同所性膀胱腫瘍モデルと膀胱内Sarnaの治療の評価

Summary

超音波検査および生物発光イメージングによる膀胱内に配達Sarnaのとモニタリング腫瘍成長の抗腫瘍効果を評価するために同所性膀胱腫瘍モデルを確立します。

Abstract

私たちは、同所移植マウス膀胱腫瘍モデルでは膀胱内に配達小さな活性化RNA（Sarnaの）と膀胱癌を治療するための新たな手法を提案する。マウスモデルは、吸入全身麻酔下に尿道カテーテル法によって確立されます。化学熱傷は、その後膀胱グリコサミノグリカン層を破壊するために膀胱内の硝酸銀溶液を用いた膀胱粘膜に導入され、細胞が付着することを可能にします。滅菌水で数回洗浄後、ヒト膀胱癌KU-7-luc2-GFP細胞は2時間に住むために膀胱にカテーテルを通して注入されています。膀胱腫瘍のその後の成長は 、in vivo膀胱超音波および生物発光イメージングによって確認され、監視されています。腫瘍はその後脂質ナノ粒子（LNPs）に策定Sarnaので膀胱内に処理されます。腫瘍の成長は、超音波検査および生物発光で監視されています。この手順のすべてのステップは、添付のビデオで実証されています。

Protocol

動物を対象とする手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物実験及び利用委員会（IACUC）によって承認されています。

1。細胞調製

1. ヒト膀胱癌細胞株KU-7-luc2-GFP（キャリパーライフサイエンス、ホプキントン、MA）は、10％ウシ胎児血清、50μg/ mlのゲンタマイシンを含むRPMI-1640培地で栽培されています。
2. 培養は37℃で維持され、メディアと5％CO _2は、2〜3日ごとに変わります。
3. 細胞は、トリプシン消化により回収し、血球計算板を用いてカウントした。 50μlの2×10 ⁶細胞の単一細胞懸濁液は、リン酸塩で調製した緩衝生理食塩水と氷上で保存する。

2。同所性膀胱腫瘍モデル

1. 8月10日週齢雌ヌード（NU / NU）マウス（シモンセン研究所Gilory、CA）を使用した。
2. 提供するために加温パッド上に滅菌ドレープを配置SA外科的プラットフォームを提供します。無菌の潤滑ゼリー、スタイレット針、硝酸銀溶液、および滅菌水で24-guageカテーテルが用意されています。
3. 一般的な麻酔薬は、吸入イソフルラン（誘導のために3％、メンテナンスのために1-2％）とノーズコーンを介して維持したままマウスで誘導される。無菌眼軟膏は、動物の目に適用され、熱パッドは体温を維持するために使用されています。
4. 仰臥位でマウスを置きます。
5. 穏やかに安定化のための鉗子で、動物の外陰部を把握する。
6. 削除針スタイレット24-guage静脈カテーテルを使用して、マウスの尿道にカテーテルを挿入されています。十分な潤滑を使用する必要があります。マウスの仰臥位で、尿道は外陰部のひだと膣の前方にすぐに後方に位置しています。 45度の角度は、最初は恥骨の下にある尿道をカニューレを挿入し、合格するために取られます。より浅い角度は、膀胱に尿道を通過する取得されます。穏やかな骨盤の圧力尿道がしばしば助けることができるまっすぐにしてください。注意これは尿道や膀胱穿孔につながることができますので、抵抗に対してあまりにもハードにプッシュしないように注意する必要があります。カテーテル内に見られる尿は、膀胱内腔の位置を確認します。
7. スタイレット針を用いてカテーテルや膀胱内腔から尿を吸引します。スタイレット針を所定の位置にカテーテルを残し、後続のすべての願望と注射のために使用されます。これは、カテーテル内のデッドスペースをなくすことで正確な量の注入を可能にし、それが繰り返されるカテーテル挿入が不要になります。
8. 膀胱尿路上皮のグリコサミノグリカン層を損なうために、0.5 M硝酸銀の10μLを注入し、10秒間滞留を許可されている。これは、残りの尿と白色沈殿物を形成することがあります。
9. スタイレット針を用いて沈殿物、膀胱内容を吸引して廃棄します。
10. 100μLの滅菌水を注入して膀胱を洗浄します。水を吸引して廃棄します。 REPE4回洗浄の合計滅菌水で洗浄3回。
11. カテーテル抜去の準備のために尿道を閉塞するために尿道口の周りに4から0絹のネクタイを配置します。
12. 注入する前にスタイレット針を用いて50μLで2×10 ⁶ KU-7-luc2-GFP細胞を用意しました。
13. 同時に絹のネクタイで閉塞尿道を残して、カテーテルとスタイレット針を削除します。
14. 絹のネクタイが削除され、動物が起こされる前に、マウスが2時間全身麻酔下で維持されます。

