Summary
Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.
Abstract
Comprendere le proprietà biofisiche e l'organizzazione funzionale dei neuroni singoli e come informazioni di processo è fondamentale per capire come funziona il cervello. La funzione primaria di qualsiasi cellula nervosa è di elaborare i segnali elettrici, solitamente da più fonti. Proprietà elettriche dei processi neuronali sono straordinariamente complessa, dinamica, e, nel caso generale, impossibile prevedere in assenza di misurazioni dettagliate. Per ottenere tale misurazione si sarebbe, idealmente, come essere in grado di monitorare, in più siti, eventi sottosoglia mentre viaggiano dai siti di origine sui processi neuronali e sommare in posizioni particolari di influenzare iniziazione potenziale d'azione. Questo obiettivo non è stato raggiunto in un neurone a causa di limitazioni tecniche di misurazioni che utilizzano elettrodi. Per superare questo inconveniente, è altamente desiderabile per integrare la patch-elettrodo approccio con tecniche di imaging che permettono ampia Recordin parallelogs da tutte le parti di un neurone. Qui, descriviamo una tecnica - ottico di registrazione dei transitori potenziale di membrana con organici tensione coloranti sensibili (V m-imaging) - caratterizzati da sub-millisecondo e sub-micrometrica risoluzione. Il nostro metodo si basa sul lavoro pionieristico di sonde molecolari tensione-sensibili 2. Molti aspetti della tecnologia iniziale sono stati continuamente migliorati per decenni 3, 5, 11. Inoltre, lavoro precedente documentato due caratteristiche essenziali di V m-imaging. In primo luogo, i segnali di fluorescenza sono linearmente proporzionale al potenziale di membrana su tutta la gamma fisiologica (-100 mV a +100 mV, 10, 14, 16). In secondo luogo, i neuroni di carico con la tensione di colorante sensibile usato qui (JPW 3028) non ha effetti farmacologici rilevabili. L'ampliamento del picco registrato durante il caricamento del colorante è completamente reversibile 4, 7. Inoltre, prove sperimentali mostrano che è possibile ottenereun numero significativo (fino a centinaia) di registrazioni prima di eventuali effetti rilevabili fototossiche 4, 6, 12, 13. Attualmente, sfruttare la luminosità eccezionale e stabilità di una sorgente di luce laser a lunghezza d'onda quasi ottimale per massimizzare la sensibilità della m-imaging tecnica V. La sensibilità attuale consente registrazioni di più siti di ottica di V transitori m da tutte le parti di un neurone, tra assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e spine dendritiche individuali. Le informazioni acquisite sulle interazioni di segnale possono essere analizzati quantitativamente e direttamente visualizzati sotto forma di un film.
Protocol
1. Impostazione dell'apparecchiatura
Passo 1.1. Imaging di installazione
La chiave per la registrazione dei segnali di tensione colorante sensibili è la progettazione di configurazione appropriato. Usiamo un microscopio in posizione verticale (BX51WI Olympus o AxioExaminer Zeiss) dotato di tre telecamere. L'installazione è stata progettata per l'illuminazione di singoli neuroni in fettine di cervello di luce di eccitazione in epi-fluorescenza, wide-field modalità microscopia utilizzando sia 60X/1.0 Nikon NA o Zeiss 63X/1.0 acqua NA obiettivi immersione. Nostri microscopi sono imbullonati a una tabella di isolamento di vibrazione e dotate motorizzati fasi mobili. Ogni microscopio è dotato di tre porte fotocamera. Una porta fotocamera è dotata di un elevato standard risoluzione spaziale camera CCD per DIC video-microscopia a raggi infrarossi (IR-1000, Dage MTI, USA). La porta ha una seconda fotocamera veloce acquisizione dei dati della telecamera (fino a 20 frame rate kHz) con relativamente bassa risoluzione spaziale (80 x 80 pixel), ma eccezionale gamma dinamica (14 bit) e eccezionalmente basso leggererumore (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). La