Summary
يوصف أسلوب التصوير لرصد التغيرات المحتملة للقرار غشاء شبه ميكرومتر المكانية وشبه ميلي ثانية واحدة والزمانية. هذه التقنية، على أساس الإثارة الليزر من الجهد حساسة الأصباغ، يسمح للإشارات القياسات في محاور عصبية والضمانات محوار والفروع الطرفية الجذعية، والعمود الفقري شجيري الفردية.
Abstract
فهم خصائص الفيزيائية الحيوية والتنظيم الوظيفي للخلايا العصبية، وكيف أنها واحدة من المعلومات العملية الأساسية لفهم كيفية عمل الدماغ. وتتمثل المهمة الرئيسية في أي خلية عصبية هو معالجة الإشارات الكهربائية، وعادة من مصادر متعددة. الخواص الكهربائية للعمليات العصبية معقدة للغاية، ودينامية، وأنه في حالة عامة، مستحيلا في غياب قياسات مفصلة. للحصول على مثل هذا القياس أحد أن، من الناحية المثالية، أن تكون قادرة على رصد، في مواقع متعددة، والأحداث دوين العتبة أثناء سفرهم من المواقع الأصلية على العمليات العصبية وsummate في مواقع معينة للتأثير على بدء العمل المحتملين. لم يتم تحقيق هذا الهدف في أي الخلايا العصبية بسبب القيود التقنية من القياسات التي تستخدم الأقطاب الكهربائية. للتغلب على هذا العيب، فمن المرغوب فيه جدا لاستكمال نهج التصحيح الكهربائي مع تقنيات التصوير التي تسمح recordin موازية واسعةع من جميع أجزاء من الخلايا العصبية. هنا، نحن تصف مثل هذه التقنية - تسجيل البصرية من العابرين غشاء المحتملة مع الأصباغ العضوية الجهد حساسة (V-M التصوير) - تتميز الفرعية ميلي ثانية واحدة والقرار شبه ميكرون. ويستند أسلوبنا في العمل الريادي على الجهد حساسة تحقيقات الجزيئية 2. وقد تم العديد من جوانب التكنولوجيا الأولي مواصلة تحسين على مدى عدة عقود 3، 5، 11. بالإضافة إلى ذلك، وثقت الأعمال السابقة سمتين أساسيتين للV-M التصوير. أولا، إشارات مضان تتناسب خطيا إلى غشاء المحتملة على نطاق والفسيولوجية كامل (-100 بالسيارات إلى بالسيارات +100 و 10 و 14 و 16). ثانيا، الخلايا العصبية التحميل مع صبغة حساسة الجهد المستخدمة هنا (JPW 3028) لا يكون لها آثار الدوائية للكشف. توسيع سجلت من ارتفاع أثناء التحميل هو عكسها تماما صبغ 4 و 7. بالإضافة إلى ذلك، تظهر الأدلة التجريبية أنه من الممكن الحصول علىعدد كبير (إلى مئات) من التسجيلات قبل أي تأثيرات السمية الضوئية للكشف 4 و 6 و 12 و 13. في الوقت الحاضر، ونحن الاستفادة من سطوع رائع والاستقرار ليزر مصدر الضوء في شبه الأمثل لتحقيق أقصى قدر الطول الموجي حساسية تقنية M-V التصوير. حساسية الحالي يسمح التسجيلات البصرية متعددة من موقع العابرين م V من جميع أجزاء من الخلايا العصبية، بما في ذلك محاور عصبية والضمانات محوار، شجيري الفروع الطرفية، والعمود الفقري شجيري الفردية. ويمكن تحليل المعلومات المكتسبة على التفاعلات إشارة كميا وكذلك تصور مباشرة في شكل فيلم.
