Summary
Мы приведем простой способ получения микрофлюидных устройств, способных применения аналогичных динамических условиях на нескольких различных штаммов, без необходимости в чистой комнате или мягкой литографии.
Abstract
Изучение клеточных реакций на изменения окружающей среды ставит много экспериментальных задач: клетки должны быть отображены в меняющихся условиях, часто в сравнительном порядке. Multiwell пластин, которые обычно используются для сравнения различных штаммов или клеточные линии, но позволяют ограниченный контроль над окружающей средой динамику. Микрофлюидных устройств, с другой стороны, позволяют изысканные динамического контроля над окружающим условиям, но это сложно различить изображение и больше, чем несколько штаммов в них. Здесь мы опишем метод, чтобы легко и быстро производить микрофлюидных устройство, способное применения динамически изменяющимся условиям в нескольких различных штаммов дрожжей в одном канале. Устройство сконструировано и изготовлено простыми средствами, без необходимости для мягкой литографии. Он состоит из Y-формы проточного канала подключен к второму слою укрывательство лунок. Штаммы помещаются в отдельные лунки, и отображаемого в соответствии с точно такой же динамических условиях. Мы демоnstrate использования прибора для измерения ответы белка локализации импульсов питательных изменения в различных штаммов дрожжей.
Introduction
Клетки постоянно реагировать на динамично изменяющейся среде, путем изменения их метаболизма, транскрипционный профиль и клеточных функций. Для изучения этих явлений, методы, которые могут количественно оценить такие изменения необходимы. Один тип отсчета для такого ответа является изменение локализации, связанные со стрессом факторов транскрипции в ответ на питании напряжением.
Микрофлюидных устройств 1 были использованы для динамически манипулировать условиям окружающей среды к клеткам 2-4. Они представляют собой ряд преимуществ для живых клеток: среда клетки могут быть точно управлять и динамически изменяться, клетки могут быть живыми отображаемого во все времена, в том числе во время манипуляций внешних условий, а также минимальные объемы реагента не требуется. Очень простой дизайн для микрофлюидных устройство, позволяющее чередование двух условий, является Y-формы устройства 2. Мы регулярно использовать Y-формы микрофлюидных устройств, которые позволяютприменение динамических изменений в клетках в канале. Мы используем это устройство, чтобы следить локализации изменений флуоресцентно отмеченных связанных со стрессом факторов транскрипции в клетках дрожжей. Мы следуем этим изменениям при изменении условий питания. Например, мы можем предоставить импульса (или серии импульсов) глюкозо-среде, содержащей в течение не-глюкозы среды, в очень тонкой временное разрешение. Часто в таких экспериментах, заинтересован в сравнение ответов различных штаммов клеток (например, различные мутанты, или различные дикие штаммы). Y-образного канала ограничивается одним напряжения в каждом канале - если более чем один штамм используется, не существует простой способ отличить штаммов. Чтобы преодолеть это, разные каналы могут быть использованы. Если мы хотим применить те же условия динамику на нескольких штаммов, мы хотели бы объединить Y-канал концепции с несколькими каналами. Есть две проблемы в реализации этого решения: Это может быть трудно применить тОн же условиях, в то же время для всех каналов, и есть геометрические ограничения на количество Y-каналов, которые могут быть установлены в одном устройстве. Поэтому мы были ищете способ для просмотра нескольких штаммов в одном канале в динамических условиях.
Здесь мы опишем двухслойной микрофлюидных устройство, предназначенное для работы с изображениями нескольких штаммов в одном канале при тех же динамических условиях. Нижний слой состоит из тонких PDMS с рядом отверстий. Этот слой крепится на стекло покровное создания скважины, в котором мы будем размещать различные штаммы, придерживаясь их с конканавалин к стеклу. Второй слой представляет собой Y-формы микрофлюидных устройство создается с помощью метода скотч 5. После размещения деформаций в скважинах второй слой быстро выравнивается и прикреплена к первой, создавая один канал с несколькими скважинами, которые содержат различные штаммы. Это окончательное устройство позволяет после нескольких штаммов в одном канале, где всештаммы подвергают тех же условиях, в то же самое время. Весь дизайн и процесс производства может быть сделано по крышке, используя простые средства, без мягкой литографии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание ленты Scotch-Master 5
- Ничья или распечатать желаемую микроканальных макет, масштабировать, на бумаге. В нашем случае конструкция состоит из двух Y-формы каналов, каждый шириной 3 мм (рис. 2).
- Крышка стекла слайд со слоями скотча. Количество слоев определяет высоту канала (около 60 мкм на слой). Мы использовали 3 слоями скотча.
- Место расположения конструкции на плоской поверхности. Совместите скользят по шаблона проектирования. Отрежьте ленту на стекло с помощью скальпеля в соответствии с макета.