terza porta fotocamera ha una fotocamera CCD ad alta risoluzione spaziale (PixelFly, 1392x1024 pixel, PCO AG, Germania) montato su un disco rotante-scanner confocale (CSU-10, Yokogawa, Giappone) utilizzato per raccogliere z-stacks di immagini confocali per dettagliata ricostruzione morfologica della cellula colorata. Un diodo a frequenza doppia-pompato Nd: YVO4 laser ad onda continua (400 mW) che emette a 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Cina) è la sorgente di luce di eccitazione. Il diametro di 2 millimetri fascio laser gated da un otturatore (LS6; Associates Vincent) è diretta ad una guida di luce accoppiato al microscopio tramite una singola porta condensatore epifluorescenza (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Germania) progettati per riempire completamente l'apertura posteriore del obiettivo e fornire un'illuminazione uniforme prossimità del piano oggetto. La luce laser viene utilizzato al posto di un convenzionale lampada Xenon ad arco per massimizzare la sensibilità del V m-imaging da: (1) usando un ex monocromaticaluce citazione all'ala rossa dello spettro di assorbimento di massimizzare V m sensibilità del colorante 9, 10 e (2) aumentare l'intensità della luce di eccitazione oltre il livello che può essere raggiunto da una lampada ad arco. La luce di eccitazione è riflessa alla preparazione da uno specchio dicroico con una lunghezza d'onda centrale di 560 nm e la luce di fluorescenza registrata fatto passare attraverso un filtro barriera 610 nm (a Schott RG610). L'effetto combinato di un aumento dell'intensità della luce e l'utilizzo di lunghezze d'onda ottimali vicino eccitazione monocromatiche era un drammatico miglioramento della sensibilità di imaging tensione di un fattore di circa 50 rispetto alle misurazioni precedenti 6.
Passo 1,2. Regolare per un'illuminazione uniforme
Utilizzare uno standard fluorescenza diapositiva (eccitazione verde / emissione rossa). Inserire opportuni filtri di densità neutri nel percorso del raggio laser in modo che il CCD non è saturo. Focalizzare l'obiettivo sulla superficiela diapositiva. Regolare la posizione del lato di ricezione della guida di luce quarzo davanti all'obiettivo lanciatore laser, e regolare la posizione della estremità di uscita della guida di luce collegato al microscopio mediante opportuni attuatori sulla epi-fluorescenza condensatore per ottenere centrato ed uniforme illuminazione del campo di vista.
Passo 1.3. Determinare il rumore vibrazionale
Inserire un segno piccola inchiostro nero sulla superficie del vetrino fluorescenza. Registrare l'intensità della luce con NeuroCCD nella modalità di registrazione continua. Mettere a fuoco l'obiettivo su un bordo scuro del marchio inchiostro nero. Registrare l'intensità luminosa per circa 100 msec a 2 kHz di frequenza di fotogrammi. Visualizzare la media spaziale delle tracce frazionari intensità luminosa (Af / F) di ~ 20 pixel che ricevono luce dalla zona illuminata uniformemente e da circa 20 pixel lungo il bordo del marchio inchiostro. Il rumore in eccesso nelle registrazioni da pixel con bordi ad alto contrasto riflette il rumore vibrazionale inil sistema.
Passo 1.4. Vibrazioni isolamento
È obbligatorio per ridurre le vibrazioni utilizzando una tavola di isolamento vibrazioni ad un livello inferiore al rumore di sparo con intensità di luce paragonabili a condizioni di registrazione sperimentali. Regolare la tavola di isolamento delle vibrazioni finché il rumore di vibrazione in dell'intensità luminosa da pixel che coprono il bordo tagliente dell'immagine è trascurabile. Nessuna delle apparecchiature con parti mobili (persiane, ventilatori meccanici) può essere montato sulla tavola. I cavi dal materiale sulla tavola allegata ad altri componenti che non sono isolati dalle vibrazioni devono essere allentato in modo che non trasmettono vibrazioni meccaniche al microscopio.
