Summary
Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.
Abstract
Biyofiziksel özellikleri ve tek nöronların fonksiyonel organizasyon anlama ve nasıl işlem bilgileri beynin nasıl çalıştığını anlamak için esastır. Herhangi bir sinir hücresinin temel işlevi, genellikle birden fazla kaynaktan gelen elektrik sinyalleri, işlemek için. Nöronal süreçlerin elektriksel özellikleri detaylı ölçümler yokluğunda tahmin etmek için olağanüstü, kompleks dinamik ve genel durumda, imkansızdır. Biri olur böyle bir ölçüm elde etmek için, ideal, onlar nöronal süreçleri ve aksiyon potansiyeli inisiyasyon etkileme belirli yerlerde summate ilgili menşe sitelerinden giderken, birçok bölgeden, eşikaltı olayları izlemek edebilmek istiyorum. Bu hedef elektrotlar istihdam ölçümleri teknik sınırlamaları nedeniyle herhangi bir nöron elde edilmemiştir. Bu dezavantajı ortadan kaldırmak için, bu geniş paralel recordin izin görüntüleme teknikleri ile yama elektrot yaklaşımı tamamlayıcı çok arzulanan bir durumdurBir nöronun her yerinden gs. Alt-milisaniye ve alt-mikrometre çözünürlük ile karakterize - Organik voltaj duyarlı boyalar (V m-görüntüleme) ile membran potansiyeli Transientlerin optik kayıt - İşte, biz böyle bir tekniği tanımlar. Bizim metodumuz voltaj duyarlı moleküler problar 2 öncü çalışmalarına dayanmaktadır. İlk teknolojinin birçok yönü sürekli onlarca yıl 3, 5, 11 den fazla geliştirilmiştir. Ayrıca, daha önceki çalışmaları V m-görüntülemenin iki temel özellikleri belgelenmiştir. Öncelikle, floresan sinyalleri tüm fizyolojik aralığı (; 10, 14, 16 +100 mV -100 mV) üzerinde membran potansiyeli doğrusal orantılıdır. İkincisi, burada kullanılan voltaj duyarlı boya (JPW 3028) ile yükleme nöronlar saptanabilir farmakolojik etkisi yoktur. Kaydedilen boya yükleme sırasında başak genişletilmesi, 7 4 tamamen düzelir. Buna ek olarak, deneysel kanıtlar elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedirherhangi bir tespit fototoksik etkilerini 4 öncesinde kayıt önemli bir sayısını (yüz), 6, 12, 13. Şu anda, biz V m-görüntüleme tekniğinin hassasiyetini maksimize etmek için yakın uygun dalga boyunda bir lazer ışık kaynağı parlaklık ve istikrar yararlanmak. Yürürlükteki duyarlılık akson ve akson teminatlar, terminal dendritik dalları ve bireysel dendritik dikenler içeren bir nöronun her yerinden gelen V m Transientlerin birden fazla site optik kayıtları verir. Sinyal etkileşimleri Elde edilen bilgiler, aynı zamanda, bir film şeklinde doğrudan doğruya görselleştirildiği gibi nicel olarak analiz edilebilir.
