Summary
Estabelecer um modelo de tumor de bexiga ortotópico para avaliar os efeitos antitumorais de sarna intravesical entregue e acompanhamento do crescimento tumoral por ultra-som e de imagem de bioluminescência.
Abstract
Apresentamos um novo método para o tratamento de cancro da bexiga com intravesical entregue pequena activador RNA (sarna) em um xenoenxerto modelo de rato ortotópico tumor da bexiga. O modelo do rato é estabelecido por cateterismo uretral sob anestesia geral inalatória. Queimadura química é então introduzido para a mucosa da bexiga usando solução de nitrato de prata intravesical para romper a camada de glicosaminoglicano bexiga e permite que as células para anexar. Após várias lavagens com água estéril, cancro da bexiga humana KU-7-luc2-GFP células são instilado através do cateter no interior da bexiga para habitar durante 2 horas. Subsequente crescimento de tumores de bexiga é confirmada e monitorado por ultra-som na bexiga vivo e de imagem de bioluminescência. Os tumores são então tratados com intravesical sarna formulados em nanopartículas de lípidos (LNPs). O crescimento do tumor é monitorizado com ultra-sons e bioluminescência. Todos os passos do presente processo são demonstradas no vídeo que o acompanha.
Protocol
Procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê de Uso (IACUC) da Universidade da Califórnia, em San Francisco.
1. Preparação de células
- A bexiga humana linha de células de cancro KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) é crescido em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 50 gentamicina ug / ml.
- As culturas são mantidas a 37 ° C, 5% de CO 2 com os meios de muda a cada dois a três dias.
- As células foram colhidas por digestão com tripsina e contadas utilizando um hemocitómetro. Uma única suspensão celular de 2 x 10 6 células em 50 ul foi preparada em solução salina tamponada com fosfato e mantido em gelo.
2. Modelo de tumor ortotópico de bexiga
- Fêmeas nu (nu / nu) ratinhos 8-10 semanas de idade (Simonsen Laboratory, Gilory, CA) foram usadas.
- Coloque um pano estéril sobre uma almofada de aquecimento para servir a umsa plataforma cirúrgica. Estéril lubrificante geleia, 24-Guage cateteres com agulhas estilete, solução de nitrato de prata, e água estéril, que são preparados.
- Anestésico geral é induzida nos ratinhos com isoflurano inalado (3% para a indução, 1-2% para manutenção) e mantida através nosecone. Pomada oftálmica estéril é aplicada para os olhos do animal, e uma almofada de calor é utilizado para manter o calor do corpo.
- Posicione o mouse na posição supina.
- Suavemente agarrar vulva do animal com uma pinça, para estabilização.
- Utilizando um cateter 24-guage intravenosa com o estilete agulha removido, a uretra do rato é cateterizada. Lubrificação amplo deve ser usado. Com o supino do mouse, a uretra está localizado imediatamente posterior às pregas vulvares e anterior à vagina. Um ângulo de 45 graus é inicialmente tomadas a fim de canular a uretra e passar por baixo do osso púbico. Um ângulo de mais superficial é então levado a passar através da uretra para a bexiga. Suaves pres pélvicosCertifique-se de endireitar a uretra muitas vezes podem ajudar. Cuidados devem ser tomados para evitar empurrar demasiado duro contra a resistência, pois isso pode levar à perfuração da uretra ou bexiga. Urina visto dentro do cateter confirma a sua localização no interior do lúmen da bexiga.
- Aspirar a urina a partir do lúmen do cateter e da bexiga usando a agulha estilete. A agulha estilete é usado para todas as aspirações subsequentes e injecções, deixando o cateter no lugar. Isto permite a injecção de volumes precisos, eliminando o espaço morto dentro do cateter, e faz cateterismos repetidas desnecessária.
- Para prejudicar a camada de glicosaminoglicano do urotélio da bexiga, 10 ul de 0,5 M de nitrato de prata é injectado e deixou-se habitar durante 10 segundos. Isto pode formar um precipitado branco com urina restante.
- Aspirar e descartar o conteúdo precipitar e bexiga usando uma agulha de estilete.