2. Selezione di un Neuron Adeguato per V m-Imaging
Passo 2.1. Selezione di neuroni
Rendere fettine cerebrali secondo procedure standard. Utilizzare una linea di topi esprimono EGFP in singole cellule nervose di iINTERESSE. Con un sistema di rotazione del disco confocale, visualizzare i neuroni EGFP marcati nella sezione. Selezionare neuroni per V m-imaging con intatte dendritiche / assonale alberi, e con processi parallelo e vicino alla superficie della fetta. Ciò non può essere realizzato in topi selvatici perché assoni e dendriti sottili, per la maggior parte, non sono visibili in modalità microscopia DIC.
3. Neuroni di carico con tensione sensibile Dye
Passo 3.1. Riempimento della pipetta di patch
Riempire pipette di patch vetro dalla punta con colorante senza soluzione intracellulare applicando pressione negativa per circa 15 s fino a 2/3 del cono dell'elettrodo. La soluzione colorante libero in punta è necessaria per evitare la fuoriuscita del colorante sulla fetta che aumenta la fluorescenza di fondo e riduce drasticamente rapporto segnale-rumore. Back-riempire l'elettrodo con la soluzione contenente il colorante impermeant membrana sensibile tensione JPW3028 discioltoin soluzione intracellulare (0,8 mM).
JPW3028, la sonda di tensione di maggior successo per l'applicazione intracellulare, è un analogo doppiamente carica positiva del ANEP serie di coloranti lipofili stirilici ancora sufficientemente solubile in acqua da utilizzare per microiniezione. Il di-etil analogica di questo colorante è praticamente identiche caratteristiche (inclusa la tensione-sensibilità) ed è disponibile in commercio come JPW1114 (vedi Tabella 1). Prepariamo soluzione stock 20 mM in acqua distillata H 2 O. Aliquote di 50 microlitri della soluzione stock sono conservati congelati a -20 ° C. Per la concentrazione di colorante finale di 0,8 mM, 2 ml di soluzione madre viene sciolto in 50 ml di soluzione intracellulare nel giorno dell'esperimento. La soluzione colorante magazzino è stabile e può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi. Pertanto, manteniamo uno aliquota 50 microlitri a temperatura ambiente fino al suo esaurimento.
Passo 3.2. Stabilire una giga-sigillo in fretta
Passo 3.3. Monitorare il livello di colorazione
Durante la diffusione colorante nella configurazione whole-cell, monitorare lo stato fisiologico del neurone registrando potenziali d'azione evocati in current-clamp mode. Inoltre, controllare la quantità di colorazione registrando l'intensità della luce di riposo (RLI) dal soma cellulare a un frame rate di 2 k Hz e ad una frazione di intensità luminosa piena regolata con filtri a densità neutra (usiamo 0,04% dell'intensità della luce laser da un laser 400 mW). Continuare il processo di tintura carico fino al potenziale di azione inizia ad ampliare, di solito dopo 20-40 minuti, a seconda della dimensione e resistenza dell'elettrodo.
L'ampliamento del picco è completamente reversibile e molto probabilmente a causa dell'effetto di carico capacitivo della concentrazione del colorante saturi nella membrana somatica. La forma d'onda del picco viene completamente ripristinata dopo la concentrazione di colorante è equilibrata tutto il neurone.
Passo 3.4. Rimuovere l'elettrodo colorante
Alla fine del periodo di colorazione, tirare la pipetta cerotto dalla soma in configurazione voltage clamp garantire che la transizione da cellule intere di fuori-out configurazione patch viene raggiunto nel processo.
