Summary
نقدم طريقة بسيطة لإنتاج أجهزة ميكروفلويديك قادرة على تطبيق شروط دينامية مماثلة لسلالات متميزة متعددة، دون الحاجة إلى غرفة نظيفة أو الطباعة الحجرية الناعمة.
Abstract
دراسة استجابات الخلية إلى التغيرات البيئية يفرض تحديات تجريبية كثيرة: الخلايا تحتاج إلى تصوير تحت الظروف المتغيرة، وغالبا بطريقة نسبية. وتستخدم بشكل روتيني لوحات Multiwell لمقارنة سلالات مختلفة أو خطوط الخلايا، ولكن تسمح سيطرة محدودة على ديناميات البيئة. أجهزة ميكروفلويديك، من ناحية أخرى، تسمح التحكم الديناميكي رائعة على الظروف المحيطة بها، ولكنه يمثل تحديا لصورة وتميز أكثر من سلالات قليلة فيها. نحن هنا وصف الأسلوب بسهولة وبسرعة تصنيع جهاز ميكروفلويديك قادرة على تطبيق الظروف المتغيرة بشكل حيوي إلى عدة سلالات الخميرة متميزة في قناة واحدة. تم تصميم الجهاز وتصنيعها من قبل وسائل بسيطة دون الحاجة إلى الطباعة الحجرية الناعمة. وتتكون من قناة تدفق على شكل Y تعلق على الطبقة الثانية إيواء microwells. توضع في microwells سلالات منفصلة، وتصويرها في ظل الظروف الدقيقة الحيوية نفسها. نحن التجريبيnstrate استخدام الجهاز لقياس ردود توطين البروتين لنبضات من التغييرات في المغذيات سلالات الخميرة مختلفة.
Introduction
رد فعل الخلايا باستمرار مع البيئة المتغيرة بشكل حيوي، عن طريق تغيير عملية الأيض لديهم، لمحة النسخي والوظائف الخلوية. لدراسة هذه الظواهر، وهناك حاجة إلى تحديد الطرق التي يمكن أن مثل هذه التغييرات. نوع واحد من قراءات لهذه الاستجابات هو التغيير في توطين عوامل الإجهاد ذات الصلة في النسخ استجابة للضغوط الغذائية.
وقد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك 1 إلى التلاعب حيوي الظروف البيئية إلى الخلايا 2-4. ما يقدمونه العديد من المزايا للتصوير الخلايا الحية: يمكن للبيئة من الخلايا تسيطر على وجه التحديد وبشكل حيوي تغيير؛ الخلايا يمكن أن تكون حية المصورة في جميع الأوقات، بما في ذلك خلال التلاعب في الظروف الخارجية، وهناك حاجة كميات ضئيلة كاشف. تصميم بسيط جدا لجهاز ميكروفلويديك، مما يسمح للاختلاف بين اثنين من الظروف، هو جهاز على شكل Y 2. نستخدم عادة على شكل Y الأجهزة ميكروفلويديك التي تسمحتطبيق التغيرات الدينامية إلى خلايا في القناة. نستخدم هذا الجهاز لمتابعة التغيرات توطين عوامل الإجهاد ذات الصلة الموسومة fluorescently النسخ في خلايا الخميرة. ونحن نتابع هذه التغييرات في إطار الظروف المتغيرة في مجال التغذية. على سبيل المثال، يمكننا توفير نبضة (أو سلسلة من النبضات) من الجلوكوز التي تحتوي على المتوسط في غضون فترة لا الجلوكوز المتوسطة، في القرار ألف الزمنية ناعم جدا. في كثير من الأحيان في مثل هذه التجارب، هو واحد المهتمين في مقارنة ردود سلالات مختلفة من الخلايا (على سبيل المثال، المسوخ مختلفة، أو العزلات البرية مختلفة). يقتصر قناة Y على شكل لسلالة واحدة في كل قناة - إذا تم استخدام أكثر من سلالة واحدة، وليس هناك طريقة بسيطة للتمييز بين السلالات. للتغلب على هذه، يمكن استخدام قنوات مختلفة. إذا كنا نريد تطبيق نفس الشروط على ديناميات سلالات متعددة، نود أن تجمع بين مفهوم Y-القناة مع قنوات متعددة. هناك نوعان من التحديات في تنفيذ هذا الحل: يمكن أن يكون من الصعب تطبيق رانه نفس الظروف في نفس الوقت لجميع القنوات، وليس هناك وجود قيود هندسية لعدد من القنوات Y-التي يمكن تركيبها في جهاز واحد. لذلك كنا نبحث عن وسيلة لعرض عدة سلالات في قناة واحدة تحت ظروف ديناميكية.