Protocol
1. معدات الإعداد
الخطوة 1.1. التصوير الإعداد
المفتاح لتسجيل إشارات الجهد صبغة حساسة من المناسب تصميم الإعداد. نستخدم المجهر تستقيم (BX51WI أوليمبوس أو AxioExaminer زايس) مجهزة ثلاث كاميرات. تم تصميم الإعداد لإلقاء الضوء على الخلايا العصبية الفردية في ضوء شرائح الدماغ عن طريق الإثارة في برنامج التحصين الموسع، مضان، حقل واسع وضع المجهري باستخدام نيكون 60X/1.0 NA NA المياه أو زايس 63X/1.0 أهداف غمس. وانسحب المجاهر لدينا إلى الاهتزاز جدول العزلة ومجهزة بمحركات مراحل المنقولة. وقد تم تجهيز كل المجهر مع الكاميرا الموانئ الثلاثة. منفذ واحد لديه كاميرا عالية المكانية القياسية كاميرا CCD لقرار DIC الأشعة تحت الحمراء الفيديو المجهري (IR-1000، Dage MTI، الولايات المتحدة الأمريكية). منفذ الكاميرا الثانية له الحصول على البيانات بسرعة الكاميرا (ما يصل إلى 20 كيلو هرتز معدل الإطار) مع القرار المكانية منخفضة نسبيا (80 × 80 بكسل) ولكن النطاق الديناميكي المعلقة (14 بت) ومنخفضة بشكل استثنائي قراءةالضوضاء (NeuroCCD-SM، RedShirtImaging LLC، ديكاتور، GA). منفذ الكاميرا الثالثة يحتوي على كاميرا CCD لقرار مكانية عالية (PixelFly، 1392x1024 بكسل؛ AG PCO، ألمانيا) التي شنت على ماسح ضوئي الغزل القرص مبائر (CSU-10، يوكوجاوا، اليابان) المستخدمة في جمع Z-رزمة من الصور مبائر لل المورفولوجية إعادة الإعمار التفصيلية للخلية الملون. A الصمام الثنائي ضخ التردد الضعف الثانية: YVO4 الليزر موجة مستمرة (400 ميغاواط) في ينبعث منها 532 نانومتر (MLL-III/400 ميغاواط؛ CNI، تشانغ تشون، الصين) هو مصدر للضوء الإثارة. يتم توجيه الضوء إلى جانب دليل للالمجهر عبر مكثف واحد epifluorescence بورت (TILL الضوئيات شركة محدودة، Gräfelfing، ألمانيا) مصمم ليفيض الفتحة الخلفية لل، وقطر 2 مم بواسطة شعاع الليزر بوابات مصراع (فنسنت المنتسبين LS6) الهدف وتوفير الإضاءة موحدة بالقرب من الطائرة الكائن. ويستخدم ضوء الليزر بدلا من مصباح قوس زينون التقليدية لزيادة حساسية V-M التصوير من قبل: (1) باستخدام السابقين أحادي اللونضوء الاقتباس في الجناح الأحمر في طيف الامتصاص لتعظيم V م حساسية من الصبغة 9 و 10 و (2) زيادة شدة الضوء الإثارة بعد المستوى الذي يمكن تحقيقه من خلال مصباح قوس. وقد انعكس ضوء الإثارة في إعداد بواسطة مرآة مزدوج اللون مع طول موجة من 560 نانومتر المركزية وصدر ضوء مسجل مضان من خلال مرشح نانومتر حاجز 610 (أ شوت RG610). وكان الأثر المشترك لزيادة شدة الضوء واستخدام الأمثل بالقرب من موجات الإثارة أحادي اللون تحسن كبير في حساسية التصوير الجهد بمعامل من حوالي 50 بالمقارنة مع القياسات السابقة 6.
الخطوة 1.2. ضبط الإضاءة موحدة
استخدام معيار الشريحة مضان (الإثارة الأخضر / الأحمر الانبعاثات). إدراج المناسبة مرشحات الكثافة محايدة في مسار الشعاع الليزر بحيث لا يتم مشبعة CCD. تركز الهدف على سطحالشريحة. ضبط موضع الطرف المتلقي للدليل ضوء الكوارتز أمام ليزر الهدف قاذفة، وضبط موضع نهاية خرج من نور الهداية تعلق على استخدام المجهر المحركات المناسبة على برنامج التحصين الموسع، مضان المكثف لتحقيق محورها وموحدة الاضاءه من مجال الرؤية.
الخطوة 1.3. تحديد الضوضاء الذبذبات
وضع علامة صغيرة الحبر الأسود على سطح الشريحة مضان. سجل شدة الضوء مع NeuroCCD في وضع التسجيل المتواصل. تركز الهدف على حافة الظلام للعلامة الحبر الأسود. تسجيل شدة الضوء لحوالي 100 ميللي ثانية في 2 كيلو هرتز معدل الإطار. عرض متوسط المكاني للآثار شدة الضوء كسور (ΔF / F) من خلال وحدات تلقي الضوء 20 ~ من المنطقة المضاءة بشكل موحد من خلال وحدات و20 ~ على طول حافة علامة الحبر. الضوضاء الزائدة في التسجيلات من خلال وحدات ذات حواف عالية التباين يعكس الضجيج الذبذبات فيالنظام.