- Lave a bexiga através da injeção de água 100 uL estéril. Aspirar e descarte a água. Repeem lavagem com água estéril 3 vezes para um total de 4 lavagens.
- Coloque uma gravata de seda 4-0 ao redor do meato uretral para ocluir a uretra na preparação para a remoção do cateter.
- Injectar previamente preparado 2 x 10 6 KU-7-GFP-luc2 células em 50 uL utilizando a agulha de estilete.
- Simultaneamente remover o cateter ea agulha estilete, deixando a uretra ocluída pelo laço de seda.
- O rato será mantida sob anestesia geral, durante 2 horas antes do laço de seda é removido eo animal é acordado.
3. Ultra-som
- Anestesia geral foi induzida com isoflurano vaporizado e mantida através de cone do nariz.
- A VisualSonics Vevo 770 In Vivo de Alta Resolução Micro-Imaging System (VisualSonics Inc, Toronto, Ontário, Canadá) com a RMV-704 sonda de 40 MHz foi utilizado.
- Posicione o mouse na posição supina na plataforma ultra-som.
- Proteger as patas traseiras do animalcom fita para evitar o movimento excesso durante a manipulação da sonda de ultra-som.
- Aplique o gel de ultra-som à pelve mouse.
- Baixa um RMV-704 sonda de ultra-som (40 MHz) para a bacia do mouse para obter imagens transversais ou longitudinais.
- Se o tumor for encontrado, as imagens podem ser salvas para a medição das dimensões do tumor.
4. Bioluminescent imagem
- Executar a injecção intraperitoneal de 200 uL (150 mg / kg) substrato luciferina.
- Induzir anestesia geral com isoflurano vaporizado e manter através de cone do nariz.
- Coloque ratos em decúbito dorsal no imager bioluminescência.
- Cinco minutos após a injecção luciferina, medir a bioluminescência a partir do animal em fotões por segundo.
5. Preparação sarna
- Sintetizar RNA oligonucleotídeos em uma escala de 50-100 mmol.
- Recozer complementares de um único oligonucleótidos de cadeia isaRNAs nto duplex.
- Lipid nanopartícula-(LNP)-sarna são preparados com o lípido ionizável 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimetilaminoetil) - [1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl colina, colesterol, e PEG-DMG usando uma espontânea de vesículas procedimento de formulação de formação, como descrito anteriormente. 1
6. Administração intravesical de sarna Formulado
- Depois de estabelecer o modelo de tumor ortotópico bexiga, os ratos são tratados com intravesical pequena activador RNA (sarna) formulada em nanopartículas de lípidos (LNPs) (Tabela 1).
- Anestésico geral é estabelecido e mantido com vaporizado isoflurano, e lubrificante oftálmica estéril é aplicado.
- Coloque o animal em decúbito dorsal.
- Realizar cateterismo uretral como descrito anteriormente.
- Coloque uma gravata de seda 4-0 ao redor da uretra e do cateter.
- Aspirar toda a urina a partir do cateter ebexiga usando uma seringa e agulha vazio estilete.
- Injectar LNP-sarna intravesical para uma dose total de 50 uL (3 mg / kg). Simultaneamente remover o cateter ea agulha estilete, deixando a uretra ocluída pelo laço de seda.
- O rato permanecerá anestesiados com a uretra ocluída durante 2 horas.
- O tratamento com intravesical LNP-sarna foi iniciado no dia 4 após a implantação do tumor. Os ratinhos foram tratados em série, cada 3 dias, para um total de 14 tratamentos.
7. Os resultados representativos
Tumores da bexiga decorrentes KU-7-luc2-GFP células pode ser monitorizada por luciferase bioluminescente de imagem (Figura 1A e C) e de ultra-som da bexiga (Figura 1B e D). Os tumores são frequentemente detectável dentro de 3-5 dias após a inoculação das células. Encontramos a implantação do tumor de bexiga com sucesso em mais de 90% dos ratos. Como o tratamento com ARNdc intravesical se segue, a progressão do tumor pode ser monitorizada wiº destas modalidades. Depois de o animal é sacrificado, o crescimento do tumor pode também ser confirmada utilizando GFP de fluorescência. Em geral, a média de bioluminescência correlacionada com dimensões de ultra-som médios para os tumores da bexiga, como visto visualmente nas Figuras 1C e 1D. No entanto, depois de os animais foram sacrificados e tumor foi confirmada por GFP, verificou-se que a bioluminescência correlacionada mais estreitamente com a presença de tumor viáveis do que as medições de ultra-som. Isto foi especialmente aparente entre ratinhos tratados com sarna (em oposição aos controlos), porque o tecido da cicatriz residual em ratinhos tratados era muitas vezes visualizadas por ultra-sons, mas não podia ser diferenciado do tumor ao vivo.
