Summary
우리는 클린 룸이나 부드러운 리소그래피 필요없이 여러 독특한 변종에 유사한 동적 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 생산하는 간단한 방법을 제시한다.
Abstract
환경 변화에 대한 세포 반응의 연구는 많은 실험 도전을 포즈 : 전지는 비교 방식으로 자주 변경 조건 이미징해야합니다. Multiwell 플레이트는 정기적으로 여러 가지 변종 또는 셀 라인을 비교하는 데 사용하지만, 환경 역학 이상의 제한된 제어 할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치는 반면에, 주변 조건을 통해 정교한 동적 제어를 허용하지만 이미지에 도전하고에 몇 가지 변종 이상을 구별합니다. 여기 쉽고 빠르게 하나의 채널에 여러 독특한 효모 종자를 동적으로 변경하는 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 제조하는 방법을 설명합니다. 장치는 부드러운 리소그래피 필요없이 설계 및 간단한 방법으로 제조된다. 그것은 microwells을 품고 두 번째 레이어에 부착 된 Y 모양의 유동 채널로 구성되어 있습니다. 긴장은 별도의 microwells에 배치하고, 동일한 동적 조건 하에서 이미징 있습니다. 우리는 데모다른 효모 종자에 영양소를 변경 펄스에 단백질 현지화 응답을 측정하기위한 장치의 사용을 nstrate.
Introduction
세포는 끊임없이 신진 대사, 전사 프로필과 세포 기능을 변경하여, 동적으로 변화하는 환경에 반응하고 있습니다. 이러한 현상을 연구하기 위해, 이러한 변경 사항을 수량화 수있는 방법이 필요합니다. 이러한 응답에 대한 표시 장치의 한 종류는 영양 스트레스에 대응 스트레스 관련 전사 인자의 국산화의 변화입니다.
마이크로 유체 장치 1은 동적 셀 2-4으로 환경 조건을 조작하는 데 사용되었습니다. 세포의 환경이 정확하게 제어하여 동적으로 변경할 수 있습니다, 세포는 외부 조건의 조작 중에 포함 항상 라이브 이미징 될 수 있고 최소한의 시약 볼륨이 필요합니다 : 그들은 살아있는 세포 이미징에 대한 몇 가지 장점을 제시한다. 두 조건 사이에 교대를 허용 마이크로 유체 장치에 대한 아주 간단한 디자인, Y 모양의 장치가 2입니다. 우리는 정기적으로 허용 Y 모양의 마이크로 유체 장치를 사용하여채널의 셀에 역동적 인 변화의 응용 프로그램입니다. 우리는 효모 세포의 휘황 태그 스트레스 관련 전사 인자의 국산화 변경 사항을 따라이 장치를 사용합니다. 우리는 영양 조건을 변경에서 변경 사항을 따르십시오. 예를 들어, 우리는의 펄스를 (또는 펄스의 시리즈) 제공 할 수 있습니다 포도당 함유 아주 좋은 시간적 해상도에서 노 포도당 매체의 기간 내에 매체. 종종 이러한 실험에서, 하나는 다른 세포 변종 (예를 들어, 서로 다른 돌연변이, 또는 다른 야생 분리)의 응답을 비교에 관심이 있습니다. Y 모양의 채널은 각 채널에서 한 변형으로 제한됩니다 - 하나 이상의 변형을 사용하는 경우 변종을 구별 할 간단한 방법은 없습니다. 이를 극복하기 위해 다른 채널을 사용할 수 있습니다. 우리가 여러 변종에 같은 역학 조건을 적용하려면, 우리는 여러 채널과 함께 Y-채널 개념을 결합하고 싶습니다. 이 솔루션을 구현에 두 문제가 있습니다 : 그것은 t을 적용하기 어려울 수 있습니다그는 모든 채널에 같은 시간에 동일한 조건, 그리고 거기에 하나의 장치에 장착 할 수 있습니다 Y-채널의 수에 기하학적 제한됩니다. 따라서 동적 조건 하에서 하나의 채널에 여러 변종을 볼 수있는 방법을 찾고있었습니다.