الخطوة 1.4. الاهتزاز العزلة
وهو إلزامي للحد من الاهتزازات باستخدام جدول الاهتزاز والعزل إلى مستوى أقل من الضجيج النار على شدة الضوء مماثلة لظروف التسجيل التجريبية. ضبط الجدول الاهتزاز العزلة حتى الضوضاء الاهتزاز في شدة الضوء من خلال وحدات تغطي حافة حادة من الصورة لا يكاد يذكر. يمكن تركيبه أي من المعدات مع أجزاء متحركة (ميكانيكية مصاريع، والمراوح) على الطاولة. يجب على الكابلات من المعدات على الطاولة الملحقة المكونات الأخرى التي لم يتم عزلها من الاهتزاز حتى يكون فضفاض أنها لا تحيل إلى الاهتزازات الميكانيكية المجهر.
2. اختيار خلية عصبية مناسبة لV-M التصوير
الخطوة 2.1. اختيار الخلايا العصبية
جعل شرائح الدماغ وفقا للإجراءات القياسية. استخدام الماوس خط معربا عن EGFP في الخلايا العصبية الفردية من أناالفوائد. مع نظام القرص الغزل مبائر، تصور الخلايا العصبية المسماة EGFP في شريحة. حدد الخلايا العصبية لV-M التصوير بأشجار شجيري / محور عصبي سليمة، ومع العمليات الجارية موازية وقريبة من سطح شريحة. هذا لا يمكن أن يتحقق في البرية من نوع الفئران لأن محاور عصبية والتشعبات رقيقة، بالنسبة للجزء الأكبر، هي غير مرئية في وضع المجهر DIC.
3. التحميل الخلايا العصبية الحساسة للمع الجهد صبغ
الخطوة 3.1. ملء ماصة التصحيح
ماصات التصحيح ملء كوب من طرف مع صبغة خالية من حل داخل الخلايا من خلال تطبيق الضغط السلبي لحوالي 15 ثانية إلى 3/2 المؤرخ في تفتق الكهربائي. محلول الصبغة مجانا في الطرف ضروري لمنع تسرب الصبغة على شريحة مما يزيد من مضان الخلفية ويقلل بشكل كبير إشارة إلى نسبة الضوضاء. عودة ملء القطب مع محلول يحتوي على الجهد impermeant الصبغة الحساسة غشاء JPW3028 حل في حل داخل الخلايا (0.8 ملم).
JPW3028، التحقيق الجهد الأكثر نجاحا للتطبيق داخل الخلايا، هو التماثلية مضاعفة موجبة الشحنة من سلسلة من الأصباغ ANEP styryl محبة للدهون التي لا تزال المياه القابلة للذوبان بما فيه الكفاية لاستخدامها في حقن مكروي. التناظرية دي إيثيل من هذه الصبغة لها خصائص مماثلة تقريبا (بما في ذلك حساسية الجهد) وهو متوفر تجاريا باسم JPW1114 (انظر الجدول 1). نحن نستعد 20 ملم في محلول المخزون المقطر O. 2 H يتم الاحتفاظ مأخوذة 50 ميكرولتر من محلول المخزون المجمدة في -20 ° C. لتركيز الصبغة النهائية من 0.8 مم، يذوب 2 ميكرولتر من محلول المخزون في 50 ميكرولتر من محلول داخل الخلايا في اليوم التجربة. محلول الصبغة الأسهم مستقرة ويمكن الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. وبالتالي، فإننا الحفاظ على واحد 50 ميكرولتر قسامة في درجة حرارة الغرفة حتى يتم استخدام هذا الامر.