Protocol
1. Ekipman Ayarı
1.1 Adım. Görüntüleme kurulum
Voltaj duyarlı boya sinyallerini kayıt etmek anahtarı uygun kurulum tasarımıdır. Biz üç kamera ile donatılmış bir dik mikroskop (BX51WI Olympus veya Zeiss AxioExaminer) kullanın. Kurulum Nikon 60X/1.0 NA veya Zeiss 63X/1.0 NA su daldırma hedefleri kullanarak epi-floresan, geniş alan mikroskopisi modunda ikaz ışığı ile beyin dilimleri aydınlatıcı bireysel nöronlar için tasarlanmıştır. Bizim mikroskoplar bir titreşim izolasyonu tabloya cıvatalı ve motorlu hareketli aşamaları ile donatılmıştır. Her bir mikroskop üç kamera portu ile donatılmıştır. Bir kamera bağlantı noktası Video-mikroskopi (IR-1000, Dage MTI, ABD) kızılötesi DIC için standart bir yüksek uzaysal çözünürlüklü CCD kameraya sahiptir. İkinci kamera bağlantı noktası nispeten düşük uzaysal çözünürlüğü (80 x 80 piksel) ama olağanüstü dinamik aralık (14 bit) ve okunması son derece düşük hızlı veri toplama makinesi (20 kHz'e kadar kare hızı) vargürültü (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Için konfokal görüntüleri z yığınları toplamak için kullanılan bir iplik-disk konfokal tarayıcı (CSU-10, Yokogawa, Japonya) üzerine monte; üçüncü kamera bağlantı noktası yüksek uzaysal çözünürlüklü bir CCD kamera (PCO AG, Almanya PixelFly, 1392x1024 piksel) sahip lekeli hücrenin ayrıntılı morfolojik rekonstrüksiyonu. Bir frekans katlamalı diyot pompalı Nd: 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Çin) de YVO4 sürekli dalga lazer (400 mW) yayan uyarma ışık kaynağıdır. Çekim (LS6; Vincent Associates) tarafından kapı 2 mm çapında lazer ışını arkasına diyafram doldurmayın için tasarlanmış bir tek portlu Epifloresans kondansatör (Fotonik GmbH, Gräfelfing KADAR, Almanya) aracılığıyla mikroskop birleştiğinde bir ışık kılavuzu yönlendirilir objektif ve nesne düzlemi Eşit aydınlatmalı yakınında sağlayabilir. Lazer ışını tarafından V m-görüntüleme maksimize etmek için geleneksel bir Xenon ark lambası yerine kullanılmaktadır: (1) bir tek renkli ex kullanılarakboya 9, 10, (2), bir yay-lamba ile elde edilebilir seviyesinin ötesinde uyarma ışığın yoğunluğunu arttırmak V m maksimize etmek için absorbsiyon spektrumu ve kırmızı kanat alıntı ışık. Uyarma ışığı 560 nm ve kaydedilmiş bir floresan ışık 610 nm bariyer filtre (a Schott RG610) geçirildi ve bir orta dalga boyuna sahip bir dikroik ayna tarafından hazırlama yansıtılmıştır. Işık yoğunluğundaki artış ve en iyiye yakın monokromatik uyarma dalgaboyu kullanımının kombine etkisi önceki ölçümleri 6 kıyasla yaklaşık 50 kat gerilim görüntüleme duyarlılığı dramatik bir gelişme oldu.
1.2 Adım. Üniforma aydınlatma için ayarlama
Bir floresan slayt standart (yeşil uyarma / kırmızı salma) kullanın. CCD doymuş değil böylece lazer ışını yolu uygun nötral yoğunluk filtreleri takın. Yüzeyinde hedef Odakslayt. Lazer başlatıcısı objektif önünde kuvars ışık kılavuz alma ucunun konumunu ayarlayın ve elde etmek için epi-floresan kondenser üzerindeki uygun aktüatörleri kullanarak mikroskop bağlı ışık kılavuz çıktısı sonu konumunu ayarlamak merkezli ve üniforma görüş alanının aydınlatılması.
1.3 Adım. Titreşim gürültü belirleme
Floresan kayar yüzeyi üzerinde bir küçük siyah mürekkep işareti koyun. Sürekli kayıt modunda NeuroCCD ile Tutanak ışık şiddeti. Siyah mürekkep işareti karanlık bir kenarında objektif odaklanın. 2 kHz kare hızında yaklaşık 100 msn için ışık yoğunluğu kaydedin. Üniform aydınlatılan alandan ve mürekkep işareti kenarındaki ~ 20 piksel arasında ışık alma ~ 20 piksel arasında kesirli ışık yoğunluğunu izleri (hızındaki / F) mekansal ortalama görüntüleyin. Yüksek kontrastlı kenarları piksel kayıtlarında aşırı gürültü titreşim gürültüsü yansıtırsistem.