3。超音波検査

1. 全身麻酔は、ノーズコーンを介して気化したイソフルラン維持で誘導されています。
2. RMV-704 40 MHzのプローブを用いたin vivoで VisualSonics VEVO 770高解像度マイクロイメージングシステム（VisualSonics株式会社、トロント、オンタリオ、カナダ）を用いた。
3. 超音波プラットフォーム上で仰臥位にマウスを置きます。
4. 動物の後ろ足を確保するテープで超音波プローブの操作中に過剰な運動を避けることができます。
5. マウスの骨盤に超音波ゲルを適用します。
6. 横または縦の画像を得るために、マウスの骨盤の上にRMV-704（40 MHz）の超音波プローブを下げます。
7. 腫瘍が見つかった場合、画像は、腫瘍の大きさの測定のために保存することができます。

4。生物発光イメージング

1. 200μLの腹腔内注射（150 mg / kg）のルシフェリン基質を実行します。
2. イソフルラン気化して全身麻酔を誘導し、ノーズコーンを介して維持されます。
3. 生物発光イメージャー内に仰臥位にマウスを置きます。
4. ルシフェリン投与5分後には、1秒当たりの光子の動物から生物発光を測定します。

5。 Sarnaの準備

1. 50から100マイクロモルのスケールでのRNAオリゴヌクレオチドを​​合成する。
2. 私は、相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを​​アニールNTO二重saRNAs。
3. [1,3]ジオキソラン（DLinKC2-DMA）、disteroylphosphatidylコリン、コレステロール、PEG-DMG - 脂質ナノ粒子（LNP） - Sarnaのは、イオン性脂質1,2 - dilinoleyl -4 - （ - ジメチルアミノエチル2）で用意されて前述のように自発的ベシクル形成の定式化プロシージャを使用して^1。

6。配合Sarnaのの膀胱内投与

1. 同所性膀胱腫瘍モデルを確立した後、マウスは脂質ナノ粒子（LNPs）（ 表1）で定式化膀胱内小活性化RNA（Sarnaの）で処理されています。
2. 一般的な麻酔薬が確立し、維持イソフルラン気化して、無菌眼科用潤滑剤が適用されています。
3. 仰臥位で動物を配置します。
4. 前述のように尿道カテーテルを実行します。
5. 尿道とカテーテルの周囲に4から0絹のネクタイを配置します。
6. カテーテルからすべての尿を吸引除去し、空のシリンジとスタイレット針を用いて膀胱。
7. 50μL（3 mg / kg）の総線量のために膀胱内にLNP-Sarnaのを注入します。同時に絹のネクタイで閉塞尿道を残して、カテーテルとスタイレット針を削除します。
8. マウスは2時間閉塞尿道麻酔のままになります。
9. 膀胱LNP-Sarnaのによる治療は、腫瘍移植後4日目に開始されました。マウスは、14回、合計3日ごとに、連続的に処理した。

7。代表的な結果

KU-7-luc2-GFP細胞に由来する膀胱腫瘍は、ルシフェラーゼの生物発光イメージング（ 図1AおよびC）と膀胱の超音波（ 図1BおよびD）で監視することができます。腫瘍は、しばしば細胞接種後3-5日以内に検出されています。我々は、マウスの90％以上の成功した膀胱腫瘍の移植を見つけました。膀胱dsRNAは治療が続いて起こるように、腫瘍の進行は、wiを監視することができますこれらのモダリティ番目。動物が犠牲にされた後、腫瘍の成長はまた、GFPの蛍光を用いて確認することができます。一般に、 図の1C及び1Dに視覚的に見られるように膀胱腫瘍の平均超音波の寸法との相関生物を意味する。動物を屠殺し、腫瘍はGFPによって確認された後、しかし、我々は、生物発光が超音波測定はよりも実行可能な腫瘍の存在とより密接に相関した。処置したマウスにおける残留瘢痕組織は、しばしば超音波による可視化であったが、ライブの腫瘍と区別することができませんでしたので、これはSarnaの（ようにコントロールするのではなく）で処理したマウスの間で特に明らかであった。