Passo 3,5. Attendere per la diffusione colorante
ent "> Incubare la fetta per un ulteriore 1,5-2 ore a temperatura ambiente per permettere la tensione colorante sensibile a diffondersi in processi neuronali. Dopo una notevole quantità di colorante diffonde dal soma in processi dendritiche e assonali, la forma d'onda di l'AP è completamente ristrutturato.4. Registrazione ottica
Passo 4.1. Selezionare un compartimento cellulare per l'imaging
Individuare la soma del neurone colorato con fluorescenza a basso livello di luce e ri-patch il neurone con uno standard (senza colorante) elettrodo patch nell'ambiente DIC. Visualizza processi neuronali sotto il livello di scarsa luminosità a un frame rate di 10-40 Hz in modalità di registrazione continua del CCD per tensione-imaging. Ridurre il livello di luce con filtri a densità neutra al minimo richiesto per visualizzare l'oggetto di interesse. Usiamo 0,01% dell'intensità laser 400 mW durante il posizionamento del neurone macchiato. Utilizzando uno stadio XY, posizionare il processo neuronale di interesse in tegli centro l'area di esposizione. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione con il diaframma parzialmente chiuso fermata campo del microscopio. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione ad alta intensità riduce in modo significativo i danni fotodinamica durante la registrazione.
Passaggio 4.2 segnali Record ottiche relative ai transitori potenziale di membrana
Registrare segnali ottici relativi a punti di accesso backpropagated nei singoli rami dendritici. Registrare segnali ottici relativi punti di accesso nel assone. Registrare segnali ottici legati alla backpropagating AP in spine dendritiche. Utilizzare frame rate adeguate per la ricostruzione accurata della forma d'onda del segnale e mantenere i periodi di registrazione e l'esposizione alla luce ad alta intensità di eccitazione più corti possibile per ridurre al minimo colorante sbianca e danni fotodinamica. Ad esempio, esaminando la sequenza di iniziazione e propagazione dei potenziali d'azione unico nel assone richiede periodi di registrazione di 5-10 msec. L'eccitazione luce intenty durante la registrazione è un compromesso tra il rapporto segnale-rumore, da un lato e il grado di tintura candeggio e danni fotodinamica dall'altro. Usiamo 100% di intensità del laser 400 mW in registrazione da lunghi tratti di assoni quando un'area di 300 micron di diametro è illuminato. Quando la luce di eccitazione è focalizzato ad una zona 30 micron di diametro per l'imaging spina dendritica, usiamo 10-25% dell'intensità della luce laser. La durata della registrazione è un fattore determinante l'intensità ottimale luce di eccitazione; periodi di registrazione più brevi consentono intensità di luce più elevate. L'intensità di illuminazione ottimale è meglio determinata empiricamente per ogni preparazione e le impostazioni di misurazione.
5. Analisi dei dati
Passo 5.1. Correggere i dati grezzi per errori noti
L'analisi e la visualizzazione dei dati sono state effettuate utilizzando il programma NeuroPlex (RedShirtImaging) scritto in IDL (ITT Visual Information Solutioni, Boulder, Colorado) e personalizzati routine di Visual Basic. Nelle condizioni di scarsa luminosità, la fluorescenza di fondo diventa un fattore determinante della Af / F dimensioni del segnale. I dati grezzi sono stati corretti per questo effetto sottraendo la media intensità di fluorescenza di fondo determinato da una zona non colorato sulla fetta. Successivamente, il software di allineamento dei segnali è stato utilizzato per correggere jitter temporale in AP iniziazione e per eventuali piccoli movimenti della preparazione durante media. Nel dominio temporale, segnali di AP sono stati allineati da cross correlazione degli AP elettricamente registrato in ogni prova al segnale di riferimento acquisita all'inizio della media (Figura 1B). Nel dominio spaziale, le immagini sono state allineate in due dimensioni offline per immagine cross-correlazione per compensare eventuali piccoli movimenti laterali della preparazione. La corretta messa a fuoco dell'immagine nel z-dimensione è stato verificato prima di ogni prova individuale; smal rettifiche l erano spesso necessario. I segnali spazialmente e temporalmente allineati stati mediati come mostrato in figura 1B. Lenti cambiamenti di intensità luminosa dovuta allo sbiancamento del colorante sono stati corretti dividendo i dati da un opportuno duplice funzione esponenziale derivata dagli studi di registrazione senza stimolazione (Figura 1B). La forma d'onda del segnale di AP è stato ricostruito da un insieme di punti di dati utilizzando Cubic Spline interpolazione, una curva continua a tratti passante per ciascun punto di dati. Per confermare che la tensione di segnale sensibile colorante tracce potenziale di membrana senza distorsione significativa alla scala temporale millisecondo, il segnale elettrico dal soma AP è stato confrontato con il segnale ottico AP dal poggio assone adiacente come mostrato in figura 3B. I due segnali si sovrappongono molto da vicino, consentendo il rumore colpo ottico di registrazione.