1.4 Adım. Titreşim izolasyonu
Bu deneysel kayıt koşullarına karşılaştırılabilir ışık şiddetlerinde atış gürültü altında bir seviyeye bir titreşim izolasyonu tablosunu kullanarak titreşimleri azaltmak için zorunludur. Görüntünün keskin kenar kapsayan piksel ışık yoğunluğundaki titreşim gürültü ihmal edilebilir kadar titreşim izolasyonu masa ayarlayın. Hareketli parçaları (mekanik panjurlar, fanlar) ile ekipmanlardan hiçbiri masaya monte edilebilir. Titreşim izole olmayan diğer bileşenlere bağlı masaya donanımdan gelen kabloların mikroskop mekanik titreşimlerin iletimi olmadığı gevşek öyle olmalı.
2. V m-Imaging için Uygun Nöron seçimi
2.1 Adım. Nöronların seçimi
Standart prosedürlere göre beyin dilimleri olun. I tek tek sinir hücreleri EGFP ifade bir fare hattı kullanınfaiz. Bir dönen diske konfokal sistemi ile, dilim EGFP etiketli nöronlar görselleştirmek. Bozulmamış aksonal / dendritik ağaçları ile V m-görüntüleme için nöronlar seçin ve süreçlerin dilim yüzeyine paralel ve yakın çalışan. Akson ve ince dendritler, çoğunlukla, DIC mikroskop modunda görünür değildir çünkü bu wild-tip farelerde başarılı olamaz.
3. Voltaj duyarlı Boya ile yüklüyor Nöronlar
3.1 Adım. Yama pipet Dolum
Elektrot konik 2/3 'ü kadar yaklaşık 15 s için negatif bir basınç uygulayarak boya serbest hücre içi solüsyon ile ikinci ucu cam pipet yama doldurun. Uç boya serbest çözelti eşiğe artar ve önemli ölçüde sinyal gürültü oranı azalır dilim üzerine boya dökülme önlemek için gereklidir. Çözünmüş Membran geçirgenliği olmayan voltaj duyarlı boya JPW3028 içeren solüsyonu ile elektrot Back-dolguHücre içi çözelti (0.8 mM).
JPW3028, hücre içi uygulama için en çok başarılı gerilim probu, yine mikroenjeksiyon için kullanılmak üzere yeterince çözünür su lipofilik stiril boyaların ANEP dizi iki kat bir pozitif yüklü bir analoğudur. Bu boya di-etil analog ve hemen hemen aynı özellikleri (voltaj-duyarlılık dahil olmak üzere) ve JPW1114 (bkz. Tablo 1) gibi ticari olarak temin edilebilir. Biz distile H 2 O 20 mM stok solüsyonu hazırlamak Stok çözelti 50 ul hacimde -20 ° C de donduruldu tutulur 0.8 mM nihai konsantrasyon boya için, stok solüsyonu 2 ul deney gününde hücre içi çözelti 50 ul içinde çözülür. Stok boya çözeltisi sabittir ve birkaç ay süreyle oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. Bu tükenene kadar Böylece, oda sıcaklığında bir 50 ul kısım tutun.
3.2 Adım. Hızlı bir giga-mühür Kurmak
3.3 Adım. Boyama düzeyinin izlenmesi
Tam hücreli yapılandırmada boya difüzyon sırasında, akım-klemp modunda uyarılmış aksiyon potansiyelleri kaydederek nöronun fizyolojik durumunu izlemek. Ayrıca, 2 k bir kare hızında hücre soma gelen dinlenme ışık yoğunluğunu (RLI) kaydederek boyanma miktarını izlemek Hz ve nötral yoğunluk filtreleri (biz bir 400 mW lazer lazer ışık şiddetinin% 0.04 kullanan) ile düzeltilmiş tam ışık şiddetinin bir kısmını. Aksiyon potansiyeli elektrot boyutu ve direnç bağlı olarak genellikle 20-40 dakika sonra, genişletmek başlayana kadar boya yükleme işlemi devam edin.
