Summary
El establecimiento de un modelo de tumor de vejiga ortotópica para evaluar los efectos antitumorales de SARNA intravesical entrega y el control del crecimiento tumoral mediante ecografía y bioluminiscente.
Abstract
Se presenta un nuevo método para el tratamiento de cáncer de vejiga con intravesical entregado activación pequeño ARN (Sarna) en un modelo de xenoinjerto de tumor vesical ortotópico del ratón. El modelo de ratón se establece mediante cateterismo uretral por debajo inhalado anestesia general. Quemadura química se introduce entonces a la mucosa de la vejiga utilizando solución intravesical nitrato de plata para perturbar la capa de glicosaminoglicano vejiga y permite a las células para unir. Tras varios lavados con agua estéril, cáncer de vejiga humano KU-7-luc2-GFP células son inculcados a través del catéter en la vejiga para vivir durante 2 horas. Posterior crecimiento de los tumores de vejiga se confirma y monitoreado por ultrasonido de vejiga en vivo e imágenes bioluminiscentes. Los tumores se tratan a continuación intravesical con SARNA formulado en nanopartículas lipídicas (LNPs). El crecimiento del tumor se controla con el ultrasonido y la bioluminiscencia. Todos los pasos de este procedimiento se demuestra en el vídeo adjunto.
Protocol
Los procedimientos que implican temas de los animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC) de la Universidad de California en San Francisco.
1. Preparación de la célula
- El cáncer de vejiga humano línea de células KU-7-luc2-GFP (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) se cultiva en medio RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% y 50 gentamicina g / ml.
- Los cultivos se mantuvieron a 37 ° C, 5% de CO 2 con los medios cambia cada dos o tres días.
- Las células fueron cosechadas por digestión con tripsina y se contaron utilizando un hemocitómetro. Una suspensión de células individuales de 2 x 10 6 células en 50 l se preparó en tampón fosfato salino y se mantuvieron en hielo.
2. Vesical ortotópica modelo de tumor
- Femeninos desnudos (nu / nu) ratones 8-10 semanas de edad (Simonsen Laboratorio, Gilory, CA) fueron utilizados.
- Coloque un paño estéril sobre una almohadilla térmica para servir a unsa quirúrgica plataforma. Gel lubricante estéril, de 24 idiomáticas catéteres con agujas estilete, solución de nitrato de plata, y el agua estéril, se preparan.
- La anestesia general se induce en los ratones con isoflurano inhalado (3% para la inducción, 2.1% para el mantenimiento) y se mantiene a través de ojiva. Ungüento oftálmico estéril se aplica a los ojos del animal, y una almohadilla de calor se utiliza para mantener el calor del cuerpo.
- Sitúa el cursor en la posición supina.
- Agarre suavemente la vulva del animal con una pinza para la estabilización.
- El uso de un catéter intravenoso calibre 24 con el estilete de la aguja eliminado, la uretra del ratón se sondaje. Lubricación amplio debe ser utilizado. Con el ratón en posición supina, la uretra se encuentra inmediatamente por detrás de los pliegues de la vulva y anterior de la vagina. Un ángulo de 45 grados que se haya determinado inicialmente con el fin de canalizar la uretra y pasar por debajo del hueso púbico. Un ángulo más superficial se lleva luego a pasar a través de la uretra hasta la vejiga. Suave presión pélvicaAsegúrese de enderezar la uretra a menudo puede ayudar. Se debe tener cuidado de no empujar demasiado fuerte contra la resistencia, ya que esto puede conducir a la perforación uretral o vesical. La orina visto dentro del catéter confirma su ubicación dentro de la luz vesical.
- Aspirar la orina desde el lumen del catéter y de la vejiga con la aguja del estilete. La aguja del estilete se utiliza para todas las aspiraciones y las inyecciones posteriores, dejando el catéter en su lugar. Esto permite la inyección de volúmenes precisos, eliminando el espacio muerto-dentro del catéter, y hace que cateterizaciones repetidas innecesarias.
- Para poner en peligro la capa de glucosaminoglucano de la vejiga urotelio, 10 l de nitrato de plata 0,5 M se inyecta y se dejó que habitan durante 10 segundos. Esto puede formar un precipitado blanco con orina restante.
- Aspirar y desechar el contenido de precipitado y de la vejiga usando una aguja de estilete.
- Lave la vejiga mediante la inyección de 100 l de agua estéril. Aspirar y desechar el agua. Repea lavado con agua estéril 3 veces para un total de 4 lavados.