الخطوة 3.2. إنشاء جيجا ختم بسرعة
SS = "jove_content"> تصحيح الخلايا العصبيه المحددة سابقا والسماح نشرها خالية من الصبغة من ماصة التصحيح الجسدية إلى سوما في تكوين خلية كاملة ل20-45 دقيقة. من الضروري الحصول على ختم في أسرع وقت ممكن بحيث يمكن أن تظل كمية صبغة خالية من الحل في الطرف الصغيرة. بدء التصحيح من خلال ممارسة سريعة بدون الصبغة في القطب. المقبل، وممارسة الترقيع والتحميل الخلايا العصبية مع الصبغة بهدف استخدام كمية ضئيلة من الصبغة الخالية من الحل في الطرف دون تلوث الأنسجة المحيطة بها. مع الممارسة، فمن الممكن لإنشاء ختم ضمن 1-2 دقيقة.
الخطوة 3.3. مراقبة مستوى تلطيخ
خلال نشر الصبغة في تكوين خلية كاملة، رصد الحالة الفسيولوجية للخلية عصبية عن طريق تسجيل إمكانات العمل أثار في الوضع الحالي، المشبك. بالإضافة إلى ذلك، رصد مبلغ تلطيخ عن طريق تسجيل شدة الضوء يستريح (RLI) من سوما الخلية بمعدل الإطار من 2 ك هرتز وعلى جزء صغير من شدة الضوء الكامل مع مرشحات الكثافة تعديل محايدة (نستخدم 0.04٪ من شدة الضوء ليزر من ليزر ميغاواط 400). مواصلة عملية التحميل صبغ حتى يبدأ العمل المحتملة لتوسيع، وعادة بعد 20-40 دقيقة، اعتمادا على حجم القطب والمقاومة.
توسيع الارتفاع هو عكسها تماما وعلى الأرجح بسبب تأثير الحمل بالسعة للتركيز المشبعة للصباغة في الغشاء الجسدية. يتم استعادة كامل الموجي للارتفاع بعد تركيز صبغة هو معايرتها في جميع أنحاء الخلايا العصبية.
الخطوة 3.4. إزالة القطب صبغ
في نهاية الفترة تلطيخ، وسحب بعناية ماصة التصحيح بعيدا عن سوما في تكوين المشبك الجهد ضمان تحقيق الانتقال من خلية كاملة لتكوين التصحيح خارج التدريجي في هذه العملية.
الخطوة 3.5. انتظر نشر صبغ
الأنف والحنجرة "> احتضان شريحة لساعة إضافية 1،5-2 في درجة حرارة الغرفة للسماح للصبغة حساسة الجهد لنشر في عمليات الخلايا العصبية. بعد كمية كبيرة من الصبغة ينشر بعيدا عن سوما في عمليات شجيري ومحور عصبي، والموجي من يتم استعادة تماما AP.4. تسجيل البصرية
الخطوة 4.1. تحديد مقصورة الخلوية للتصوير
تحديد موقع سوما من الخلايا العصبية الملون تحت ضوء انخفاض مستوى مضان وإعادة التصحيح الخلايا العصبية مع القطب القياسية التصحيح (أي صبغة) تحت DIC. تصور العمليات العصبية تحت مستوى ضوء منخفض بمعدل 10-40 هرتز إطار في وضع التسجيل المستمر للCCD للتصوير الجهد. خفض مستوى الضوء مع مرشحات الكثافة محايدة إلى الحد الأدنى اللازم لتصور الكائن في المصالح. نستخدم 0.01٪ من كثافة الليزر 400 ميغاواط خلال تحديد المواقع من الخلايا العصبية الملون. باستخدام مرحلة XY، وضع عملية الخلايا العصبية ذات الاهتمام في روسط منطقة التصوير كان. حماية سوما من ضوء الإثارة باستخدام محطة الميدان مغلقة جزئيا القزحية المجهر. سوف تحمي سوما من ارتفاع شدة الضوء الإثارة الحد بشكل كبير من الأضرار الضوئي أثناء التسجيل.