نحن هنا وصف جهاز ثنائي الطبقات ميكروفلويديك المعدة للسلالات متعددة التصوير في قناة واحدة في ظل الظروف الديناميكية نفسها. الطبقة السفلية تتكون من PDMS رقيقة مع صف من الثقوب. يتم إرفاق هذه الطبقة إلى ساترة الزجاج خلق الآبار التي سنقوم في وضع مختلف السلالات، والتمسك لهم كونكانافالين A على الزجاج. الطبقة الثانية عبارة عن جهاز على شكل Y ميكروفلويديك التي تم إنشاؤها باستخدام أسلوب لاصق شفاف 5. بعد وضع سلالات في الآبار يتم محاذاة بسرعة الطبقة الثانية والتي تعلق على أول واحد، وخلق قناة واحدة مع العديد من الآبار التي تحتوي على سلالات مختلفة. هذا الجهاز يسمح النهائي بعد عدة سلالات في قناة واحدة، حيث كلتتعرض سلالات لنفس الشروط في نفس الوقت بالضبط. ويمكن أن يتم تصميم عملية الإنتاج برمتها وعلى الفوق، وذلك باستخدام وسائل بسيطة، مع عدم وجود الطباعة الحجرية الناعمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنشاء ماجستير سكوتش الشريط 5
- رسم أو طباعة تخطيط متناهية المطلوب، لتوسيع نطاق، على الورق. في حالتنا تصميم يتكون من قنوات على شكل Y اثنين، كل 3 مم واسعة (الشكل 2).
- تغطية شريحة زجاجية مع طبقات من لاصق شفاف. فإن عدد طبقات تحديد ارتفاع لقناة (حوالي 60 ميكرون لكل طبقة). استخدمنا 3 طبقات لاصق شفاف.
- وضع تصميم تخطيط على سطح مستو. محاذاة الشريحة على نمط التصميم. قطع الشريط بعناية على الشريحة الزجاجية مع مشرط وفقا للتخطيط.
- إزالة لاصق شفاف من جميع مناطق شريحة زجاجية باستثناء تلك في تخطيط متناهية.
- ضع الشريحة في فرن التدفئة في C ° 65 لمدة 2-3 دقيقة. تنظيف بلطف مع الايثانول.
2. افتعال جهاز ميكروفلويديك PDMS
- خلط مكونات قاعدة وعلاج من PDMS على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. نستخدم 10:01نسبة إلى وكيل قاعدة المعالجة. صب حوالي 30 مل من خليط PDMS في طبق بتري إلى ارتفاع 0.5 سم ~. ديغا وPDMS في فراغ إذا لزم الأمر. غمر شريحة زجاجية في PDMS مع لاصق شفاف منقوشة مواجهة. وضع نمط بعد PDMS يمنع تشكيل فقاعات الهواء بين الشريحة وأسفل الطبق. علاج لمدة 48 ساعة في C ° 65، والتأكد من الطبق أفقيا باستخدام مستوى فقاعة.
- في جديد 90 مم طبق بتري صب 3 مل من مزيج PDMS، مما أدى إلى طبقة عميقة حول 0.5 مم. (إذا كان متوفرا تدور المغطي، يمكن استخدامه لهذه المرحلة).
- ديغا وكما هو الحال في علاج 2.1.
- خفض بلطف من الجهاز ميكروفلويديك إلى الحجم المطلوب مع مشرط. وسيتم وصف هذه الطبقة "طبقة تدفق".
- قطع قطعة ذات الحجم المماثل من PDMS طبقة رقيقة من طبق بيتري الثاني. وسيتم وصف هذه "الطبقة الآبار".
- استخدام الناخس خزعة بحجم مناسب (نحن نستخدم 1،2 مم ID) لكمة ثقوب للمداخل ومنافذ في طبقة التدفق. وضع طبقة الآبار على شريحة زجاجية سميكة على تخطيط وتصميم لكمة من الآبار، وذلك باستخدام 2 مم ID خزعة الناخس، بما يتماشى مع و microchannels على التخطيط.
- تنظيف كل من طبقات PDMS فضلا عن 24 ملم × 60 ساترة الزجاج ملم مع الايثانول. الهواء الجاف والحفاظ عليها نظيفة.
- البلازما علاج كل من ساترة الزجاج وطبقة PDMS الآبار باستخدام إما مطبوع البلازما القياسية (لغير عكوس الربط) أو المفاوض باليد كورونا 6 لارتباط عكسها. وضع بعناية طبقة الآبار على رأس ساترة للتسبب التصاق (الشكل 3). فرك بلطف من أي فقاعات الهواء (إذا لزم الأمر).
3. خلية التصوير التجربة
- تأكد من وجود وسائل الإعلام المطلوب جاهزا في الحقن المناسبة لتوصيل أنابيب بلاستيكية مرنة مع القطر الداخلي قدرها 0.02 "(Tygon) في مضخة الحقنة.