Başak genişletilmesi tamamen geri dönüşümlü ve somatik membran boya doymuş konsantrasyonunun kapasitif yük etkisi nedeniyle büyük olasılıkla. Boya konsantrasyonu nöron boyunca dengelenmiş sonra başak dalga tam olarak geri kazanılır.
3.4 Adım. Boya elektrot çıkarın
Dönem boyanma sonunda, dikkatli bir şekilde dış çıkış yama konfigürasyonu için tüm-hücre geçiş işleminde elde edilmesini sağlamak voltaj kelepçesi konfigürasyonda soma uzağa yama pipet çekin.
3.5 Adım. Boya difüzyon bekleyin
ent "> nöronal işlemleri içine yaymak için voltaj duyarlı boya için izin vermek üzere, oda sıcaklığında ilave 1.5-2 saat için inkübe dilim. aksonal ve dentritik süreçleri, dalga içine soma uzak boya difüze önemli bir miktarda sonra AP tamamen restore edilmiştir.4. Optik Kayıt
4.1 Adım. Görüntüleme için hücresel bir bölme seçin
Düşük ışık seviyeli floresans ve yeniden yama DIC altında bir standart (hayır boya) yama elektrot ile nöron altında lekeli nöronun soma bulun. Voltaj görüntüleme için CCD sürekli kayıt modunda 10-40 Hz kare hızı düşük ışık seviyesinin altında nöronal süreçleri gözünüzde canlandırın. Ilgi nesnesi görselleştirmek için gerekli minimum nötral yoğunluk filtreleri ile ışık seviyesini azaltın. Biz lekeli nöronun konumlandırma sırasında 400 mW lazer yoğunluğu 0.01% kullanabilirsiniz. Bir XY tablası kullanma, t ilgi nöronal süreci konumlandırmakgörüntüleme alanının ortasına diye. Mikroskop kısmen kapalı alana durak iris kullanarak uyarma ışık soma koruyun. Yüksek yoğunluklu uyarma ışık soma Koruyucu anlamlı kayıt sırasında fotodinamik hasarı azaltacaktır.
Membran potansiyeli transientler ilgili 4.2 Tutanak optik sinyalleri Adım
Bireysel dendritik dallarında backpropagated AP'ler ilgili optik sinyalleri kaydedin. Akson AP'ler ilgili optik sinyalleri kaydedin. Dendritik dikenler aplar backpropagating ilgili optik sinyalleri kaydedin. Sinyali dalga doğru rekonstrüksiyonu için uygun kare hızları kullanın ve ağartma boya ve fotodinamik hasarı en aza indirmek için kayıt dönemleri ve yüksek yoğunluklu uyarma ışığa maruz kalma mümkün olduğunca kısa tutun. Örneğin, akson tek aksiyon potansiyeli oluşumu ve ilerlemesi sırasını inceleyerek 5-10 msn kayıt süreleri gerektirir. Uyarma ışık yoğunluklarıkayıt sırasında lik bir taraftan, sinyal-gürültü oranı ve boya ağartma derecesi ve diğer taraftan fotodinamik hasarı arasında bir uzlaşmadır. Biz çapı 300 mikron bir alan aydınlatılır aksonların uzun bölümler arasından kayıt 400 mW lazer yoğunluğu% 100 kullanmaktır. Uyarma ışık dendritik omurga görüntüleme için 30 mikron çaplı alana odaklandığı zaman, biz lazer ışık yoğunluğunu% 10-25 oranında kullanın. Kayıt gerekli süresinin optimum uyarma ışık yoğunluğu önemli bir belirleyicisi olduğunu; kısa kayıt süreleri daha yüksek ışık yoğunluğuna izin verir. Optimal ışık yoğunluğu en her bir hazırlama ve ölçüm ayarları için ampirik olarak belirlenir.