- Colocar una corbata de seda 4-0 alrededor del meato uretral para ocluir la uretra, en preparación para la retirada del catéter.
- Inyectar previamente preparado 2 x 10 6 KU-7-luc2-GFP células en 50 l usando la aguja estilete.
- Simultáneamente retirar el catéter y la aguja estilete, dejando la uretra ocluido por la corbata de seda.
- El ratón se mantendrá bajo anestesia general durante 2 horas antes de la corbata de seda se retira y el animal se despierta.
3. Ultrasonido
- La anestesia general se indujo con isoflurano vaporizado y se mantiene a través de cono de la nariz.
- Un VisualSonics Vevo 770 in vivo de alta resolución de Micro-Imaging System (VisualSonics Inc., Toronto, Ontario, Canadá) con la RMV-704 de la sonda de 40 MHz se usó.
- Sitúa el cursor en la posición supina sobre la plataforma de ultrasonido.
- Asegure las patas traseras del animalcon cinta para evitar un movimiento excesivo durante la manipulación de la sonda de ultrasonidos.
- Aplicar gel de ultrasonido de la pelvis del ratón.
- Baje un RMV-704 (40 MHz) sonda de ultrasonido en la pelvis del ratón para obtener imágenes transversales o longitudinales.
- Si se encuentra un tumor, las imágenes se pueden guardar para la medición de las dimensiones del tumor.
4. Bioluminiscente de imágenes
- Realizar la inyección intraperitoneal de 200 l (150 mg / kg) sustrato luciferina.
- Inducir la anestesia general con isoflurano vaporizado y mantener a través de cono de la nariz.
- Coloque los ratones en posición de decúbito supino en el reproductor de imágenes de bioluminiscencia.
- Cinco minutos después de la inyección luciferina, medir la bioluminiscencia del animal en fotones por segundo.
5. SARNA Preparación
- Sintetizar ARN oligonucleótidos a una escala de 50 a 100 mmol.
- Recocido complementarias oligonucleótidos de cadena sencilla into dúplex saRNAs.
- Lípidos nanopartículas (LNP)-SARNA se preparan con el lípido ionizable 1,2-dilinoleyl-4-(2 - dimetilaminoetil) - [1,3]-dioxolano (DLinKC2-DMA), disteroylphosphatidyl colina, colesterol, y PEG-DMG utilizando una formación espontánea de vesículas procedimiento de formulación que se describió anteriormente. 1
6. Administración intravesical de SARNA Formulado
- Después de establecer el modelo de tumor de vejiga ortotópica, los ratones son tratados con activador intravesical pequeño ARN (Sarna) formulado en nanopartículas lipídicas (LNPs) (Tabla 1).
- La anestesia general se establece y mantiene con isoflurano vaporizado, y lubricante oftálmico estéril se aplica.
- Colocar el animal en decúbito supino.
- Realizar un cateterismo uretral como se describió anteriormente.
- Coloque una corbata de seda 4-0 alrededor de la uretra y el catéter.
- Aspirar toda la orina desde el catéter yvejiga mediante una jeringa vacía y la aguja del estilete.
- Inyectar LNP-SARNA intravesicalmente para una dosis total de 50 l (3 mg / kg). Simultáneamente retirar el catéter y la aguja estilete, dejando la uretra ocluido por la corbata de seda.
- El ratón seguirá siendo anestesiados con la uretra ocluido durante 2 horas.
- El tratamiento con intravesical LNP-SARNA se inició el día 4 después de la implantación del tumor. Los ratones fueron tratados en serie, cada 3 días, para un total de 14 tratamientos.
7. Los resultados representativos
Los tumores de vejiga derivados de KU-7-luc2-GFP células pueden ser controlados por la luciferasa de imagen bioluminiscente (Figura 1A y C) y el ultrasonido vesical (Figura 1B y D). Los tumores suelen ser detectables dentro de 3-5 días después de la inoculación de células. Hemos encontrado éxito de la implantación del tumor de vejiga en más del 90% de los ratones. Como el tratamiento con dsRNA intravesical se produce, la progresión del tumor se puede controlar wiª de estas modalidades. Después de que el animal es sacrificado, el crecimiento del tumor también puede ser confirmado mediante la fluorescencia de GFP. En general, la media de bioluminiscencia correlacionada con dimensiones medias de ultrasonido tumores de vejiga, como se ve visualmente en las figuras 1C y 1D. Sin embargo, después los animales fueron sacrificados y el tumor fue confirmada por GFP, hemos encontrado que la bioluminiscencia correlaciona más estrechamente con la presencia de tumor viable que hizo mediciones de ultrasonido. Esto era especialmente evidente entre los ratones tratados con Sarna (en oposición a los controles) porque el tejido cicatricial residual en los ratones tratados fue visualizado por ultrasonido a menudo, pero no pudo ser diferenciada de tumor en vivo.