- تنمو S. سلالات خميرة إلى المرحلة المطلوبة في YPD السائل. دوامة بدقة ومكان 300 μل كل سلالة في أنبوب microcentrifuge.
- وضع بلطف 1 ميكرولتر من A كونكانافالين (سيجما) 2 ملغ / مل في كل بئر. تغسل كونكانافالين الزائدة A مرتين من جانب كل من pipetting بلطف المياه.
- في حين أن A كونكانافالين والتجفيف، ويغسل مرتين مع 300 سلالات ميكرولتر من SC المتوسطة التي تفتقر إلى الجلوكوز. غسل الجلوكوز المتبقية من جدران الخلايا يساعد التقيد السليم إلى A. كونكانافالين
- الخلايا دوامة بدقة. ماصة ميكرولتر 0.75 أو أقل من كل خلية في التعليق بشكل جيد الخاصة (الشكل 3). يغسل بلطف من الخلايا المتبقية مع المتوسط الغنية. الخطوتين التاليتين تحتاج إلى القيام بها بسرعة من أجل منع الخلايا من الجفاف.
- البلازما علاج رقاقة والآبار باستخدام بدقة المفاوض باليد كورونا، والحرص على عدم ضرب الآبار مباشرة. بعناية وضع رقاقة على الآبار، مع إيلاء اهتمام وثيق للمواءمة بين الاثنين (ويمكن أن يتم في إطار هذه الخطوة المجسام). اضغط بلطف على الالتزام طبقتين من PDMS. ملء ببطء الجهاز تماما مع متوسط حوالي 50 ميكرولتر الغنية، والتأكد من عدم ترك أي فقاعات الهواء داخل القناة.
- توصيل الجهاز أو إدخال الأنابيب في مداخل مناسبة وبدء تدفق وسائل الاعلام. رعاية التي يتم تقديمها أي فقاعات الهواء في الجهاز وهذه يمكن أن تكون خادعة لإزالة، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق قطع ومدخل أو مخرج والتنصت بلطف على الجهاز حيث الفقاعات هي، والحرص على عدم كسر الزجاج ساترة.
- وضع تحت المجهر وإيجاد نقاط التصوير المناسبة في كل بئر.
- الحفاظ على تدفق الخلايا تحت المتوسطة الغنية ل1 ساعة أو أكثر للسماح الانتعاش إذا لزم الأمر.
- بدء التجربة: نستخدم التدفق المستمر من كل من مضخات الحقن مرتين إلى منع وسائل الإعلام من ارتجاعي، وتغيير معدلات تدفق النسبية على النحو المرغوب فيه. وضع مضخة A إلى 0.8 مل / ساعة وB مضخة إلى 0.2 مل / ساعة في المتوسط نتائج A تتدفق أكثر من 80٪ من عرض القناة (الشكل 4). هذا يمكن أن يكون ديناميكيا جشنق عن طريق تغيير معدلات تدفق اثنين. استقرار الأوضاع الجديدة في غضون ثوان على طول الكامل للقناة 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتدليل على الفصل بين سلالات مختلفة تصوير نحن سلالتين الخميرة مميزة في الآبار بديلة. تصوير الآبار كامل لا يظهر أي تسرب خلية بين الآبار (5A الشكل، ب). كل سلالات لديها MSN2 عامل النسخ ذات الكلمات الدلالية مع YFP. لاختبار تأثير حيوي في وقت واحد لتغيير الأوضاع، تحولت لدينا معدلات تدفق في القنوات اثنين من المدخلات، وخلق خطوة متوسطة لا الغلوكوز، مما أدى إلى توطين Msn2-YFP إلى النواة (الشكل 5C، د). حدثت استجابة في قياس جميع الآبار في نفس الوقت، والتي تبين ويمكن استخدام الجهاز لتطبيق شروط الديناميكية المتزامنة إلى آبار متعددة.
الشكل 1. تصميم الجهاز. ويتألف الجهاز من ساترة، رقيقة "ويلز" طبقة و"تدفق" الطبقة التي هي أنابيب conneالمديرية.
الشكل 2. تدفق تصميم طبقة. يتم إجراء العفن سكوتش الشريط لهذه الطبقة. لدينا اثنين من المستخدم هنا على شكل Y قنوات معارضة الاتجاهات.
الشكل 3. آبار طبقة. والالتزام وطبقة رقيقة من PDMS مع كمات المغادرة الآبار إلى ساترة الزجاج. ثم يتم وضع في كل كونا جيدا ويترك ليجف. ثم يتم تحميل الخلايا إلى الآبار 10.