図1：膀胱腫瘍の腫瘍増殖動態。 （A）生物発光イメージングは​​、それらの位置と成長を確認するために膀胱腫瘍内のルシフェラーゼ活性を測定します。 （B） 生体内膀胱ultrasoun でD 40MHzのプローブを使用すると、その寸法を正確に測定することができる腫瘍の画像を生成します。 （C）グラフは、生物発光と超音波の次元で腫瘍の漸進的増加を示す。 6匹の動物から- （標準偏差+ / - ）の測定値は平均値を表しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

我々は、転写活性化にp21の^{CIP1/WAF1（P21）}のプロモーターを標的とLNP策定Sarnaの腫瘍の膀胱内治療に続いてマウス同所性異種移植膀胱腫瘍モデルの確立のためのプロトコルを提示します^。2、3の結果、腫瘍ができる生物発光イメージングと膀胱の超音波で確認し、監視されます。同所性モデルは、より密接に内因性の膀胱癌を近似している尿や尿路上皮の環境を提供することにより、腹腔内、皮下、または静脈内モデルよりも優れている可能性があります。同所性マウス膀胱腫瘍の様々な両方の直接膀胱壁の注入だけでなく、膀胱内注入を使用して確立されています。腫瘍の^4月8日膀胱内注入が、ここで示したように、より密接に粘膜上皮に表面的に開始し、より深く成長するヒト膀胱腫瘍を模倣し彼らは進歩として。 BLADに対応するために、硝酸銀を用いた我々の方法腫瘍取り込みのためのDERを、安価で技術的に簡単です。

Hadaschik ら 、マウスで膀胱腫瘍の膀胱内注入を説明し、信頼性の高い発光腫瘍の評価が報告されました^。5我々は、同様にカテーテル挿入し、細胞注入で成功した腫瘍移植率の高さを発見しました。私達の腫瘍は、腫瘍の進行を定量化するための追加メソッドを提供するだけでなく、in vivoで膀胱の超音波での生物発光と確認されなかった。

このプロトコルでは、我々は、他人の手法にいくつかの変更に注意してください。我々は膀胱外グリコサミノグリカンの腫瘍細胞移植のための層の代わりに、電気焼灼器を破壊するために硝酸銀溶液の注入を採用しています。我々は、これはユーザー·エラーの可能性を最小限に抑え、安価で、シンプルかつ信頼性の高い方法であることがわかった。膀胱の超音波評価中に、我々は、尿道カテーテル挿入を実行する必要がなくなりましたあらかじめ。動物が麻酔を受ける前に排尿を引き起こすために重要な苦痛にさらされていない限り、マウスの膀胱は確実に優れた腫瘍の可視化を可能にするために撮像中に膨張しました。間違いなく、尿道カテーテルは、プロトコルの最も信頼性のステップでした。我々の経験では、無胸腺ヌードマウスのカテーテルは、C57マウスに比べて難しくなります。しかし、このプロトコルやビデオで説明する手法で、動物の90％以上を繰り返して腫瘍内注入と治療の両方に成功したカテーテルを挿入しました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KU-7-luc-GFP cells	Caliper Life Sciences	128091
thymic nude mice ( nu/nu)	Simonsen Laboratories	6-7 weeks old	Sim:(NCr) nu/nu fisol
Ultrasound unit	VisualSonics, inc.	Vevo 770	RMV-704 probe
Bioluminescence unit	Caliper Life Sciences	IVIS Spectrum
Exel safelet catheter	Fisher Scientific	14-841-21	24G X ¾"
Silver nitrate	Sigma-Aldrich	S8157
Hamilton syringe	Hamilton Co	80301
LNP-saRNA	Alnylam Pharmaceuticals
Table 1. Specific reagents and equipment.