5. Veri Analizi
5.1 Adım. Bilinen hatalar için ham verileri düzeltin
Verilerin analizi ve gösterimi IDL (ITT Görsel Bilgi Solut yazılmış NeuroPlex programı (RedShirtImaging) kullanılarak yapılmıştıriyonları, Boulder, Colorado) ve özel bir Visual Basic yordamları. Düşük ışık koşulları altında, arka plan floresan hızındaki / F sinyalinin büyüklüğü önemli bir belirleyici olmaktadır. Ham veriler öncelikle dilim üzerinde bir boyanmamış alan belirlenen ortalama floresan yoğunluğu arka plan çıkarılması ile bu etki için düzeltilmiştir. Daha sonra, sinyal hizalama yazılım AP başlatma bölgesindeki zamansal kaymayı yanı sıra ortalama sırasında hazırlanması için olası küçük hareketleri için düzeltmek için kullanılmıştır. Zamansal etki alanında, AP sinyallerinin ortalama başlangıç (Şekil 1B) iktisap referans sinyali her denemede elektriksel olarak kaydedilerek AP çapraz korelasyon hale getirilmiştir. Mekansal etki alanında, görüntülerin hazırlanması olası küçük yanal hareketleri telafi etmek için görüntü çapraz korelasyon iki boyutlu çevrimdışı hizalanmış edildi. Z-boyut görüntünün doğru odaklama her duruşma öncesinde doğrulandı; smal l ayarlamalar çoğu zaman gerekli idi. Şekil 1B 'de gösterildiği gibi uzaysal ve zamansal olarak hizalanmış sinyalleri ortalamaları alınmıştır. Boya ağartma dolayı ışık yoğunluğundaki değişiklik yavaş yok uyarım (Şekil 1B) ile kayıt çalışmalardan elde edilen uygun bir çift üstel fonksiyon tarafından veri bölünmesi ile düzeltilmiştir. AP sinyalin dalga Kübik Spline İnterpolasyon, her veri noktası üzerinden geçen bir parçalı sürekli eğrisi kullanarak veri noktaları bir dizi yeniden inşa edildi. Voltaj-duyarlı boya sinyali milisaniye ölçeğinde önemli bir bozulma olmadan zar potansiyeli parça olduğunu doğrulamak için, soma elde edilen elektrik sinyali AP Şekil 3B 'de gösterildiği gibi bitişik akson tepecik ikinci optik sinyalin AP ile karşılaştırılmıştır. Iki sinyal optik kayıt atış gürültü için izin, çok yakından üst üste.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
Şekil 1. Veri analizi (Animasyon). (A) Üst panel: Kayıt pozisyonunda akson ile lekeli bir nöronun yüksek çözünürlüklü konfokal görüntü. Kayıt elektrot soma ve şematik olarak gösterilmiştir bazal dendrit yanındaki ekstraselüler uyarıcı elektrot bağlı. Aksiyon potansiyelleri ekstraselüler, sinaptik uyarılması tarafından uyarılmış. Alt panel:. V m görüntüleme için kullanılır (B) soma (siyah iz) den Elektrot kayıtları, AIS (kırmızı iz) dan optik kayıtları ve Ranvier düğümü (yeşil iz) den CCD ile elde akson düşük uzaysal çözünürlüğü floresan görüntü . Üst izleri: AP başlamasında zamansal jitter gösteren 9 çalışmalarda elde edilen ham veriler. Izleri İkinci sıra: zamansal sinyalleri hizalanır. Izleri Üçüncü satır: ortalamalı sinyali. Izleri Dördüncü satır: bleach düzeltme. Alt izleri: zamansal yumuşatma tek geçişe sahip kübik spline interpolasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı konfokal mikroskopi dilim yüzeyine yakın ve odak bir düzlemde bulunan bozulmamış nöronal süreçleri net bir şekilde belirlenmesi izin vermelidir. Önce voltaj duyarlı boya yükleme gerilim görüntüleme için uygun olan sinir hücrelerinin seçimi önemlidir. Kortikal bir dilim (Crym transjenik fare çizgisi) olarak ifade EGFP L5 piramidal nöronların konfokal görüntüleri bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Bireysel nöronların akson açıkça görülebilir. Dilim yüzeyine yakın bir odak düzlem içinde bozulmadan uzun aksonlar (beyaz oklar) ile hücreler seçildi.