Figura 1. La cinética de crecimiento del tumor de los tumores de vejiga. (A) imágenes de bioluminiscencia mide la actividad de la luciferasa en los tumores de la vejiga para confirmar su ubicación y el crecimiento. (B) En ultrasoun vejiga in vivod utilizando una sonda de 40 MHz produce las imágenes del tumor cuyas dimensiones pueden ser medidos con precisión. (C) gráficos que ilustran aumento progresivo del tumor en las dimensiones de bioluminiscencia y el ultrasonido. Los valores representan la media (+ / - desviación estándar) de medición de 6 animales. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
Se presenta un protocolo para el establecimiento de un modelo de ratón del tumor vesical ortotópico xenoinjertos seguido por el tratamiento intravesical de los tumores con SARNA LNP formulado que se dirige el promotor de p21 CIP1/WAF1 (p21) para la activación transcripcional. 2, 3 Los tumores resultantes pueden ser confirmación y seguimiento con imágenes bioluminiscentes y la ecografía de vejiga. Modelos ortotópico puede ser superior a intraperitoneal, subcutánea, intravenosa o modelos, proporcionando un medio de orina y urotelio que se aproxima más cáncer de vejiga endógeno. Una gran variedad de tumores de ratón ortotópico de vejiga se han establecido con tanto de inyección directa de la pared vesical, así como la instilación. La instilación intravesical 4-8 de tumor, como se demuestra aquí, más se asemeja mucho a los tumores humanos de vejiga que comienzan superficialmente en el epitelio de la mucosa y se hacen más profundas a medida que progresan. Nuestro método de uso de nitrato de plata para acomodar bladDers para la captación del tumor es de bajo costo y técnicamente simple.
Hadaschik et al. Describe la instilación de los tumores de vejiga en ratones e informó de una evaluación fiable del tumor bioluminiscente. 5 mismo modo, encontró altas tasas de éxito de la implantación del tumor con el cateterismo y la instilación de células. Nuestros tumores no sólo se confirmaron con bioluminiscencia, sino también con ultrasonido en la vejiga in vivo, proporcionando un método adicional para cuantificar la progresión del tumor.
En este protocolo, observamos varias modificaciones a la técnica de los demás. Hemos empleado la instilación de solución de nitrato de plata para perturbar la capa de la vejiga glicosaminoglicano extracelular para la implantación de células tumorales, en lugar de electrocauterio. Hemos encontrado que este es un método barato, sencillo y fiable que minimiza la posibilidad de error del usuario. Durante la evaluación ecográfica de la vejiga, nos pareció que era necesario llevar a cabo el cateterismo uretralantemano. Mientras el animal no había sido sometido a una angustia significativa para provocar la micción antes de someterse a la anestesia, la vejiga estaba distendida con el ratón de forma fiable durante la exposición para permitir la visualización del tumor excelente. Sin lugar a dudas, el cateterismo uretral fue el paso por lo menos confiable del protocolo. En nuestra experiencia, la cateterización de ratones atímicos es más difícil que en los ratones C57. Sin embargo, con la técnica descrita en este protocolo y de vídeo, más del 90% de los animales fueron cateterizados en repetidas ocasiones con éxito, tanto para la instilación del tumor y el tratamiento.
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Disclosures
LCL es un inventor llamado de solicitudes de patentes pendientes relacionadas con SARNA que han sido presentadas por la Universidad de California en San Francisco y con licencia para Alnylam Pharmaceuticals.
Acknowledgments
Esta investigación está financiada por la AACR Henry Shepard cáncer de vejiga beca de investigación (09-60-30-LI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KU-7-luc-GFP cells | Caliper Life Sciences | 128091 | |
| thymic nude mice ( nu/nu) | Simonsen Laboratories | 6-7 weeks old | Sim:(NCr) nu/nu fisol |
| Ultrasound unit | VisualSonics, inc. | Vevo 770 | RMV-704 probe |
| Bioluminescence unit | Caliper Life Sciences | IVIS Spectrum | |
| Exel safelet catheter | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G X ¾" |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | S8157 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80301 | |
| LNP-saRNA | Alnylam Pharmaceuticals | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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- Li, L. C. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 17337-17342 (2006).
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