الشكل 4. تتناول رقابة تغطية القناة. من خلال التحكم في معدلات تدفق النسبية للمدخلات اثنين من قناة Y، جزء محدد من عرضه مع B. A المتوسطة المتوسطة مقابل (أ) غادر chann ش: يتدفق في 0.8ml/hr (أحمر) و 0.2 مل / ساعة (واضح) النتائج في 80٪ / 20٪ التغطية. القناة اليمنى: يتدفق كل وسائل الإعلام في نتائج مل / ساعة 0.5 في التغطية / 50٪ 50٪. (ب) صور للجهاز مع 10٪ / 90٪، 50٪ / 50٪ و 90٪ / 10٪ معدلات تدفق.
الشكل 5. دينامية التجربة مع سلالات الخميرة متعددة. (أ، ب) الجامع جيدا الصور التي تحتوي على آبار خلايا الخميرة مع (ب) أو بدون علامات HTB2-Mcherry (أ)، والتي تبين عدم تسرب خلية بين الآبار. (ج، د) استجابة الخلايا في بئرين لخطوة عدم الجلوكوز في T = 0. Msn2-YFP يموضع إلى النواة في نفس الوقت بعد خطوة، مما يدل على وسائل الاعلام في وقت واحد التغييرات في بئرين. (ه) الوقت لمسارات مستويات Msn2-YFP النووي في الخلايا واحد من تحليل واحدة من الآبار في (ج، د)./ ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الورقة نقدم طريقة بسيطة لإنشاء الفوق جهاز ميكروفلويديك تسمح التالية عدة سلالات الخميرة في وقت واحد في ظل ظروف دينامية. بعد عدة سلالات في قناة واحدة يوفر أداة موثوقة لمقارنة ديناميكية ردود خلية واحدة في سلالات متعددة. ميزة واحدة من نهجنا هو القدرة على افتعال الجهاز مع تقنيات بسيطة دون الحاجة لغرفة نظيفة. في الواقع، لقد قمنا أيضا إلى بروتوكول تخطي عمليات المعالجة البلازما (في الخطوات 2.9 و 3.6) وحصلت على نتائج جيدة، لذلك دون أي معدات مختبرات البلازما سيستمر في تنفيذ البروتوكول.
من بذر كل من سلالات مختلفة خاصة بها جيدا في نتجنب الاختلاط خلية أثناء تجميع الجهاز، في حين لا يزال يسمح تدفق المتوسطة للوصول إلى الخلايا خلال التجربة. وهناك نقطة حاسمة في هذا البروتوكول هو عدم السماح للخلايا تجف قبل الإنحسار المتوسطة عليها (خطوات 3،4 حتي 3،6). Dryinز يؤثر بشدة من صلاحية الخلايا، بينما كان يحاول إغلاق الجهاز مع الكثير المتوسطة في كل النتائج بشكل جيد في مشاكل التصاق بين طبقات PDMS اثنين. هذه القيود تجبرنا على ترك طبقة الآبار في الجهاز، ثم بدلا قشر تشغيله بعد الخلايا استقروا في بقعة بهم. طبقة الآبار، لذلك، يجب أن تكون عميقة بما يكفي لاحتواء قطرات من الخلايا الأولية المصنف، ولكن رقيقة قدر الإمكان، وبالتالي فإن نسبة الارتفاع من الآبار يسمح تدفق المتوسطة لتصل إلى أسفل والحصول على الخلايا الإشارات الخارجية من خلال تدفق المباشر.
يقتصر الجهاز كما وصفنا هنا إلى حوالي 5 سلالات لكل قناة. نخلق بشكل روتيني مع الأجهزة قناتين Y المجاورة في directionalities معارضة (الشكل 2). بينما يمكن تمديد هذه القنوات لبضعة، أو الآبار قليلة لكل قناة، فإنه لا يزال غير وإنتاجية عالية حيث ان بعض الأجهزة نمط VLSI 7، أنه حتى الآن لم يتم تطبيقها على الخلايا الحية.نلاحظ، مع ذلك، أنه منذ أن الغرض الرئيسي من هذا الجهاز هو إخضاع سلالات مختلفة للظروف نفسها بالضبط حين التصوير الخاصة بهم الاستجابات، وهناك قيود على التصوير المتزامنة التي تنبع من عدد من سلالات تصوير، بغض النظر عن تنفيذ الجهاز: في تضخم عالية، يجب أن تكون سلالات تصوير بالتتابع، ولذلك أكثر سلالات تصوير، أكبر هي الفروق بين وقت التصوير سلالة الأولى والأخيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم YG من قبل البنك الإسلامي للتنمية من الزمالة. IN هو زميل ألون وزميل كلية من J ادمون. الصفرا مركز المعلوماتية الحيوية في جامعة تل أبيب . وأيد هذا البحث من قبل قوى الأمن الداخلي منحة 1499/10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