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Figura 1. Analisi dei dati (Animazione). (A) Pannello superiore: immagine ad alta risoluzione confocale macchiato di un neurone con assone nella posizione di registrazione. Elettrodo di registrazione allegata alla soma ed extracellulare elettrodo stimolante accanto dendrite basale schematizzato. I potenziali d'azione evocati da extracellulare, la stimolazione sinaptica. Pannello inferiore: immagine a bassa risoluzione spaziale di fluorescenza della assone ottenuta con CCD utilizzata per l'imaging V m (B) registrazioni elettrodo da soma (tracce nere), registrazioni ottiche da AIS (tracce rosse) e dal nodo di Ranvier (tracce verdi). . Tracce Top: i dati grezzi da 9 studi che mostrano il jitter temporale in AP iniziazione. Seconda fila di tracce: allineato temporalmente segnali. Terza fila di tracce: segnale medio. Quarta fila di tracce: correzione candeggina. Tracce di fondo: interpolazione spline cubica con un passaggio di smoothing temporale.
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Representative Results
Successo microscopia confocale dovrebbe consentire una chiara identificazione dei processi neuronali intatti che sono vicino alla superficie della fetta e situato in un piano di messa a fuoco. La selezione delle cellule nervose che sono appropriate per l'imaging di tensione prima della voltaggio-dipendenti carico colorante è fondamentale. Un esempio di immagini confocali di L5 neuroni piramidali esprimono EGFP in una fetta corticale (Crym transgenico linea mouse) è mostrato in Figura 2. Gli assoni dei neuroni singoli sono chiaramente visibili. Cellule con lunghi assoni intatte (frecce bianche) in un piano di messa a fuoco vicino alla superficie della fetta sono stati selezionati.
Figura 2. Selezione L5 neuroni corticali di V m-imaging di segnali di AP assoni. Basso (a sinistra) e alta (a destra) le immagini ingrandimento della regione stessa porzione di eccitazione; 488 nm, usando Yokogawafilatura scanner disco.
Il modello spaziale di Na-canale di clustering nel segmento iniziale dell'assone (AIS) gioca un ruolo critico in sintonia computazioni neuronali e variazioni Na-canale di distribuzione hanno dimostrato di mediare nuove forme di plasticità neuronale nel assone. Tuttavia, i dati sulla distribuzione immunocitochimiche canale non può direttamente predire le caratteristiche spazio-temporali di innesco del potenziale d'azione, e le misure prima elettrofisiologiche sono o indiretti (extracellulare) o non hanno sufficiente risoluzione spaziale (intracellulare) per caratterizzare direttamente la zona trigger picco (TZ). Un miglioramento critica metodologica nella sensibilità della tecnica di imaging potenziale di membrana descritta qui consente la determinazione diretta della posizione e la lunghezza del TZ picco come definito in termini funzionali. Un esempio di registrazione AP segnali ad alta risoluzione spaziale e temporale è mostrato in Figura 3. Figura 3B illustra chela sensibilità disposizione di V m-imaging era sufficiente per monitorare la depolarizzazione sottosoglia precede il segnale rigenerativa AP. Inoltre, il confronto dei segnali ottici AP dal soma / assone poggio e da un nodo di Ranvier più distale AP hanno confermato che la dinamica marcatamente differenti a queste due posizioni 8, 15, sia la salita e la discesa del AP era più veloce in il nodo di Ranvier. Per dettagli su limiti di risoluzione spazio-temporali nelle misure della dimensione e della posizione del TZ spike vedi figure 3 e 5 in Popovic et al. (2011).