Şekil 2. Aksonlardan AP sinyal V m-görüntüleme için L5 kortikal nöronlarda seçimi. Aynı dilim bölgenin Düşük (solda) ve yüksek (sağ) büyütmede görüntüleri; 488 nm eksitasyon Yokogawa kullanarakDisk tarayıcı iplik.
Akson başlangıç segmentinde Na-kanal kümelenme mekansal desen (AIS) akson nöronal plastisite yeni biçimleri arabuluculuk gösterilmiştir nöronal hesaplamaları ve Na-dağıtım kanalı değişiklikler ayarlama önemli bir rol oynar. Ancak, dağıtım kanalı üzerinde immünohistokimyasal verileri doğrudan aksiyon potansiyeli inisiyasyon zamanmekansal özelliklerini tahmin olmayabilir ve önceden elektrofizyolojik önlemler ya da dolaylı olarak (ekstraselüler) veya doğrudan başak tetikleyici bölge (TZ) karakterize etmek için yeterli uzaysal çözünürlük (hücre içi) yoksundur. Burada açıklanan membran potansiyeli görüntüleme yönteminin duyarlılığını kritik bir yöntem iyileşme fonksiyonel olarak tanımlandığı gibi başak TZ konumu ve uzunluğu direkt belirlenmesine olanak tanır. Yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte AP sinyal kaydederken bir örneği Şekil 3'te gösterilmektedir. Şekil 3B olduğunu göstermektedirV m-görüntüleme kullanılabilir hassasiyet rejeneratif AP sinyal önceki eşikaltı depolarizasyon doğru izlenmesi için yeterli oldu. Ayrıca, soma / akson hillock gelen ve Ranvier daha distal düğümden optik AP sinyallerin karşılaştırılması AP'ler bu iki yerle 8, 15 belirgin farklı dinamikleri olduğunu doğruladı; yukarı doğru vuruş ve AP alt çizgi hem de daha hızlıydı Ranvier düğümü. Başak TZ boyut ve pozisyon ölçümleri zamanmekansal çözünürlük sınırları hakkında ayrıntılar Şekil 3 ve Popoviç 5 ark. (2011) için bkz.
Akson Şekil 3. Aksiyon potansiyeli sinyalleri. (A) Üst panel: kayıt konumunda akson ile voltaj duyarlı boya ile yüklü bir L5 kortikal nöron yüksek çözünürlüklü konfokal görüntü; projeksiyon from konfokal görüntüleri bir z-yığını. Kaydetme / soma bağlı yama elektrot uyarıcı. Alt panel: V m-görüntüleme için kullanılan CCD ile elde akson düşük uzaysal çözünürlüğü floresan görüntü. (B) AP ilgili sinyallerin 10 kHz kare hızında kaydedilir. Sağdaki İzler: üç yerden AP transientler: soma 1-elektrod kayıt; akson hillock 2-optik kayıt; Ranvier ilk düğümden 3-optik kayıt. Alt izleri: Aynı üç yerden sinyal Superimposed.
