roll i cell signalering, endo-och exocytos, membran fusion, och protein människohandel ^8. Flera grupper analysera hur proteiner används för att modulera processer som involverar membranet krökning och därmed förbereda liposomer med en diameter <100 - 400NM att studera deras beteende på cellfunktioner ^3. Andra är inriktade på liposomer-drug inkapsling, studerar liposomer som fordon att bära och leverera ett läkemedel av intresse ^9. Drug inkapsling kan uppnås som redovisas under liposombildning ^9. Vår extrudering steg bör inte påverka det inkapslade läkemedlet av två skäl, bör alltså (1) läkemedel inkapsling uppnås före detta steg och (2) liposomer bör behålla sin naturliga biofysiska stabilitet, säkert bär läkemedlet i den vattenhaltiga kärnan. Dessa forskningsmål föreslår vidare behovet av en optimerad metod för att utforma stabila submikrona lipidvesiklar.

Icke desto mindre tillåter de nuvarande liposomberedningen teknik (sonikering ^10, frys-och-tö ^10, sedimentering) inte framställning av liposomer med höggradigt krökt yta (dvs. diameter <100 nm) med hög konsistens och effektivitet ^10,5, vilket begränsar den biofysiska studier av en emerging inom avkänning membran krökning. Häri presenterar vi en stark framställningsmetod för en mängd olika biologiskt relevanta liposomer.

Manuell extrudering med gastäta sprutor och polykarbonat membran ^10,5 är en vanlig metod, men heterogenitet ofta observeras vid användning av porstorlekar <100 nm på grund av på grund av variationer av manuell applicerat tryck. Vi använde en konstant tryck-styrda strängsprutningsapparat för att framställa syntetiska liposomer vars diametrar varierar mellan 30 och 400 nm. Dynamisk ljusspridning (DLS) ^10, elektronmikroskopi ¹¹ och nanopartiklar spårning analys (NTA) ¹² användes för att kvantifiera de liposomstorlekar som beskrivs i vår protokollet, med kommersiell polystyren (PS) pärlor används som en kalibreringsstandard. En nästan linjär korrelation observerades mellan de använda porstorlekar och de experimentellt bestämda liposomer, vilket indikerar hög fidelitet av vår tryckstyrd liposomberedningen uppfylldaHod. Vidare har vi visat att denna lipidvesikel framställningsmetod är allmänt tillämpbar oberoende av olika liposomstorlekar. Slutligen har vi visat också i en tidsförloppsstudie att dessa framställda liposomerna var stabila i upp till 16 timmar. Ett representativt nano-storlek liposomberedningen protokollet visas nedan.

Protocol

1. Liposomberedning

1. Hämta en 20 ml glasflaska med en Teflon-fodrad mössa.
2. Rengöra alla glasvaror och sprutor med kloroform före användning för att förhindra kontaminering.
3. Överför 100 | il av reagenskvalitet kloroform till glasvial med användning av en 250 | il lufttät glasspruta.
4. Tillsätt 30 pl av metanol av reagenskvalitet till samma glasvial med användning av en 100 | il lufttät glasspruta.
5. För att framställa en 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatidylkolin (POPC): fosfatidyletanolamin (POPE): kolesterol lipidlösning, överför 216 pl av 10 mg / ml POPC, 42 | il av 10 mg / ml Pope och 20 | il av 11 mg / ml kolesterol lösningar i CHCl ₃ till 20 ml glasflaska.
6. Indunsta de organiska lösningsmedlen med användning långsam strömning argon eller kvävgas tills en tunn film av lipider observeras på botten av flaskan.
7. Placera den icke-kåpförsedda glasflaska i en vakuumexsickator under minst 30 minuter för avlägsnande av kvarvarande lösningsmedel.
8. Transfer 2 ml buffert, som dessförinnan matats genom en 0,2 mikron filter, till glasflaska för att hydratisera de lipider.
9. Inkubera blandningen vid 4 ° C över natten och används inom 48 timmar.

2. Frys-och upptining: För liposomstorlekar på 30 - 100 nm Endast

1. Frysa liposomsuspension i flytande kväve under 15 sekunder.
2. Tina liposomsuspension med en värmeblock vid 42 ° C temperatur under ~ 3 min.
3. Upprepa steg 2.1 och 2,2 för totalt 5 cykler.