الخطوة إشارات الضوئية سجل 4،2 المتعلقة العابرين غشاء المحتملة
تسجيل الإشارات الضوئية وكالة الأنباء الجزائرية المرتبطة backpropagated في فروع شجيري الفردية. تسجيل الإشارات الضوئية وكالة الأنباء الجزائرية المرتبطة في محور عصبي. تسجيل الإشارات الضوئية المتصلة backpropagating نقاط وصول في العمود الفقري شجيري. استخدام معدلات الإطار المناسب لإعادة الإعمار دقيقة من إشارة الموجي والحفاظ على فترات تسجيل والتعرض لارتفاع شدة الضوء الإثارة قصيرة قدر الإمكان لتقليل الضرر وصبغ التبييض الضوئي. على سبيل المثال، دراسة تسلسل بدء انتشار وإمكانيات عمل واحد في محور عصبي يتطلب فترات تسجيل ميللي ثانية من 5-10. الاثارة ضوء intensiTY أثناء التسجيل هو حل وسط بين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من جهة ودرجة الصبغة تبيض الضوئي والضرر من جهة أخرى. ونحن نستخدم 100٪ من كثافة الليزر ميغاواط من 400 في تسجيل مقاطع طويلة من محاور عصبية عندما يضيء مساحة 300 ميكرومتر في القطر. عندما تركز على ضوء الإثارة إلى منطقة قطرها 30 ميكرومتر العمود الفقري شجيري للتصوير، ونحن نستخدم 10-25٪ من الليزر شدة الضوء. مدة المطلوبة للتسجيل هي من العوامل الهامة لشدة الإثارة ضوء الأمثل؛ فترات أقصر تسمح كثافة أعلى تسجيل الخفيفة. يتم تحديد أفضل كثافة الإضاءة الأمثل تجريبيا لكل إعداد وضبط القياس.
5. تحليل البيانات
الخطوة 5.1. تصحيح البيانات الخام لأخطاء المعروفة
وأجريت تحليل وعرض البيانات باستخدام برنامج من NeuroPlex (RedShirtImaging) مكتوبة في IDL (ITT البصرية Solut المعلوماتالأيونات، بولدر، كولورادو) والعرف الروتينية ل Visual Basic. في ظل ظروف الإضاءة الخافتة مستويات، ومضان الخلفية يصبح محورا هاما لحجم إشارة ΔF / F. تم أولا تصحيح البيانات الخام لهذا الغرض وذلك بطرح متوسط كثافة مضان الخلفية مصممة من منطقة غير ملوثين على شريحة. بعد ذلك، تم استخدام برنامج المحاذاة إشارة لتصحيح غضب الزمنية في بدء AP فضلا عن الحركات الصغيرة ممكن من خلال إعداد المتوسط. في المجال الزمني، والانحياز إشارات AP من العلاقات المتبادلة من نقاط وصول سجلت كهربائيا في كل محاكمة إلى إشارة مرجعية المكتسبة في بداية في المتوسط (1B الشكل). في المجال المكاني، والانحياز الصور في بعدين حاليا من الصورة عبر ارتباط للتعويض عن الحركات الجانبية المحتملة صغير من التحضير. تم التحقق من التركيز الصحيح للصورة في Z-البعد قبل كل محاكمة الفردية؛ األصغر وكانت التعديلات L غالبا ما يكون ضروريا. وبلغ متوسط إشارات المكان والزمان الانحياز كما هو مبين في الشكل 1B. تم تصحيح التغييرات بطيئة في شدة الضوء بسبب تبييض الصبغة بتقسيم البيانات عن طريق وظيفة مناسبة الأسي المزدوج المستمدة من التجارب مع عدم وجود التحفيز التسجيل (1B الشكل). أعيد بناء الموجي للإشارة AP من مجموعة من نقاط البيانات باستخدام المفتاح مكعب الاستيفاء، ومنحنى piecewise المستمر التي تمر عبر كل نقطة بيانات. للتأكد من أن إشارة الجهد صبغة حساسة للمسارات المحتملة غشاء دون تحريف كبير في النطاق الزمني ميلي ثانية واحدة، ومقارنة إشارة AP الكهربائية من سوما إلى إشارة ضوئية من AP أكمة محور عصبي المجاورة كما هو مبين في الشكل 3B. إشارات اثنين يطغى بشكل وثيق جدا، مما يسمح لهذه الضوضاء لقطة في تسجيل البصرية.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