LTP indüksiyon sorumludur dendritlerindeki eksitatör postsinaptik potansiyelleri (EPSPS) ve BAPS arasındaki doğrusal olmayan etkileşim tam anlaşılır değildir. Bu etkileşim, her ikisi de sinyallerin genlik kritik olarak ve bu nedenle, uzaysal olarak düzgün olmayan olmalıdır. Küçük çaplı dendritik dalları değildir çünkü bu öngörü deneysel testi yapılmış değil mekansal düzeldi ölçümleri gerektirirelektrot ölçümlere ccessible. Şekil 4'te gösterildiği gibi Burada anlatılan membran potansiyeli görüntüleme tekniği tüm dendritik çardak içinde birkaç yerden elektriksel sinyalleşme izlenmesine olanak sağlar. Dendritik Arbor BAP aktivite model distal dendrit etkinlikleri depolarize baskın kademeli olarak akım uzun kalsiyum ile değiştirilmiş proksimal bölgelerinde sodyum akımı baskın çizgiler ile karakterize edilir.
Şekil 4. Bir L5 kortikal nöron dendritik çardak üzerinde birden çok konumdan Aksiyon potansiyeli sinyalleri. Sol panel: bir voltaj duyarlı boya ile yüklü bir L5 kortikal nöron yüksek çözünürlüklü görüntü; konfokal görüntüleri z yığından projeksiyon. Sağ panel: soma teslim kısa depolarizan akım darbeleri (alt iz) ile 100 Hz'de başlatılan 4 AP bir patlama. Bir Backpropagatingapikal ve eğik dendritler boyunca seçilen altı konumları (1-6) den ction potansiyeli sinyalleri. 3 arasındaki izler 1 tek bir deneme kayıt elde edildi. Izleri 5 ve 6 onaltı deneme ortalamaları ise Trace 4, dört deneme ortalamasıdır.
Dikenler altında yatan plastisite ve muhtemelen öğrenme ve bellek mekanizmaları son zamanlarda çünkü beyin fonksiyonu için eleştirel etkileri (Yuste, 2010) büyük ilgi aldığını sinaptik etkinliği değiştirerek bir elektrik role sahip olduğu hipotezi. Lehine veya bu hipoteze karşı çok az doğrudan deneysel kanıt, ancak var. Dolaylı sonuçların yorumlanması ve dendritik diken elektriksel davranışları hakkında doğrudan delil eksikliği belirsizlikler öncelikle bir metodolojik sınırlama nedeniyle - dikenleri küçük ve elektrofizyoloji geleneksel yöntemlerle erişilebilir değildir. Böylece, dayanıyordu deneysel veri yokluğunda bu sorunun amacı ile yapılmıştırelektriksel parametrelerin tahminleri ile bilgisayar simülasyonları omurga morfolojisi ve omurganın boyun difüzyonal özelliklerine dayanır. Burada anlatılan voltaj görüntüleme yaklaşımı yüksek hassasiyet ile bireysel dendritik diken mekansal ölçekte aksiyon potansiyeli sinyalleri ve sinaptik potansiyel sinyalleri izlemek mümkün kılar. Deneyler artık doğrudan dendritik diken elektriksel davranışı hakkında temel teorik öngörüleri test etmek için tasarlanmış olabilir. Tek bir dendritik omurga ve üst dendrit içinde backpropagating AP ile ilgili optik sinyallerin bir örneği Şekil 5'te gösterilmektedir.