여기 우리는 같은 동적 조건 하에서 하나의 채널에 영상 여러 변종위한 두 층 마이크로 유체 장치에 대해 설명합니다. 아래 층은 홀 행과 얇은 PDMS로 구성되어 있습니다. 이 층은 유리 coverslip 우리가 유리를 Concanavalin과를 준수, 서로 다른 변종을 배치됩니다에 우물을 만드는에 부착되어 있습니다. 두 번째 층은 스카치 테이프 방법 5를 사용하여 만든 Y 모양의 마이크로 유체 장치입니다. 우물에 긴장을 배치 한 후 두 번째 층은 신속하게 정렬되며 다양한 변종을 포함 여러 우물과 하나가 채널을 생성, 첫번째에 부착. 이 최종 장치 곳 모두 하나의 채널에 여러 변종에 따라 수긴장이 동일한 시간에 동일한 조건을 받게됩니다. 전체 설계 및 생산 공정이없이 부드러운 리소그래피와 함께 간단한 방법을 사용하여 benchtop에 수행 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 스카치 테이프 마스터 5 만들기
- 그리거나 종이에 원하는 microchannel 레이아웃을 확장하기 위해, 출력하면된다. 우리의 경우 디자인은 두 Y 모양의 채널 각각으로 구성되어 폭 3mm (그림 2).
- 스카치 테이프 층이있는 유리 슬라이드를 다룹니다. 층의 수는 채널 (레이어 당 60 μm)의 높이를 결정하게됩니다. 우리는 3 스카치 테이프 레이어를 사용했습니다.
- 평평한 표면에 레이아웃 디자인을 놓으십시오. 디자인 패턴을 통해 슬라이드를 맞 춥니 다. 조심스럽게 레이아웃에 따라 메스와 함께 유리 슬라이드에 테이프를 잘라.
- microchannel의 레이아웃을 제외한 유리 슬라이드의 모든 지역에서 스카치 테이프를 제거합니다.
- 2-3 분 동안 65 ° C에서 가열 오븐에 슬라이드 삽입합니다. 에탄올을 부드럽게 닦으십시오.
2. PDMS 마이크로 유체 소자를 제조
- 제조업체에서 권장하는대로 PDMS의베이스와 경화 구성 요소를 섞는다. 우리는 10시 1분를 사용경화 에이전트에 기지 비율입니다. ~ 0.5 cm의 높이에 페트리 접시에 PDMS 혼합물의 약 30 ML 하거라. 진공에서 가스를 제거하다 PDMS 필요한 경우. 최대 직면하고있는 패턴 스카치 테이프로 PDMS에 잠기 유리 슬라이드. PDMS 후 패턴을 배치하면 슬라이드과 접시 바닥 사이의 기포 형성을 방지합니다. 음식은 거품 수준을 사용하여 수평인지 확인하고, 65 ° C에서 48 시간에 대한 치료.
- 새로운 90mm 배양 접시에있는 PDMS 혼합의 3 ML 깊은 0.5 mm에 대한 레이어에 결과, 부어. (스핀 coater를 사용할 수있는 경우,이 단계를 사용할 수 있습니다.)
- 가스를 제거하다는 및 2.1에서와 같이 치료.
- 부드럽게 메스를 사용하여 원하는 크기로 마이크로 유체 장치를 잘라. 이 레이어는 "흐름 층을"이라고한다 될 것입니다.
- 두 번째 페트리 접시에서 얇은 층 PDMS의 유사 크기의 조각을 잘라. 이것은 "우물 층을"이라고한다 될 것입니다.
- 흐름 층의 유입구와 출구를위한 펀치 구멍에 적절하게 크기의 생검 주먹 (우리는 1.2 mm ID를 사용)을 사용합니다. 레이아웃에 microchannels으로 정렬 2mm ID 생검 구멍을 뚫는를 사용하여 우물 밖으로 디자인 레이아웃 및 펀치에 비해 두꺼운 유리 슬라이드에 우물 레이어를 놓습니다.
- 두 PDMS 레이어뿐만 아니라 에탄올과 24mm X 60mm 유리 coverslip를 청소합니다. 공기 건조하고 깨끗하게 유지.
- 플라즈마는 가역 본딩을위한 두 표준 플라즈마 식각 (비 치료 본딩의 경우) 또는 휴대용 코로나 treater 6을 사용하는 유리 coverslip과 우물 층 PDMS를 모두 취급합니다. 조심스럽게 (그림 3) 접착을 일으킬 수 coverslip 상단에있는 우물 레이어를 놓습니다. 부드럽게하는 기포 (필요한 경우)을 문지르세요.