الشكل 1. تحليل البيانات (الرسوم المتحركة). (A) لوحة العلوي: ارتفاع القرار مبائر صورة من الخلايا العصبيه الملون مع محور عصبي في موضع التسجيل. تسجيل القطب الكهربائي تعلق على سوما وتحفيز الكهربائي خارج الخلية القاعدية بجوار التغصنات أظهرت تخطيطي. إمكانات العمل التي حركها التحفيز، خارج الخلية متشابك. اللوحة السفلى: صورة القرار المكانية منخفضة مضان من محور عصبي التي حصلت عليها CCD المستخدمة لV م التصوير (B) من التسجيلات الكهربائي سوما (آثار الأسود)، والتسجيلات البصرية من AIS (آثار أحمر)، ومن عقدة رانفييه (آثار الأخضر). . آثار الأعلى: البيانات الخام في الفترة من 9 محاكمات تظهر غضب الزمنية في بدء AP. الصف الثاني من آثار: محاذاة زمنيا الإشارات. الصف الثالث من آثار: إشارة متوسط. الرابع صف من آثار: تصحيح التبييض. آثار أسفل: الاستيفاء خدد مكعب مع مرور واحد من تجانس الزمنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب المجهري متحد البؤر ناجحة تسمح تحديد واضح لعمليات الخلايا العصبية سليمة والتي هي قريبة من سطح شريحة ويقع في طائرة واحدة من التركيز. تحديد الخلايا العصبية التي تكون مناسبة للتصوير الجهد قبل التحميل صبغة حساسة الجهد أمر بالغ الأهمية. ويرد مثال على الصور مبائر من الخلايا العصبية الهرمية L5 معربا عن EGFP في شريحة القشرية (Crym خط الماوس المعدلة وراثيا) في الشكل 2. محاور عصبية من الخلايا العصبية الفردية واضحة للعيان. تم تحديد الخلايا مع محاور عصبية سليمة طويلة (السهام البيضاء) في طائرة واحدة من التركيز على مقربة من سطح شريحة.
الشكل 2. اختيار الخلايا العصبية القشرية L5 لV-M تصوير AP إشارات من محاور عصبية. منخفضة (يسار) وصور عالية التكبير (يمين) في المنطقة شريحة نفسه؛ 488 نانومتر باستخدام الإثارة يوكوجاواالغزل الماسح الضوئي القرص.
نمط المكاني للنا قناة التجميع في قطاع محور عصبي الأولية (AIS) يلعب دورا حاسما في ضبط الحسابات والتغيرات العصبية في نا قناة التوزيع وقد ثبت للتوسط أشكال جديدة من اللدونة العصبية في محور عصبي. ومع ذلك، قد immunocytochemical البيانات على قنوات التوزيع لا يمكن التنبؤ مباشرة الخصائص الزمانية المكانية من بدء العمل المحتملة، والتدابير الكهربية قبل غير مباشرة إما (خارج الخلية) أو تفتقر القرار المكانية كافية (داخل الخلايا) لوصف مباشرة منطقة الزناد ارتفاع (TZ). تحسن المنهجية الحاسمة في حساسية الغشاء تقنية التصوير المحتملة الموصوفة هنا يسمح القياس المباشر للموقع وطول TZ ارتفاع على النحو المحدد في شروط وظيفية. ويرد مثال على تسجيل إشارات AP في عالية الدقة المكانية والزمانية في الشكل 3. 3B الشكل يوضح أنبلغت حساسية المتاحة V-M التصوير كافية للرصد الدقيق لإزالة الاستقطاب دوين العتبة التي سبقت الإشارة AP التجدد. بالإضافة إلى ذلك، أكدت المقارنة بين الإشارات الضوئية AP من الرابية سوما / محور عصبي وأكثر من عقدة رانفييه البعيدة من أن يكون ديناميات نقاط وصول مختلفة بشكل ملحوظ في هذين الموقعين 8، 15؛ كل من upstroke وdownstroke من كان أسرع في AP عقدة رانفييه. للحصول على تفاصيل حول حدود القرار الزمانية المكانية في قياسات حجم وموضع من ارتفاع TZ انظر الشكلين 3 و 5 في بوبوفيتش وآخرون (2011).
إشارات الرقم العمل 3. المحتملة من محور عصبي. (A) لوحة العلوي: ارتفاع القرار مبائر صورة من الخلايا العصبية في القشرة L5 محملة الصبغة الجهد الحساسة مع محور عصبي في موضع التسجيل؛ الاب الإسقاطام لZ-كومة من الصور مبائر. تسجيل / تحفيز الكهربائي التصحيح المرفقة سوما. اللوحة السفلى: انخفاض مضان القرار المكانية صورة حصلت عليها محور عصبي CCD المستخدمة لV-M التصوير. (B) إشارات ذات الصلة AP سجلت في معدل الإطار من 10 كيلو هرتز. آثار على حق: AP العابرين من ثلاثة مواقع: 1-القطب التسجيل من سوما؛ 2-البصرية التسجيل من الرابية محور عصبي؛ 3-البصرية التسجيل من العقدة الأولى من رانفييه. آثار أسفل: متداخل إشارة من المواقع الثلاثة نفسها.