Şekil 5. Bireysel dendritik omurga Aksiyon potansiyeli sinyalleri. Sol panel: Üst mikrograflar - iplik disk konfokal görüntülerin bir yığın elde anatomik rekonstrüksiyon. Alt mikrografikleri - flAynı bölgenin uorescence görüntüleri V m-görüntüleme için CCD kamera ile elde. Sağ panel: Floresan yoğunluğu 1-3 CCD görüntüleri belirtilen konumlardan BAP karşılık gelen izler. 9 çalışmaların Zamansal ortalamalar. Alt iz: soma gelen elektrot kayıtları. Bir omurga olmayan bir alanda iz 3 dilim yüzeysel tabakasında ışık saçılması düşük düzeyde gösteren detectible sinyal yoktur unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, alt-mikrometre ve alt milisaniyelik zamanmekansal çözünürlük ile bireysel nöronların elektriksel aktivitesini izlemek için bir voltaj duyarlı boya kayıt yöntemi açıklanır. Yakın optimum dalgaboyu (sinyal boyutu ile ilgili) de Lazer uyarılma ~ 50 önceki yaklaşımlar üzerinde bir faktör tarafından kayıt hassasiyeti artırıldı. Yürürlükteki duyarlılık dendritler, akson, akson teminatlar ve akson terminallerinin yanı sıra bireysel dendritik dikenler dahil bireysel nöronlar, her yerinden elektrik sinyalleri izler. Mevcut hassasiyet ile, membran potansiyeli geçici kayıtları kadar 20 kHz arasında kare hızında yapılabilir. Modest sinyal ortalaması (4-25 denemeler) kolaylıkla 2-5 bir faktör tarafından sinyal-gürültü oranı olarak ifade kayıt hassasiyeti artırabilir. Gerilim görüntüleme başlıca kısıtlılığı mutlak bir gerilim ölçekte birden çok konumdan optik sinyallerin basit kalibrasyon eksikliğidir. Bazı hazırlıks Bu her yerde bilinen bir genlik olan bir membran potansiyeli sinyal bularak çözülebilir. Akson ve bazı tam heyecanlı dendritler 6 AP sinyalleri mükemmel bir kalibrasyon standart sağlamak.
Bu metodolojinin uygulama Kritik adımlar şunlardır:
- Akut beyin dilimleri (<30 mikron) yüzeyine yakın bulunan nöronlar kayıtları kısıtlayarak ışık saçılması etkileri en aza indirmek. Bu dilim 1'in üst tabaka olarak sağlıklı nöron yüksek bir yüzdesini elde etmek için optimize dilimleme prosedür gereklidir.
- Nöronların hızlı yükleme sağlamak için boya teslim etmek için elektrot ucuna berrak çözelti miktarını optimize etmek.
- Optik kayıt aşırı gürültü kaynağı olabilir hazırlık mekanik titreşim giderilmesi.
- Genlik RMS gürültü ile istihdam düşük gürültü sürekli dalga (CW) lazerleri <ex kaynağı olarak% 0.5atıf ışık.
- Kayıt süresini göre uygun uyarma ışık yoğunluğu seçerek ve karanlık dönemleri izleyen kayıtları ayırarak fotodinamik hasar kontrolü. Daha uzun kayıt süreleri fotodinamik hasarı önlemek için düşük ışık şiddetlerinde gerektirir.
Yukarıda gösterilen kayıt örnekleri omurga ve akson fizyolojisi bir dönüm noktasını gösterir. Bu kayıtlar doğrudan sadece geçmişte teorik gerekçelerle analiz edilebilirdi elektriksel olayları kaydetmek mümkün olmanın olağanüstü gücünü ortaya koymaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dejan Zecevic o LLC RedShirtImaging bir eş sahibi., Voltaj duyarlı boya kayıt kullanılan yüksek hızlı, düşük gürültü CCD kameralar konusunda uzmanlaşmış bir şirket olduğunu beyan eder. Diğer tüm yazarlar hiçbir mali çıkarlarının veya geçerli çalışma ile ilgili potansiyel çıkar çatışmaları rapor.
Acknowledgments
Biz işbirlikçileri nazik boyalar sağlamak için bu tekniğin ilk geliştirme yanı sıra Leslie M. Loew katıldı Knut Holthoff, Arthur Konnerth ve Marco Canepari minnettarız. NSF hibe IOS-0817969, NIH hibe NS068407 ve M136043 tarafından ve Yale Üniversitesi Nörobilim Kavli Enstitüsü tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M.
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