3. 셀 이미징 실험
- 당신이 주사기 펌프에 0.02의 내부 직경 "(Tygon)와 유연한 플라스틱 튜브에 연결된 적절한 주사 준비가 원하는 미디어를 가지고 있는지 확인하십시오.
- S. 성장 액체 YPD에서 원하는 단계로 cerevisiae의 변종. 철저하게 소용돌이과 장소 300 μmicrocentrifuge 튜브에 각 변형 리터.
- 부드럽게 Concanavalin A (시그마) 각도에 2 밀리그램 / ML 1 μl를 놓습니다. 부드럽게 물을 pipetting하여 각도 두 번에서 초과 Concanavalin을 씻으십시오.
- Concanavalin이 건조되는 동안 포도당이 부족한 SC 매체 300 μl를 두 번 긴장을 씻는다. 세포 벽에서 잔류 포도당을 씻는 것은 Concanavalin A.에 적절한 준수하는 데 도움이
- 철저하게 소용돌이 세포. 피펫 0.75 μl 또는 자체도 (그림 3)에 각각의 세포 현탁액의 적은. 부드럽게 풍부한 매체 잔류 세포를 씻어. 다음 두 단계가 건조에서 세포를 방지하기 위해 신속하게 수행해야합니다.
- 플라즈마는 칩을 취급하고 우물은 철저하게 직접 우물를 누르하지 않도록주의하는 것 휴대용 코로나 treater을 사용합니다. 둘 사이의 정렬에 가까운 관심을 지불, 우물에 칩을주의 깊게 배치 (이 단계는 입체경에서 수행 할 수 있습니다.) 부드럽게 PD의 두 레이어를 준수 키를 눌러MS. 천천히 기포이 채널 내부에 남아되지 않습니다 확실하게, 50 μl 풍부한 매체 완전히 장치를 입력합니다.
- , 장치를 연결 적절한 유입구에 튜브를 삽입하고 미디어 흐름을 시작합니다. 이러한 제거 할 수 까다로운 될 수 있으므로 기포가 장치에 소개 안되는주의를 기울여,이는 입구 또는 출구를 분리하여 수행하고 부드럽게 유리 coverslip을 아프게하지 않도록주의하는 것 거품이 장치에 활용 될 수있다.
- 현미경으로 놓고 각 잘에 해당하는 이미지 포인트를 찾으십시오.
- 필요한 경우 복구 할 수 있도록 1 시간 이상 다양한 매체에 흐름에 따라 셀을하세요.
- 실험을 시작합니다 : 우리가 원하는대로 상대 유량을 변화, 미디어의 역류를 방지하기 위해 두 개의 주사기 펌프의 각에서 일정한 흐름을 사용합니다. 중간은 채널의 폭 (그림 4)의 80 % 이상을 흐르는의 0.8 ML / 시간 및 펌프 B에 0.2 ML / 시간 결과 펌프를 설정합니다. 이 방식은 동적 인 C 할 수 있습니다두 유량을 변경하여 목 매달아 죽였. 새로운 조건은 채널 2의 전체 길이를 따라 초 내에 안정화.
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Representative Results
다른 변종 사이의 분리를 설명하기 우리는 다른 우물에서 두 구별 효모 종자를 이미징. 이미징 전체 우물은 우물 (그림 5A, B) 사이에 세포 누설을 보여줍니다 없습니다. 두 변종은 YFP 태그가 전사 인자의 MSN2 있습니다. 동적으로 조건을 변경 동시 효과를 테스트하기 위해, 우리는 핵 (그림 5C, D)에 Msn2-YFP의 국산화로 이어진 노 포도당 매체의 단계를 작성, 두 입력 채널의 유량을 전환. 모든 우물에서 측정 응답은 장치가 여러 우물에 동시 동적 조건의 응용 프로그램에 사용할 수 표시, 같은 시간에 발생했습니다.
1 그림. 장치 디자인. 장치는 coverslip, 얇은 "웰스"레이어와 튜브가 conne이 할 수있는 '흐름'층으로 구성되어 있습니다cted.
그림 2. 흐름 레이어 디자인. 스카치 테이프 금형이 항목에 구성되어 있습니다. 여기 방향을 반대의 두 Y 모양의 채널을 사용했습니다.
그림 3. 우물 층은. 우물 천공 아웃과 PDMS의 얇은 층은 유리 coverslip을 준수하고 있습니다. 그런 다음 ConA은 각 잘에 배치하고 건조 할 수 있습니다. 전지 후 10 우물에로드됩니다.