Figura 1. Cinética de crescimento de tumor de tumores da bexiga. (A) de imagem bioluminescência mede a actividade da luciferase em tumores da bexiga para confirmar a sua localização e crescimento. (B) In vivo ultrasoun bexigad usando uma sonda de 40MHz produz imagens tumorais, cujas dimensões podem ser medidos com precisão. (C) Os gráficos ilustrando aumento progressivo do tumor em dimensões de bioluminescência e ultra-som. Os valores representam a média (+ / - desvio padrão) medições a partir de 6 animais. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Apresenta um protocolo para o estabelecimento de um modelo ortotópico xenoenxerto rato tumor da bexiga, seguido de tratamento intravesical dos tumores com LNP sarna formulado que tem como alvo o promotor de p21 CIP1/WAF1 (p21) para a activação transcricional. 2, 3 Os tumores resultantes podem ser confirmada e monitorados com exames de imagem de bioluminescência e ultra-som da bexiga. Modelos ortotópicos pode ser superior à intraperitoneal, subcutânea ou intravenosa os modelos, fornecendo um meio de urina e urotélio que mais se aproxima o cancro da bexiga endógena. Uma variedade de tumores da bexiga ortotópicos rato foram estabelecidas utilizando tanto a injecção directa de parede da bexiga, bem como a instilação intravesical. 4-8 instilação intravesical de tumor, como demonstrado aqui, mais imita tumores de bexiga humana que começam superficialmente no epitélio da mucosa e crescer mais profunda à medida que progridem. O nosso método de utilização de nitrato de prata para acomodar bladders para captação de tumor é barato e tecnicamente simples.
Hadaschik et al. Descrito instilação intravesical de tumores de bexiga em ratos e relatados avaliação confiável tumor bioluminescente. 5 Nós igualmente encontraram taxas elevadas de implantação do tumor sucesso com cateterização e instilação de células. Os nossos tumores não só foram confirmadas com bioluminescência, mas também com ultra-sons em bexiga in vivo, proporcionando um método adicional para quantificar a progressão do tumor.
Neste protocolo, notamos várias modificações à técnica dos outros. Foram utilizados instilação de solução de nitrato de prata para interromper a bexiga camada de glicosaminoglicano extracelular para o implante de células de tumor, em vez de electrocauterização. Descobrimos que este é um método barato, simples e confiável, que minimizou o potencial de erro do usuário. Durante a avaliação do ultra-som da bexiga, achamos desnecessário a realização de cateterismo uretralantemão. Enquanto o animal não tinha sido submetido a aflição significativa para causar a micção antes de ser submetido a anestesia, a bexiga ratinho foi distendido fiável durante o exame para permitir a visualização do tumor excelente. Sem dúvida, o cateterismo uretral foi a etapa menos confiável do protocolo. Em nossa experiência, cateterismo de atímicos camundongos nude é mais difícil do que em camundongos C57. No entanto, com a técnica descrita neste protocolo e vídeo, mais de 90% dos animais foram repetidamente cateterizada com sucesso para ambos instilação tumor e tratamento.
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Disclosures
LCL é um inventor chamado em pedidos de patentes pendentes relacionadas com a sarna que foram arquivados pela Universidade da Califórnia em San Francisco e licenciada para Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Esta pesquisa é financiada pelo Henry AACR Bexiga Shepard Cancer Research Grant (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
- Chen, Z. Antitumor effect of dsRNA-induced p21(WAF1/CIP1) gene activation in human bladder cancer cells. Molecular cancer therapeutics. 7, 698-703 (2008).
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