- Удалите скотч со всех регионов стекло за исключением тех, в расположение микроканала.
- Поместите слайд в нагревательной печи при температуре 65 ° С в течение 2-3 мин. Очистите осторожно этанола.
2. Изготовление устройств PDMS Микрофлюидных
- Смешать базы и отверждения компонентов PDMS в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Мы используем 10:01отношение основания к отвердителя. Залить около 30 мл смеси PDMS в чашку Петри на высоте ~ 0,5 см. Дега PDMS в вакуум, если это необходимо. Опустите стекло в PDMS с узорной скотчем вверх. Размещение образца после PDMS предотвращает образование воздушных пузырьков между горкой и блюдо снизу. Лечение в течение 48 часов при 65 ° C, убедившись, что блюдо горизонтальных помощью пузырькового уровня.
- В новый 90 мм блюдо Петри заливают 3 мл PDMS смеси, в результате чего слой толщиной около 0,5 мм глубиной. (Если спина нанесения покрытий доступна, она может быть использована для этой стадии).
- Дега и лечения, в 2,1.
- Аккуратно вырежьте микрофлюидных устройство до нужного размера с помощью скальпеля. Этот слой будет называться "поток слой".
- Вырежьте же размера кусок тонким слоем PDMS от второй чашки Петри. Это будет называться "скважин слой".
- Используйте соответствующего размера биопсия перфоратора (мы используем 1,2 мм ID), чтобы пробить отверстия для входа и выхода в потоке слоя. Поместите слой скважин на толстую стеклянную пластинку над макетом дизайна и удар из скважины, с помощью 2 мм ID биопсию перфоратор, в соответствие с микроканалов на макет.
- Очистите и PDMS слоев, а также 24 мм х 60 мм стекло покровное с этанолом. Воздушно-сухой и содержать в чистоте.
- Плазменные лечения как покровное стекло и скважин слоем PDMS с использованием либо стандартных гравер плазмы (для не-обратимые связи) или ручным короны Протравливатель 6 для обратимой связи. Аккуратно положите слой скважин в верхней части покровного вызывать адгезию (рис. 3). Аккуратно протрите из пузырьков воздуха (при необходимости).
3. Эксперимент сотовых изображений
- Убедитесь, что у вас есть нужный носитель готовы в соответствующие шприцы связано с гибкой пластиковой трубы с внутренним диаметром 0,02 "(Tygon) в шприцевой насос.
- Расти С. CEREVISIAE штаммов в нужную фазу в жидком YPD. Vortex тщательно и место 300 μл каждого штамма в микроцентрифуге трубку.
- Аккуратно 1 мкл Конканавалин (сигма) 2 мг / мл в каждую лунку. Промойте превышение Конканавалин из каждой лунки в два раза, осторожно пипеткой воды.
- В то время как Конканавалин сохнет, мыть штаммов в два раза с 300 мкл SC среде, лишенной глюкозы. Стиральные остаточной глюкозы из клеточных стенок помогает надлежащего соблюдения Конканавалин A.
- Vortex клетки тщательно. Внесите 0,75 мкл или менее каждой клеточной суспензии в собственный колодец (рис. 3). Осторожно промыть остаточных клеток с богатой среде. Следующие два шага должны быть выполнены быстро, чтобы предотвратить клетки от высыхания.
- Плазменные лечения чипа и скважин тщательно с использованием ручных короны Протравливатель, будьте осторожны, чтобы не ударить скважин напрямую. Аккуратно положите фишку на скважинах, обращая особое внимание на выравнивание между двумя (этот шаг может быть сделано под стереоскоп). Аккуратно нажмите придерживаться двух слоев PDMS. Медленно заполните устройство полностью с примерно 50 мкл обогащенной среде, убедившись, что нет воздушных пузырей остаются внутри канала.
- Подключите устройство, вставки трубы в соответствующие входы и начать рабочих сред. Позаботьтесь, чтобы пузырьки воздуха не вводятся в устройство, как это может быть сложно удалить, это может быть достигнуто путем отключения входе или выходе и осторожно нажимая на устройство, в котором пузырьки, осторожно, чтобы не разбить стекло покровное.
- Место под микроскопом и найти соответствующие точки изображения в каждую лунку.
- Держите клетки под богатыми потока рабочей среды в течение 1 часа или дольше, чтобы позволить восстановление в случае необходимости.
- Начало эксперимента: мы используем постоянный поток от каждого из двух насосов шприц для предотвращения обратного потока среды, изменение относительного расхода по желанию. Установка насоса до 0,8 мл / ч и насос B до 0,2 мл / ч результатов в среде течет более 80% от ширины канала (рис. 4). Это может быть динамически сповешен изменения двум показателям расхода. В новых условиях стабилизации в течение нескольких секунд по всей длине канала 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать разделение между различными штаммами мы отображаемого двух различимых штаммов дрожжей в альтернативном скважин. Изображениями полном скважин не показывает ячейки утечки между скважинами (рис. 5а, б). Оба штамма имеют MSN2 фактор транскрипции с тегом YFP. Чтобы проверить одновременное воздействие динамически изменяющимся условиям, мы перешли скорости потока в два входных канала, создавая шагом не-глюкозы среды, в результате которого локализации MSN2-YFP к ядру (рис. 5в, г). Ответ измеряется на всех скважинах произошло в то же время, показывая, что устройство может быть использовано для нанесения одновременных динамических условиях на нескольких скважинах.
Рисунок 1. Конструкция устройства. Устройство состоит из покровного, тонкие "Уэллс" слой и "Поток" слой, к которому трубка ConneИДКТК.
Рисунок 2. Поток слоя дизайна. Скотч-лента пресс-формы сделаны для этого слоя. Здесь мы использовали два Y-формы каналов противоположных направлениях.
Рисунок 3. Wells слоя. Тонким слоем PDMS с перфорированными выезда скважин привязана к покровным стеклом. Тогда ConA помещают в каждую лунку и дают высохнуть. Клетки затем загружены на 10 скважинах.
Рисунок 4. Контролируемый охват канала. Контролируя относительные скорости потока из двух входов Y канала, конкретные доли ее ширина погружении против среднего B. (а) Левый Chann EL: Течет на 0.8ml/hr (красный) и 0,2 мл / ч (прозрачный) приводит к 80% / 20% покрытия. Правый канал: Измельчитель обеих средах при 0,5 мл / ч приводит к 50% / 50% покрытия. (Б) Фотографии устройства с 10% / 90%, 50% / 50% и 90% / 10% расхода.
Рисунок 5. Динамический эксперимент с несколькими штаммами дрожжей. (А, б) Всего-же изображения лунки, содержащие клетки дрожжей с (б) или без (а) HTB2-Mcherry пометки, не показывая клетки утечки между скважинами. (В, г) ответа клеток в двух скважин не-глюкозы шаг при Т = 0. MSN2-YFP локализуется в ядре, в то же время после шаг, демонстрирующий одновременного изменения информации в двух скважин. (Е) Time-треков ядерных MSN2-YFP уровней в одиночных камерах проанализированы с одной из скважин (в, г)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представляем простой метод для создания настольных микрофлюидных устройство, которое позволяет следующих нескольких штаммов дрожжей одновременно в динамических условиях. После нескольких штаммов в одном канале обеспечивает надежный инструмент для сравнения динамики одно-клеточные реакции в нескольких штаммов. Одним из преимуществ нашего подхода является возможность изготовить устройство с простыми методами без использования чистой комнате. В самом деле, мы также провели протокол пропуская плазменной обработки операций (с шагом 2,9 и 3,6) и получили хорошие результаты, так лабораториях без оборудования плазмы может выполнять протокол.
По посева каждого из различных штаммов в своей хорошо ли мы избежать ячейки перемешивания при сборке устройства, при этом позволяя потока рабочей среды, чтобы достичь клеток в ходе эксперимента. Критической точкой в этом протоколе не давая клеткам высохнуть, прежде чем оплавлении средних над ними (шаги 3,4 - 3,6). Dryinг из сильно влияет на жизнеспособность клеток, пытаясь закрыть устройство со слишком большим среды в каждую лунку результатов в адгезией проблем между двумя слоями PDMS. Эти ограничения заставляют нас покинуть слой скважин на устройстве, а затем очистить его после того, как клетки поселились в их месте. Слой скважин, следовательно, должен быть достаточно глубоким, чтобы содержать начальные капли клетки посеяны, но как можно тоньше, так что соотношение сторон скважин позволяет потока рабочей среды для достижения своих дно и клетки получают внешних сигналов путем прямого потока.
Устройство, как мы описываем здесь ограничена до 5 штаммов на канал. Мы регулярно создавать устройства с двумя соседними каналами Y на противоположных directionalities (рис. 2). Хотя это может быть распространена на несколько каналов или несколько скважин на канал, это еще не так высокая пропускная способность, как некоторые из стиля VLSI устройств 7, которые до сих пор не применялись в живых клетках.Отметим, однако, что, поскольку основная цель этого устройства подвергать различным штаммам точно такие же условия при визуализации своих ответах, существуют ограничения на одновременное визуализации, которые вытекают из числа штаммов отображаемого, независимо от выполнения устройства: при большим увеличением, штаммы должны быть отображены последовательно, поэтому более штаммов отображаемого, тем выше разница во времени визуализации между первым и последним напряжения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
YG поддерживает общение с ИБР. В это парень Алон и факультет сотрудник Edmond J . Сафра Центр биоинформатики в Тель-Авивском университете . Это исследование было поддержано грантом ISF 1499/10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