4 그림. 제어 채널 범위. Y 채널의 폭 특정 분수의 두 입력의 상대 유량을 제어함으로써이 매체에 대 매체 B. (A) 왼쪽 chann로 덮여 있습니다 엘 : 0.8ml/hr (빨간색) 80 % / 20 %의 범위에서 0.2 ML / 시간 (일반) 결과에 흐르는. 오른쪽 채널 : 50 % / 50 %의 범위에서 0.5 ML / 시간 결과를 모두 미디어를 흐르는. (B) 10 % / 90 %, 50 % / 50 % 90% / 10 % 유량으로 장치의 사진.
그림 5. 여러 효모 종자와 동적 실험. (B) 또는 () HTB2 - Mcherry 태그없이와 효모 세포를 포함하는 우물의 (A, B) 전체 - 잘 이미지, 우물 사이에 세포 누설을 표시하지 않습니다. t = 0에서 노 포도당 단계 두 우물에서 세포의 (C, D) 응답. Msn2-YFP는 두 우물의 동시 미디어 변경 사항을 입증 단계에 따라 동시에 핵에 localizes. (E) 하나의 세포에있는 핵 Msn2-YFP 수준의 시간 트랙의 우물 (C, D) 중 하나를 분석했다./ ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에서 우리는 동적 조건 하에서 다음과 같은 몇 가지 효모 종자를 동시에 할 수있는 마이크로 유체 장치를 만들기위한 간단한 benchtop 방법을 제시한다. 하나의 채널에 여러 변종을 이용하면 여러 변종에 하나의 세포 응답의 역 동성을 비교하기위한 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다. 우리 접근 방식의 장점 중 하나는 클린 룸에 대한 필요없이 간단한 방법으로 장치를 조작 할 수있는 능력입니다. 사실, 우리는 또한 플라즈마 처리 작업 (단계 2.9 및 3.6)을 건너 프로토콜을 수행하고 좋은 결과를 가지고, 어떠한 플라즈마 장비없이 실험실은 여전히 프로토콜을 수행 할 수 있습니다.
여전히 실험이 진행되는 동안 세포에 도달하는 매체 흐름을 허용하면서 자체의 다양한 변종의 각을 퍼 뜨리고하면 잘 우리는 장치의 조립하는 동안 혼합 셀을하지 마십시오. 이 프로토콜의 중요한 점은 세포가 (- 3.6 단계 3.4)을 통해 매체를 reflowing 전에 건조하게하지 않을 수 있습니다. 마르고두 PDMS 층 사이의 접착 문제의 각도 결과에 너무 많은 매체 장치를 닫습니다하는 동안 g 아웃은 심각하게, 세포의 생존에 영향을 미칩니다. 이러한 제약은 세포가 자신의 자리에 정착 한 후 우리는 그걸 벗겨 오히려 다음 장치에서 우물 층을 떠나 강제로. 우물 층은, 따라서, 시드 세포의 초기 액적를 포함 할 수있을만큼 깊은 수 있다고하지만, 가능한 한 얇은 때문에 우물의 가로 세로 비율은 아래에 도달 할 매체 흐름을 허용하고 세포가 직접 흐름을 통해 외부 신호를 얻을.
우리가 여기서 설명하는대로 장치는 채널 당 약 5 변종으로 제한됩니다. 우리는 정기적으로 반대 directionalities에서 두 개의 인접한 Y 채널 (그림 2)와 장치를 만들 수 있습니다. 이것은 몇 채널 또는 채널 당 몇 우물로 확장 될 수 있지만, 지금까지 살아있는 세포에 적용되지 않은 그 VLSI 스타일 장치 7의 일부와 같은 높은 처리량으로 아직 없습니다.우리는 관계없이 장치 구현이 장치의 주요 목적은 동일한 조건에 다른 변종을 주제이기 때문에 영상의 응답 반면, 제한 종자의 수의 줄기는 이미징하는 동시에 영상에 있다는 것을, 그러나 유의 :시 높은 배율이 변종 따라서 더 많은 변종이 큰 첫 번째와 마지막 변형 사이 영상의 시간 차이이며, 이미징, 순서 이미징해야합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
YG는 IDB의 화목에 의해 지원됩니다. IN은 아론의 동료들과 에드몬드 J 의 교수 동료입니다. 텔 아비브 대학에서 생물 정보학에 대한 Safra 센터 . 이 연구는 ISF 부여 10분의 1,499에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
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