3. Strängsprutning

Följ Avestin instruktionerna att korrekt sätta ihop Liposofast LF-50 extruder, använder instrumentet beskriver i sina guidebok.

1. Placera den stora bildskärmen hålet stöd (med cirkulära hål) i den bärande filtret bas, följt av den cirkulära sintrade skålen (utan hål), en kollektor skiva (25 mm i diameter), och en polykarbonat-membran (25 mm i diameter).
2. Placera den lilla svartaO-ringen på toppen av membranet för att fästa den till bäraren filterbasen.
3. Fäst den övre filtret extrudern genom att dra 4 skruvar i de 4 motsvarande hål.
4. Montera filtret strängsprutenheten med undersidan av stora sprutmaskincylindern. Tillsätt liposomlösningen till cylinderröret. Placera följande ovanpå strängsprutning cylindern i ordning: stor cirkulär O-ring, smal locket, stor cirkulär O-ring, cirkulär kåpa.
5. Fäst gasregulator att extrudercylindern övre och stänga alla ventiler för att förhindra luftläckage, inklusive tryckavlastningsventilen. Placera en 20 ml glasampull eller 50 ml Erlenmeyer-kolv under extrudern filterenheten. En säkerhetsventil är ansluten till regulatorn och kommer att släppa om trycket överskrider 600 psi. Slå på kvävgas och öppna gasventilen ansluten till extrudern.
6. Öka kvävetryck till 25 psi under 400 nm liposomer, 125 psi till 100 nm liposomer och 400-500 psi under 30 nm-liposomer.
7. Titta på liposomen Suspension som matar in i behållaren medan den trycks av kväve. Håll kvävgasflöde tills du inte längre observera någon vätska som passerar genom extrudern filtret i glasflaska.

4. Dynamisk ljusspridning (DLS) Analys

1. Framställ 50 | il av en 20 pM liposomlösningen.
2. Slå på strömkällan och lampan källan.
3. Öppna Dynapro mjukvara.
4. Ställ in programvara för MS / X algoritmen modell för att upptäcka liposomer med 30 nm och 100 nm och MS800 algoritmen modell för att upptäcka> 100 nm liposomer.
5. Anslut till hårdvaran.
6. Pipettera 14 pl av liposomens prov i kvartskyvett och sätt in i cellen hållaren.
7. Tryck på start.
8. Tryck slutar efter ca 20 - 30 förvärv.
9. Analysera den genomsnittliga liposomstorleken diameter toppar registreras i histogrammet.

5. Nanopartiklar Tracking Analysis (NTA)

1. Förbered en 500 pl, 0,1 M liposomenlösning.
2. Skölj provsektionen med vatten och etanol.
3. Torka provet utrymmet med en luddfri pappershandduk.
4. Aktivera lasern kraftkälla och datorn.
5. Leverera 300 | il av 0,1 | iM liposomlösning till provsektionen.
6. Öppna temperaturkontroll och nanopartiklar Tracking analysprogram.
7. Tryck Capture-knappen för att slå på lasern.
8. Använda de horisontella och vertikala justeringar att förflytta steget och justera mikroskopets fokus.
9. Ställa in den önskade temperaturen (20 ° C) och intervall (under minst 30 sekunder).
10. Tryck på inspelningsknappen för att ta flera bildrutor av liposompartiklar för en angiven tid. Analysera de toppar som motsvarar diametern liposomstorlekar på histogrammet som spårar rörelsen av varje partikel.

6. Representativa resultat

Ett system som beskriver extrudering metod är prepresenterat i figur 1. För att erhålla optimala resultat, beredning av liposomer med en diameter av 30 nm kräver ett högt tryck av ~ 500 psi och diametrar av 100 nm kräver ett tryck av 125 psi för att uppnå en snabb filtret hastighet. För diametrar 400 nm, är ett lågt tryck på ~ 25 psi rekommenderas för att uppnå en långsammare filter takt, vilket gör att blåsor för att förlänga och bilda större, homogena liposomer. Vi har genomfört en serie experiment för att bestämma den optimala trycket för att producera konsekventa submikrona vesikel storlekar. Vi varieras trycket såväl som antalet strängsprutning passerar genom polykarbonatfilter med porstorlekar av 30, 100 och 400 nm, och upptäckt lämpligt tryck i varje önskad storlek. Under 30 nm porer, kommer trycket under 500 psi reducera flödeshastigheten, vilket orsakar töjning och således större storlekar vesikel. För 100 nm porer, var en jämn ström uppnås på 125 psi. För 400 nm porer, tillåter lågt tryck (25 psi) i vesiklarna för att förlänga in större vesikel strycksätter. En långsam droppvis filtrering flödet är optimalt att skapa större sub-micron vesiklar ^13.