Figura 3. Segnali d'azione potenziali assone. (A) Pannello superiore: immagine ad alta risoluzione confocale di un neurone corticale L5 caricato con la tensione di colorante sensibile con assoni in posizione di registrazione; proiezione from un z-pila di immagini confocale. Registrazione / elettrodo stimolante cerotto attaccato al soma. Pannello inferiore: bassa risoluzione spaziale immagine di fluorescenza della assone ottenuta con CCD utilizzati per V m-imaging. (B) segnali di AP relativi registrati a un frame rate di 10 kHz. Tracce sulla destra: AP transitori di tre posizioni: 1-elettrodo di registrazione da soma; 2-ottico di registrazione da assone poggio, 3-ottico di registrazione dal primo nodo di Ranvier. Tracce di fondo: sovrapposizione segnale dalle stesse tre posizioni.
L'interazione non lineare tra i potenziali postsinaptico eccitatorio (EPSPs) e BAPS nei dendriti che è responsabile per l'induzione di LTP non è pienamente compresa. Questa interazione dipende criticamente l'ampiezza dei due segnali e deve, pertanto, essere spazialmente non uniforme. La prova sperimentale di questa previsione richiede misurazioni spazialmente ben risolti che non sono stati eseguiti a causa rami dendritici di piccolo diametro, non sonoccessible alle misurazioni elettrodi. Il potenziale di membrana tecnica di imaging qui descritta permette il monitoraggio dei segnali elettrici da più posizioni del pergolato dendritico intera come mostrato in Figura 4. Il modello di attività BAP nel dendritica pergolato è caratterizzato da picchi di corrente di sodio dominato nelle regioni prossimali che gradualmente cambiato il calcio prolungato attuale dominato depolarizzante eventi in dendriti distali.
Figura 4. Segnali di potenziali d'azione da più posizioni sul pergolato dendritico di un neurone corticale L5. Sinistra: immagine ad alta risoluzione di un neurone corticale L5 caricato con una tensione di colorante sensibile; proiezione da un z-pila di immagini confocale. Pannello di destra: una raffica di 4 AP avviate a 100 Hz da brevi impulsi di corrente depolarizzante (linea di fondo) consegnati al soma. Backpropagating unction potenziali segnali provenienti da sei punti selezionati (1-6) lungo i dendriti apicali e obliquo. Tracce da 1 a 3 sono stati ottenuti da una registrazione di prova singola. Traccia 4 è una media di prova quattro, mentre tracce 5 e 6 sono sedici medie prova.
L'ipotesi che le spine hanno un ruolo elettrica di modificare l'efficacia sinaptica che è alla base di plasticità e, eventualmente, meccanismi di apprendimento e la memoria ha recentemente ricevuto una notevole attenzione per le sue implicazioni critiche per la funzione del cervello (Yuste, 2010). Vi è, tuttavia, ben poche prove dirette sperimentali a favore o contro questa ipotesi. Le incertezze nell'interpretazione dei risultati indiretti e la mancanza di prove dirette sul comportamento elettrico di spine dendritiche sono dovuti principalmente a una limitazione metodologica - spine sono piccole e non accessibili ai metodi convenzionali di elettrofisiologia. Così, i tentativi di indagare su questo problema, in assenza di dati sperimentali dedottisimulazioni al computer con le stime dei parametri elettrici in base alla morfologia della colonna vertebrale e le proprietà diffusionali del collo colonna vertebrale. La tensione-imaging procedura qui descritta consente di monitorare i segnali azione ei potenziali segnali sinaptici alla scala spaziale delle spine dendritiche individuali con alta sensibilità. Gli esperimenti possono essere progettati per testare direttamente le previsioni teoriche fondamentali sul comportamento elettrico di spine dendritiche. Un esempio di segnali ottici relativi agli AP backpropagating in una spina dendritica individuo e la sua dendrite madre è mostrato in Figura 5.