لم يتم التفاعل غير خطية بين إمكانيات بعد المشبكي مثير (EPSPs) وbAPs في التشعبات التي هي المسؤولة عن تحريض LTP مفهومة تماما. هذا التفاعل يعتمد بشكل حاسم على كل من السعة الإشارات ويجب، بالتالي، أن يكون غير منتظم مكانيا. الاختبار التجريبي لهذا التوقع يتطلب قياسات جيدا مكانيا التي لم تحل نفذت فروع لشجيري من قطر الصغيرة ليستccessible لقياسات القطب. تقنية التصوير غشاء المحتملة الموصوفة هنا يسمح رصد الإشارات الكهربائية من مواقع متعددة في الشجرة بأكملها شجيري كما هو موضح في الشكل 4. ويتميز نمط النشاط BAP في جذع شجيري من المسامير الحالية الصوديوم في المناطق القريبة تهيمن التي غيرت تدريجيا لفترات طويلة الكالسيوم الحالية يهيمن إزالة إستقطاب الأحداث في التشعبات البعيدة.
الشكل 4. إشارات العمل المحتملة من مواقع متعددة على جذع شجيري من الخلايا العصبية في القشرة L5. اليسار لوحة: صورة عالية القرار من الخلايا العصبية في القشرة L5 محملة صبغة الجهد الحساسة؛ الإسقاط من Z-كومة من الصور مبائر. اللوحة اليمنى: انفجار من 4 AP بدأت في 100 هرتز بواسطة نبضات قصيرة الحالية إزالة إستقطاب (التتبع أسفل) تسليمها إلى سوما. وBackpropagatingإشارات ction المحتملة من ستة مواقع مختارة (1-6) على طول التشعبات قمية ومنحرف. تم الحصول على آثار من 1 إلى 3 من تسجيل محاكمة واحدة. التتبع 4 هو متوسط محاكمة أربعة، في حين اثار 5 و 6 هي متوسطات المحاكمة السادسة عشرة.
فرضية أن العمود الفقري لها دور في تعديل الكهربائية فعالية متشابك التي ترتكز عليها اللدونة والتعلم والذاكرة وربما الآليات تلقت مؤخرا اهتماما كبيرا بسبب آثارها الحاسمة لوظيفة الدماغ (Yuste، 2010). هناك، ومع ذلك، فإن القليل جدا من الأدلة التجريبية المباشرة لصالح أو ضد هذه الفرضية. عدم اليقين في تفسير النتائج غير المباشرة وعدم وجود دليل مباشر حول سلوك الكهربائية في العمود الفقري شجيري ترجع أساسا إلى وجود قيود المنهجية - أشواك صغيرة وغير قابل للوصول إلى الأساليب التقليدية للالكهربية. وبالتالي، فإن محاولات للتحقيق في هذه المسألة في عدم وجود بيانات تجريبية تعتمد علىالمحاكاة الحاسوبية مع تقديرات المعلمات الكهربائية يعتمد على العمود الفقري وخصائص مورفولوجية diffusional من الرقبة العمود الفقري. النهج الجهد التصوير الموصوفة هنا يجعل من الممكن لرصد إشارات العمل المحتملة والإشارات المحتملة متشابك على النطاق المكاني للفرد العمود الفقري شجيري مع حساسية عالية. ويمكن الآن أن تصمم التجارب لاختبار مباشرة التوقعات النظرية الأساسية حول السلوك الكهربائي لالعمود الفقري شجيري. ويرد مثال على الإشارات الضوئية وكالة الأنباء الجزائرية المرتبطة backpropagating العمود الفقري شجيري في الفرد والتغصنات الأم في الشكل 5.
الشكل 5 اشارات عمل محتمل العمود الفقري شجيري من الفردية. لوحات من الزمن: micrographs العليا - إعادة البناء التشريحي تم الحصول عليها من كومة من القرص الغزل مبائر الصور. أقل micrographs - FLصور uorescence من نفس المنطقة التي تم الحصول عليها مع الكاميرا CCD لV-M التصوير. اللوحة اليمنى: كثافة مضان يتتبع الموافق 1-3 BAP من مواقع المبينة على الصور CCD. المتوسطات الزمنية من 9 المحاكمات. تتبع القاع: تسجيلات الكهربائي من سوما. نلاحظ أن تتبع 3 من منطقة العمود الفقري دون إشارة لا يوجد لديه للكشف تشير إلى انخفاض مستوى تشتت الضوء في الطبقة السطحية للشريحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه المقالة تسجيل صبغة حساسة للطريقة الجهد لرصد النشاط الكهربائي للخلايا العصبية الفردية مع ميكرومتر الفرعية والفرعية ميلي ثانية واحدة قرار الزمانية المكانية. تحسين الإثارة الليزر في شبه الأمثل الطول الموجي (بشأن حجم إشارة) حساسية تسجيل بمعامل ~ أكثر من 50 النهج السابق. حساسية الحالية يمكن رصد إشارات كهربائية من جميع أنحاء الخلايا العصبية الفردية، بما في ذلك التشعبات، محاور عصبية، الضمانات محوار محور عصبي والمحطات وكذلك العمود الفقري شجيري الفردية. مع حساسية الحاضر، يمكن أن يتم من تسجيلات العابرين المحتملة غشاء بها في إطار معدلات تصل إلى 20 كيلو هرتز. يمكن متواضعة في المتوسط إشارة (4-25 تجارب) تحسين حساسية بسهولة تسجيل أعرب عن نسبة الإشارة إلى الضوضاء بمعامل 2-5. فإن القيود الرئيسية من الجهد التصوير هو عدم وجود معايرة بسيطة من الإشارات الضوئية من مواقع متعددة على نطاق الجهد المطلق. في بعض الإعداديمكن حل هذه الصورة من خلال إيجاد إشارة محتملة الغشاء الذي يحتوي على السعة المعروفة في جميع المواقع. AP إشارات في محور عصبي ومنفعل في بعض التشعبات كاملا 6 توفير مستوى المعايرة ممتازة.
خطوات حاسمة في تطبيق هذه المنهجية هي:
- التقليل من الآثار تشتت الضوء من خلال الحد من التسجيلات إلى الخلايا العصبية الموجودة بالقرب من سطح الدماغ الحادة شرائح (<30 ميكرومتر). هذا يتطلب تحسين إجراءات تشريح للحصول على نسبة عالية من الخلايا العصبية السليمة في الطبقة العليا من شريحة 1.
- تحسين كمية واضحة في حل غيض من القطب لتقديم الصبغة لضمان التحميل السريع من الخلايا العصبية.
- القضاء على الاهتزاز الميكانيكي للإعداد والتي يمكن أن تكون مصدرا للضوضاء الزائدة في تسجيل البصرية.
- توظيف منخفضة الضوضاء المستمرة الموجة (CW) ليزر مع الضوضاء من السعة RMS <0.5٪ كمصدر السابقينالاقتباس الضوء.
- السيطرة على الضرر الضوئي عن طريق اختيار المناسب شدة الضوء الإثارة بالنسبة إلى مدة فترة التسجيل والتسجيلات من خلال فصل المتعاقبة من فترات الظلام. تسجيل فترات أطول تتطلب كثافة أقل ضوء لمنع الضرر الضوئي.
الأمثلة المبينة أعلاه تشير إلى تسجيل نقطة تحول في العمود الفقري وعلم وظائف الأعضاء محور عصبي. هذه التسجيلات تكشف عن قوة رائعة من أن تكون قادرة على تسجيل الأحداث مباشرة الكهربائية التي لا يمكن تحليلها على أسس النظرية في الماضي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ديان زيسيفتش يعلن انه هو شريك في ملكية RedShirtImaging LLC، وهي شركة متخصصة في سرعة عالية، وانخفاض الضوضاء كاميرات CCD المستخدمة في تسجيل صبغ الجهد الأحرف. جميع الكتاب الآخرين أنهم لا يجدون أي مصلحة مالية أو تضارب محتمل في المصالح المتصلة الدراسة الحالية.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لدينا المتعاونين كنوت Holthoff، Konnerth آرثر وCanepari ماركو الذين شاركوا في التطوير الأولي لهذه التقنية وكذلك للوف M. ليزلي لتقديم التكرم الأصباغ. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح منحة NSF-0817969 IOS، وNS068407 M136043 معهد كافلي وعلم الأعصاب في جامعة ييل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M.
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