Vi utförde DLS för att bestämma de liposomstorlekar extruderade genom tre olika diameterstorlekar, 30 dvs, 100 och 400 nm. DLS är en etablerad metod, som samlar ljus som sprids för att bestämma partikeldiametern. Vi extruderade hydratiserade liposomer med 2 mm genom en polykarbonat 30 nm membran vid 500 psi med 5 passerar genom filtrets porstorlek; en 100 nm polykarbonat-membran vid 125 psi med 5 passerar genom filtrets porstorlek och en 400 nm polykarbonatmembran vid 25 psi med 2 passerar genom filtrets porstorlek. Diametrarna hos liposomerna och uppmätta genom DLS för 30, 100 och 400 nm porstorlek var 66 ± 28, 138 ± 18 och 360 ± 25 nm (fig 2). En suspension av 50 pärlor nm polystyren användes som en kalibreringsstandard som visas i figur 2, där den spelat in en diameter på 47 ± 16 nm. Den procentuella polydispersity visar att det finns någon överlappning inom liposomstorlekar. Det är typiskt att observera diameter högre än 30 nm vid användning av DLS analysen på grund av det kända fördomar detta instrument har gentemot större partiklar ^12. Ljusspridnings intensiteter från stora och små partiklar uppsamlas samtidigt från en detektionsmetod och sålunda svårare att lösa liposomer i suspensionen ^12. Trots denna instrumentella begränsning beskriver kalibreringskurvan en nära linjär korrelation.

NTA är en ny teknik som mäter storleken på varje partikel från direkta observationer av diffusion i ett flytande medium, som är oberoende av partikel brytningsindex eller densitet. Denna högupplösande teknik kan användas för att komplettera mätning av liposomer med DLS. NTA registrerade diameter på 95 ± 48 och 356 ± 51 nm, två 100 nm och 400 nm lösningar av polystyren användes för kalibrering. Lipidlösningar av 30 nm och 100 nm observerades ha en mer komp odlingsbar diameter i förhållande till DLS såsom visas i figur 3, som producerar genomsnittliga storlekar av 29 ± 14, 95 ± 17 och 359 ± 73 nm. NTA kan vara en mer allmän karakterisering teknik för att kvantifiera mikroskopiska partiklar eftersom dess känslighet gör det möjligt att mäta partiklar av 50 - 1000 nm. Kalibreringskurvan visar en linjär korrelation mellan polykarbonatmembranfilter porerna kontra den inspelade NTA diameter.

Liposomstorlekar	Detekteringströskel	Förväntas minsta partikelstorlek (nm)
30 nm	11	30
100 nm	11	100
400 nm	21	400

Tabell 1. NanoSight parametrar.

ad/4151/4151fig1.jpg "/>
Figur 1. Flödesschema för strängsprutning metod, som beskriver hur trycket och kväveflödet styr homogenitet olika liposom diametrar. Efter liposom hydratisering, unilamellära vesiklar av olika storlekar strängsprutas genom olika polykarbonatmembranfilter porer vid olika tryck.

Figur 2. Dynamisk ljusspridning (DLS) data som beskriver de kvantitativa liposomstorlekar efter strängsprutning. (A) Stapeldiagram visas för att beskriva diametrarna hos de tre proverna liposom. En kalibreringsstandard av 50 (PS) nm polystyrenpärlor användes som en referens. De genomsnittliga diametrarna liposom indikeras ovanför stapeln för varje prov. X-axeln beskriver porstorlekar av vilka lösningarna extruderades genom. Y-axeln beskriver diametern registreras genom DLS. Även om 30 nm och 100 nm storlekar rekordred värden högre än deras porstorlekar medan den större 400 nm storlek registrerades en något lägre storlek, visar kalibreringskurvan (b) en nära linjär korrelation, där x-axeln uttrycker polykarbonat storlekar membranporstorleken, och y-axeln beskriver registreras liposom diametern genom DLS.