Figura 5. Segnali d'azione potenziali da una spina dendritica individuale. Pannelli di sinistra: micrografie superiori - ricostruzioni anatomiche ottenuti da una pila di immagini confocali spinning-disk. Minori micrografie - fluorescence immagini della stessa regione ottenuta con la camera CCD per V m-imaging. Pannello di destra: L'intensità della fluorescenza traccia corrispondente al BAP da postazioni 1-3 delineati sulle immagini CCD. Medie temporali di 9 prove. In basso traccia: le registrazioni degli elettrodi dal soma. Notare che traccia 3 da un'area senza una spina dorsale non ha segnale indicante detectible basso livello di dispersione della luce nello strato superficiale della fetta.
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Discussion
Questo articolo descrive un voltaggio-dipendenti metodo di registrazione colorante per monitorare l'attività elettrica dei neuroni individuali con sub-micrometrica e sub-millisecondo risoluzione spazio-temporale. Eccitazione laser a lunghezza d'onda quasi ottimale (considerando le dimensioni segnale) migliorato la sensibilità di registrazione di un fattore ~ 50 rispetto agli approcci precedenti. La sensibilità attuale consente il monitoraggio dei segnali elettrici da tutte le parti di neuroni individuali, tra cui dendriti, assoni, collaterali e terminali assone assone così come spine dendritiche individuali. Con sensibilità attuale, registrazioni di transienti potenziale di membrana può essere effettuata a velocità di trasmissione fino a 20 kHz. Medio del segnale modesta (4-25 trials) può facilmente migliorare la sensibilità di registrazione espresso come il rapporto segnale-rumore di un fattore 2-5. Il limite principale di imaging tensione è la mancanza di semplice taratura di segnali ottici da più posizioni su una scala di tensione assoluta. In una certa preparaziones questo può essere risolto trovando un segnale di potenziale di membrana che ha una ampiezza nota in tutte le posizioni. Segnali di AP nel assone e in alcuni dendriti completamente eccitabili 6 fornire un eccellente livello di calibrazione.
Passaggi critici nell'applicazione di questa metodologia sono:
- Ridurre al minimo gli effetti di diffusione della luce limitando le registrazioni ai neuroni situati in prossimità della superficie di fette di cervello acuto (<30 micron). Questo richiede ottimale la tranciatura per ottenere un'alta percentuale di neuroni sani nello strato superiore della fetta 1.
- Ottimizzare la quantità di soluzione limpida nella punta dell'elettrodo per erogare il colorante per assicurare un rapido caricamento dei neuroni.
- Eliminare le vibrazioni meccaniche della preparazione che può essere una fonte di rumore in eccesso di registrazione ottico.
- Impiegando basso rumore onda continua (CW) laser con il rumore RMS di ampiezza <0,5% come fonte di excitazione luce.
- Controllare danni fotodinamica selezionando appropriata intensità della luce di eccitazione rispetto alla durata del periodo di registrazione e separando le registrazioni successive da punti scuri. Periodi di registrazione più lunghi necessitano di intensità di luce inferiore per evitare danni fotodinamica.
Gli esempi di registrazione sopra riportati indicano un punto di svolta nella colonna vertebrale e fisiologia assone. Queste registrazioni rivelano la notevole potenza di essere in grado di registrare direttamente eventi elettrici che potevano essere analizzati sul piano teorico in passato.
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Disclosures
Dejan Zecevic dichiara che si tratta di un co-proprietario della RedShirtImaging LLC., Una società specializzata in alta velocità, a basso rumore telecamere CCD utilizzati in voltaggio-dipendenti registrazione colorante. Tutti gli altri autori non riportano interessi finanziari o potenziali conflitti di interesse legati allo studio corrente.
Acknowledgments
Siamo grati ai nostri collaboratori Knut Holthoff, Arthur Konnerth e Marco Canepari che hanno partecipato allo sviluppo iniziale di questa tecnica e per Leslie M. Loew per la gentile fornitura di coloranti. Supportato da NSF concedere IOS-0817969, sovvenzioni NIH NS068407 e M136043 e Kavli Istituto di Neuroscienze all'Università di Yale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
