Summary
Se presenta un método simple para producir los dispositivos de microfluidos capaces de aplicar similares condiciones dinámicas a múltiples cepas distintas, sin la necesidad de una sala limpia o litografía blanda.
Abstract
El estudio de las respuestas celulares a los cambios ambientales plantea muchos retos experimentales: las células necesitan para formar imágenes en condiciones cambiantes, a menudo de una manera comparativa. Placas de pocillos múltiples, se utilizan habitualmente para comparar diferentes cepas o líneas celulares, pero permiten un control limitado sobre la dinámica del medio ambiente. Los dispositivos microfluídicos, por otra parte, permite el control exquisito dinámico sobre las condiciones del entorno, pero es difícil de imagen y distinguir más de unas pocas cepas de ellos. Aquí se describe un método para fabricar fácil y rápidamente un dispositivo de microfluidos capaz de aplicar las condiciones de cambio dinámico a múltiples cepas de levadura distintas en un canal. El dispositivo está diseñado y fabricado por medios sencillos sin necesidad de litografía blanda. Se compone de un canal de flujo en forma de Y unido a una segunda capa albergar micropocillos. Las cepas se colocan en pocillos separados, y fotografiado bajo las exactas condiciones dinámicas mismos. Nos demo denstrate el uso del dispositivo para la medición de las respuestas de proteína de localización a los pulsos de cambios de nutrientes en diferentes cepas de levadura.
Introduction
Las células constantemente reaccionar a un entorno que cambia dinámicamente, cambiando su metabolismo, el perfil de la transcripción y de las funciones celulares. Para estudiar estos fenómenos, los métodos que puedan cuantificar dichos cambios son necesarios. Un tipo de lectura para tales respuestas es el cambio en la localización de los factores de transcripción relacionados con el estrés en respuesta a estrés nutricional.
Los dispositivos microfluídicos 1 se han utilizado para manipular dinámicamente condiciones ambientales a las células 2-4. Se presentan varias ventajas para imágenes de células vivas: el medio ambiente de las células puede ser controlada con precisión y cambiar dinámicamente; células pueden ser vivo-imagen formada en todo momento, incluyendo durante la manipulación de las condiciones externas, y volúmenes mínimos de reactivos se requieren. Un diseño muy simple para un dispositivo de microfluidos, permitiendo alternancia entre dos condiciones, es un dispositivo en forma de Y 2. Nos utilizan habitualmente en forma de Y que permiten que los dispositivos de microfluidosaplicación de cambios dinámicos en las células en el canal. Usamos este dispositivo para seguir los cambios de localización de marcado con fluorescencia factores de transcripción relacionados con el estrés en las células de levadura. Seguimos estos cambios en las nuevas condiciones nutricionales. Por ejemplo, se puede proporcionar un impulso (o una serie de pulsos) de la glucosa que contienen medio dentro de un período de no glucosa-medio, con una resolución temporal muy fina. A menudo, en estos experimentos, se está interesado en comparar las respuestas de las cepas celulares diferentes (por ejemplo, mutantes diferentes, o diferentes cepas salvajes). El canal en forma de Y está limitado a una cepa en cada canal - si más de una cepa se utiliza, no hay ninguna manera sencilla de distinguir entre las cepas. Para superar esto, los canales se pueden utilizar diferentes. Si queremos aplicar las mismas condiciones dinámicas a múltiples cepas, nos gustaría combinar el concepto Y-canal con múltiples canales. Hay dos desafíos en la implementación de esta solución: Puede ser difícil de aplicar tél mismas condiciones al mismo tiempo a todos los canales, y no hay una limitación geométrica con el número de Y-canales que se pueden montar en un solo dispositivo. Estábamos por lo tanto buscando una manera para ver varias cepas en un canal en condiciones dinámicas.
Aquí se describe un dispositivo de microfluidos de dos capas destinado a cepas de imágenes múltiples en un canal bajo las mismas condiciones dinámicas. La capa inferior consiste en PDMS delgada con una fila de agujeros. Esta capa está unida al cubreobjetos de vidrio en la creación de los pozos que vamos a colocar las diferentes cepas, adhiriéndose con concanavalina A para el vidrio. La segunda capa es un dispositivo microfluídico en forma de Y creado usando el método de la cinta adhesiva 5. Después de colocar las cepas en los pocillos de la segunda capa es rápidamente alineado y conectado a la primera, la creación de un canal con varios pozos que contienen las diferentes cepas. Este último dispositivo permite tras varias cepas en un canal, donde todoscepas se someten a las mismas condiciones que en el mismo tiempo exacto. Todo el diseño y el proceso de producción se puede hacer en el laboratorio, utilizando medios sencillos, sin litografía blanda.
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Protocol
1. Creación de un Master cinta Scotch-5
- Dibujar o imprimir diseño deseado microcanal, a escala, en el papel. En nuestro caso, el diseño se compone de dos canales en forma de Y, cada uno de 3 mm de ancho (Figura 2).
- Cubra un portaobjetos de vidrio con capas de cinta adhesiva. El número de capas determinará la altura del canal (alrededor de 60 micras por capa). Utilizamos tres capas de cinta scotch.
- Coloque el esquema de trazado sobre una superficie plana. Alinear a la diapositiva en el patrón de diseño. Cortar cuidadosamente la cinta adhesiva en el portaobjetos de vidrio con un bisturí de acuerdo con el diseño.
- Retire la cinta Scotch de todas las regiones de la lámina de vidrio, excepto aquellos en el diseño del microcanal.
- Colocar el portaobjetos en un horno de calentamiento a 65 ° C durante 2-3 min. Limpie suavemente con etanol.
2. Fabricar un dispositivo microfluídico de PDMS
- Mezclar la base y componentes de curado de PDMS como se recomienda por el fabricante. Utilizamos una mezcla 10:1relación de base a agente de curado. Verter aproximadamente 30 ml de mezcla de PDMS en una placa Petri a una altura de ~ 0,5 cm. Desgasificar el PDMS en el vacío si es necesario. Sumerja el portaobjetos en el PDMS con la cinta Scotch estampado mirando hacia arriba. La colocación del patrón después de que el PDMS evita la formación de burbujas de aire entre la corredera y fondo del plato. Curar durante 48 horas a 65 ° C, lo que hace que la antena es horizontal utilizando un nivel de burbuja.
- En una nueva placa de Petri 90 mm vierta 3 ml de mezcla de PDMS, resultando en una capa de aproximadamente 0,5 mm de profundidad. (Si una recubridora de rotación está disponible, se puede utilizar para esta etapa).
- Degas y curar como en 2.1.
- Suavemente cortar el dispositivo de microfluidos al tamaño deseado con un escalpelo. Esta capa se denomina la "capa de flujo".
- Cortar un trozo de tamaño similar de capa delgada PDMS de la segunda placa de Petri. Esto se denomina "capa de pozos".
- Utilice un golpeador biopsia de tamaño apropiado (Usamos 1,2 mm ID) para perforar agujeros para las entradas y salidas en la capa de flujo. Coloque la capa de pozos en un portaobjetos de vidrio de espesor sobre la disposición de diseño y rompa los pozos, utilizando 2 mm ID golpeador biopsia, en alineación con los microcanales de la presentación.
- Limpiar ambas capas de PDMS, así como un 24 mm x 60 mm cubreobjetos de vidrio con etanol. Seque y mantener limpio.
- Plasma tratar tanto el cubreobjetos de vidrio y la capa de PDMS pozos utilizando estándar grabador de plasma (por no reversible bonding) o un tratador corona de mano 6 para la unión reversible. Colocar con cuidado la capa de pozos en la parte superior del cubreobjetos para causar la adhesión (Figura 3). Frote suavemente las burbujas de aire (si es necesario).
3. Celular Experimento de imágenes
- Asegúrese de tener listo el soporte deseado en jeringas apropiadas conectados a tubos de plástico flexible con un diámetro interno de 0,02 "(Tygon) en la bomba de jeringa.
- Crecer S. cerevisiae a la fase deseada en YPD líquido. Vortex a fondo y el lugar 300 μl de cada cepa en un tubo de microcentrífuga.
- Coloque suavemente 1 l de Concanavalina A (Sigma) 2 mg / ml en cada pocillo. Lavar el exceso de Concanavalina A partir de cada pocillo dos veces con cuidado pipeteando agua.
- Mientras que la Concanavalina A se está secando, lavar dos veces con 300 cepas l de medio SC falta de glucosa. Lavadora glucosa residual de las paredes celulares ayuda a la adherencia adecuada a la concanavalina A.
- Células Vortex a fondo. Pipetear 0,75 l o menos de cada suspensión de células en su propio pozo (Figura 3). Lave suavemente a las células residuales con medio rico. Los siguientes dos pasos deben realizarse rápidamente a fin de evitar que las células se seque.
- Plasma tratar el chip y los pozos de fondo con el tratador corona de mano, teniendo cuidado de no golpear a los pozos directamente. Colocar con cuidado el chip en los pocillos, prestando mucha atención a la alineación entre los dos (este paso se puede realizar en un estereoscopio). Presione suavemente para adherir las dos capas de la EPMS. Lentamente llene completamente el dispositivo con aproximadamente 50 l medio rico, asegurándose de que no hay burbujas de aire se dejan dentro de la canal.
- Conecte el dispositivo, la inserción de los tubos en las entradas apropiadas e iniciar el flujo de los medios de comunicación. Tener cuidado de que no hay burbujas de aire se introduce en el dispositivo, ya que pueden ser difíciles de eliminar, esto se puede lograr mediante la desconexión de una entrada o salida y golpeando suavemente sobre el dispositivo en el que las burbujas son, con cuidado de no romper el cubreobjetos de vidrio.
- Colocar bajo microscopio y buscar los puntos apropiados de formación de imágenes en cada pocillo.
- Mantener las células bajo un flujo de medio rico durante 1 hora o más para permitir la recuperación, si es necesario.
- Iniciar el experimento: se utiliza el flujo constante de cada una de las dos bombas de jeringa para evitar el reflujo de los medios de comunicación, el cambio de velocidades relativas de flujo como se desee. Ajuste de la bomba A a 0,8 ml / hr y B de la bomba a 0,2 ml / hr resultados en medio A que fluye sobre 80% de la anchura del canal (Figura 4). Esto puede ser dinámicamente ccolgado mediante el cambio de los dos caudales. Las nuevas condiciones estabilizar dentro de segundos a lo largo de toda la longitud de la canal 2.
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Representative Results
Para demostrar la separación entre las diferentes cepas que fotografiado dos cepas de levadura distinguibles en pocillos alternos. La formación de imágenes completo pozos muestra ninguna fuga entre los pocillos de células (Figura 5a, b). Ambas cepas tienen la MSN2 factor de transcripción etiquetados con YFP. Para probar el efecto simultáneo de las condiciones cambiantes dinámicamente, cambiamos las velocidades de flujo en los dos canales de entrada, creando un paso de medio sin glucosa, lo que resultó en la localización de Msn2-YFP en el núcleo (Figura 5c, d). La respuesta medida en todos los pocillos se produjo al mismo tiempo, que muestra el dispositivo puede ser utilizado para la aplicación de condiciones dinámicas simultáneas a múltiples pozos.
Figura 1. Diseño del dispositivo. El dispositivo se compone de un cubreobjetos, una delgada capa de "Wells" y un "flujo" de la capa a lo cual el tubo es conneDirección Ejecutiva.
Figura 2. Diseño de flujo de capa. Un molde con la cinta adhesiva se hace para esta capa. Aquí se utilizan dos canales en forma de Y de direcciones opuestas.
Figura 3. Capa de Wells. La delgada capa de PDMS con sacabocados pozos se adhiere a un cubreobjetos de vidrio. Entonces ConA se colocó en cada pocillo y se dejó secar. Después las células se cargan a los 10 pozos.
Figura 4. Cobertura de canal controlado. Mediante el control de los caudales relativos de las dos entradas de un canal Y, una fracción específica de su anchura está cubierto con medio Un medio vs B. (a) Izquierda Chann EL: fluye en 0.8ml/hr (rojo) y 0,2 ml / hr (claro) resulta en 80% / 20% de cobertura. Canal derecho: Flowing ambos medios de 0,5 ml / hr resultado / cobertura del 50% al 50%. (B) Las fotografías del dispositivo con / 10% / 90%, 50% / 50% y 90% tasas de flujo 10%.
Figura 5. Experimento dinámico con múltiples cepas de levadura. (A, b) Whole-así imágenes de los pocillos que contenían células de levadura con (b) o sin (a) HTB2-mCherry etiquetado, mostrando ninguna fuga de células entre los pozos. (C, d) Respuesta de las células en dos pozos a una etapa de no-glucosa en t = 0. Msn2-YFP localiza en el núcleo al mismo tiempo después de la etapa, lo que demuestra los cambios de medios diferentes en los dos pozos. (E) Plazo de pistas nucleares Msn2-YFP niveles en las células individuales analizadas a partir de uno de los pozos en (c, d)./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.
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Discussion
En este trabajo se presenta un método de sobremesa sencillo para crear un dispositivo de microfluidos que permite las siguientes cepas de levadura de manera simultánea en condiciones dinámicas. Después de varias cepas en un canal proporciona una herramienta fiable para la comparación de la dinámica de las respuestas de células individuales en múltiples cepas. Una ventaja de nuestro enfoque es la capacidad para fabricar el dispositivo con técnicas sencillas sin la necesidad de una sala limpia. De hecho, también hemos llevado a cabo el protocolo de saltarse las operaciones de tratamiento de plasma (en intervalos de 2,9 y 3,6) y nos dieron buenos resultados, por lo que los laboratorios sin equipo de plasma aún puede realizar el protocolo.
Por la siembra de cada una de las diferentes cepas en su propio pozo que evitar celda de mezcla durante el montaje del dispositivo, al tiempo que permite el flujo de medio para llegar a las células durante el experimento. Un punto crítico en este protocolo es no dejar que las células se sequen antes de reflujo medio por encima de ellos (Pasos 3,4 a 3,6). Drying cabo afecta gravemente a la viabilidad de las células, al intentar cerrar el dispositivo con medio demasiado en los resultados de cada bien en problemas de adherencia entre las dos capas de PDMS. Estas limitaciones nos obligan a dejar la capa de pozos en el dispositivo, en lugar de pelarla apagado después de que las células se han asentado en su lugar. La capa de pozos, por lo tanto, tiene que ser lo suficientemente profunda para contener la gotita inicial de células sembradas, pero lo más fina posible, por lo que la relación de aspecto de los pozos permite el flujo medio para llegar a su parte inferior y las células obtienen señales externas a través de flujo directo.
El dispositivo tal como se describe aquí está limitada a unos 5 cepas por canal. En forma rutinaria crear dispositivos con dos canales adyacentes en direccionalidades Y opuestas (Figura 2). Si bien esto puede ser extendido a unos pocos canales más, o unos pocos pozos más por canal, que todavía no es tan alto rendimiento como algunos de los dispositivos de estilo de VLSI 7, que hasta el momento no se han aplicado a las células vivas.Observamos, sin embargo, que puesto que el propósito principal de este dispositivo es someter cepas diferentes a exactamente las mismas condiciones de formación de imágenes, mientras que sus respuestas, hay limitaciones a la obtención de imágenes simultáneas que se derivan de la serie de cepas de fotografiado, independientemente de la implementación del dispositivo: en ampliación alta, las cepas tienen que ser reflejado secuencialmente, por lo tanto, las cepas más fotografiada, la más grande son las diferencias de tiempo de formación de imágenes entre la primera y la última cepa.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
YG es apoyado por una beca del BID. IN es un tipo Alon y miembro de la facultad Edmond J. Safra Centro de Bioinformática de la Universidad de Tel Aviv . Esta investigación fue apoyada por la ISF beca 1499/10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