Figur 3. Nanopartiklar spårning analys (NTA) data som beskriver liposomstorlekar efter extrudering. (A) stapeldiagram representerar diametern hos varje liposom prov. X-axeln beskriver porstorlekar av vilka lösningarna extruderades genom. Y-axeln beskriver storleken diametern registreras av NTA. De genomsnittliga diametrarna liposom är märkta ovanför varje prov. (B) NTA kalibreringskurva visar en mer linjär korrelation än DLS kalibreringskurvan mellan filterstorlekar membranporstorleken kontra den inspelade diameter. X-axeln beskriver polykarbonat storlekarna membranporstorleken. Y-axeln beskriver den inspelade liposomen en diameter av NTA.

Figur 4. Negativ färg transmissionselektronmikroskopi (TEM) bild som visar varje liposomstorlek (500 pM), följt av strängsprutning. Kol Formvar mesh galler negativt utmatas före provet färgning, där 1% uranylacetat i vatten användes för att färga prover före torkning och avbildning vid 34 tusen gångers förstoring. Storlek 30, 100 och 400 nm är klart skilda från varandra. Förstoringen var inställd till 25.000 ×. Skalan stapeln representerar 0,5 pm.

Figur 5. En tidsförloppet experiment utfördes med tre liposomstorlekar. Dynamisk ljusspridning (DLS) mättes för varje liposom lösning omedelbart efter strängsprutning. Alla liposom lösningarna lagrades i 4 °C över natten. Deras diametrar registrerades genom DLS efter en inkubation över natten. Liten eller ingen förändring observerades efter en 16-timmars inkubationsperiod.

Discussion

Använda Avestin Liposofast LF-50 Extruder visade vi hur liten storlek, är syntetiska liposomer genom en tryck-styrt system. Det är viktigt att notera att multilamellära vesiklar bildas spontant efter liposom hydratisering, vilket kan leda till produktion av mindre nanopartiklar. Dessa små multilamellära vesiklar kommer oundvikligen att strömma genom den större polykarbonatmembranet porstorlek, vilket orsakar ojämnhet i lösningar av unilamellära vesiklar framställda genom en stor filtrets porstorlek. Därför är det rekommenderat att reducera trycket kväveflöde när stora porstorlekar används (dvs 25 psi under 400 nm i diameter porer såsom beskrivits ovan) för att ge de lipider tillräcklig tid för att smälta och långsträckta i större vesiklar, mer homogen lösningen. För liposomer med en diameter av <100 nm, högt tryck (dvs. 400-500 psi i 30 och 100 nm som beskrivits ovan) används för en snabb extrudering att öka effektiviteten lipid fångstoch storlek homogenitet.

Några anmärkningsvärda steg rekommenderas för att säkerställa korrekt och reproducerbar liposomberedning. Det är bäst att framställa vesiklar med minsta volym av 3,0 ml av prov för strängsprutning med användning av den beskrivna metoden. Prover med lipid koncentrationer över 2 mM kommer att kräva högre kvävetryck av> 500 psi för diametrar <100 nm, som bör genomföras med försiktighet med tanke på att ett sådant tryck är bortom instrumentella övre gränsen. En rekommendation av repetitiva pass (5 ~ 7 upprepningar) genom extrudern filtret kommer att förbättra homogeniteten vesikeln lösningen. Använda glasflaskor och sprutor för provberedning kommer förhindra läckage från polypropenrör som skulle kunna förorena liposomen provet. Det är även kritiskt att filtrera de resulterande liposomerna för att avlägsna eventuella kvarvarande dammpartiklar.

I metoden som beskrivits ovan, har vi använt två metoder för att karakterisera liposomstorlekar, namEly DLS och NTA. Båda teknikerna visade en nästan linjär korrelation mellan porstorlekarna kontra den faktiska observerade liposomen diameter. Icke desto mindre bör man ha i åtanke att en statistiskt signifikant, men obetydlig heterogenitet lipidvesiklar observerades med båda metoder för karakterisering. Sammanfattningsvis har vi beskrivit en väl kontrollerad metod för att producera nano-storlek syntetiska liposomer med hög konsistens och effektivitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter