Summary
En bildteknik för övervakning av membran eventuella förändringar med sub-mikrometer rumsliga och sub-millisekund temporal upplösning beskrivs. Tekniken, som bygger på laser-excitation av spänningskänsliga färgämnen, tillåter mätningar av signaler i axoner och axon säkerheter, terminala dendritiska grenar, och enskilda Dendritutskotten.
Abstract
Förstå biofysiska egenskaper och funktionella organisation av enskilda neuroner och hur de behandlar information är grundläggande för att förstå hur hjärnan fungerar. Den primära funktionen hos alla nervcell är att bearbeta elektriska signalerna, vanligen från flera källor. Elektriska egenskaper hos neuronala processer är utomordentligt komplexa, dynamiska, och, i det allmänna fallet, omöjligt att förutsäga i frånvaro av detaljerade mätningar. För att få en sådan mätning en skulle helst vilja kunna övervaka, på flera ställen, under tröskelvärdet händelser när de reser från områden av ursprung på neuronala processer och summate på särskilda platser för att påverka aktionspotentialens initiering. Detta mål har inte uppnåtts i någon neuron på grund av tekniska begränsningar hos mätningar som använder elektroder. För att övervinna denna nackdel, är det mycket önskvärt att komplettera patch-elektroden strategi med avbildningstekniker som medger omfattande parallella recordings från alla delar av en neuron. Här beskriver vi en sådan teknik - optisk inspelning av membran potential transienter med organiska spänningskänsliga färgämnen (V m-avbildning) - kännetecknas av sub-millisekund och sub-mikrometer upplösning. Vår metod är baserad på banbrytande arbete på spänningskänsliga molekylära sönder 2. Många aspekter av den inledande tekniken har kontinuerligt förbättrats under flera decennier 3, 5, 11. Dessutom tidigare arbete dokumenterat två väsentliga egenskaper V m-avbildning. Första fluorescenssignaler är linjärt proportionell mot membranpotentialen över hela fysiologiska intervallet (-100 mV till +100 mV, 10, 14, 16). Det andra har lastning nervceller med den spänningskänsliga färgämne används här (JPW 3028) inte detekterbara farmakologiska effekter. Den inspelade breddning av spetsen under färgen belastning är helt reversibel 4, 7. Dessutom visar experimentella bevis att det är möjligt att erhållaett betydande antal (upp till hundratals) av inspelningar innan några påvisbara fototoxiska effekter 4, 6, 12, 13. För närvarande tar vi fördel av den utmärkta ljusstyrka och stabiliteten hos en laserljuskälla vid nära optimala våglängden för att maximera känsligheten hos V m-avbildningsteknik. Den nuvarande känslighet tillåter flera webbplats optiska inspelningar av V m transienter från alla delar av en neuron, inklusive axoner och säkerheter axon, terminal grenar dendritiska och enskilda taggar dendritiska. Den förvärvade informationen om signal interaktioner kan analyseras kvantitativt såväl som direkt visualiseras i form av en film.
Protocol
1. Utrustning installation
Steg 1,1. Imaging inställning
Nyckeln till att spela spänningskänsliga färgämnen signaler är lämplig inställning utformning. Vi använder en upprätt mikroskop (BX51WI Olympus eller Zeiss AxioExaminer) utrustad med tre kameror. Installationsprogrammet är konstruerad för att belysa enskilda nervceller i hjärnan skivor genom excitationsljus i epi-fluorescens, breda fält mikroskopi läge med antingen Nikon 60X/1.0 NA eller Zeiss 63X/1.0 NA vatten doppa mål. Våra mikroskop är bultade till en vibrationsisolering bord och försedda med motordrivna rörliga steg. Varje Mikroskopet är utrustat med tre portar kamera. En kamera port har en standard med hög rumslig upplösning CCD-kamera för infrarött DIC video-mikroskopi (IR-1000, Dage MTI, USA). Den andra kameran porten har en snabb datainsamling kamera (upp till 20 kHz bildhastighet) med relativt låg rumslig upplösning (80 x 80 pixlar), men enastående dynamiskt omfång (14 bitar) och exceptionellt låga läsabuller (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur). Den tredje kameran porten har en CCD-kamera med hög spatial upplösning (PixelFly, 1392x1024 pixlar, PCO AG, Tyskland) monterad på en roterande-skiva konfokal skanner (CSU-10, Yokogawa, Japan) användes för att samla z-staplar av konfokal bilder för detaljerad morfologisk rekonstruktion av färgade cellen. En frekvens-fördubblade diod-pumpad Nd: YVO4 kontinuerliga vågor arbetande laser (400 mW) som emitterar vid 532 nm (MLL-III/400 mW CNI, Changchun, Kina) är källan excitationsljus. Den 2 mm laserstråle grindas av en slutare (LS6, Vincent Associates) avser en ljusledare kopplad till mikroskopet via en enda port epifluorescens kondensor (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Tyskland) för att överfylla bakre öppningen av mål och tillhandahålla nästan jämn belysning av objektet planet. Laserljuset används i stället för en konventionell xenon Arc-lampa för att maximera känsligheten hos V m-avbildning av: (1) användning av en monokromatisk excitat ljus i röda flygel absorptionsspektrum för att maximera V m känslighet färgämnet 9, 10 och (2) öka intensiteten i excitationsljus utöver den nivå som kan uppnås genom en båge-lampa. Excitationsljuset reflekterades till framställningen av en dikroisk spegel med en central våglängd av 560 nm och den inspelade fluorescens ljuset fick passera genom en 610 nm spärrfilter (en Schott RG610). Den kombinerade effekten av en ökning i ljusintensitet och användningen av nära optimala monokromatiska exciteringsvåglängder var en dramatisk förbättring i känsligheten hos spänningen avbildning med en faktor av cirka 50 jämfört med tidigare mätningar 6.
Steg 1,2. Justera för jämn belysning
Använd en fluorescens bild standard (grön excitation / röd emission). Infoga lämpliga neutrala täthetsfilter i laserstrålens bana, så att CCD inte är mättad. Fokusera målet på ytan avbilden. Justera läget för den mottagande änden av kvarts ljusledaren framför laserns bärraket målet och justera positionen för den utgående änden av ljusledaren fäst vid mikroskopet med tillhörande drivorgan på epi-fluorescens kondensor för att åstadkomma centrerad och enhetlig belysning av synfältet.
Steg 1,3. Bestäm vibrerande ljud
Placera en liten svart bläck märke på ytan av fluorescens sliden. Spela in ljusintensitet med NeuroCCD i kontinuerligt inspelningsläge. Fokusera målet på en mörk kant av svart bläck märket. Spela ljusintensiteten för ca 100 msek vid 2 kHz bildhastighet. Visa rumsliga genomsnittet av de fraktionella spår ljusintensitet (AF / F) från ~ 20 bildpunkter erhåller ljus från likformigt belysta området och från ~ 20 bildpunkter längs kanten av bläck märket. Överskottet buller i inspelningar från pixlar med hög kontrast kanter speglar vibrerande buller isystemet.
Steg 1,4. Vibrationsisolering
Det är obligatoriskt att minska vibrationerna med hjälp av en vibrations-isolering bord till en nivå under skottet buller på ljusintensiteter jämförbara med experimentella inspelningsförhållandena. Anpassa bordets vibrationsisolering tills vibrationsljud i ljusintensiteten från bildpunkter som täcker den skarpa kanten av bilden är försumbar. Ingen av utrustningen med rörliga delar (mekaniska jalusier, fläktar) kan monteras på bordet. Kablarna från utrustningen på bordet fäst till andra komponenter som inte är isolerade från vibrationer måste vara lös så att de inte överför mekaniska vibrationer mikroskopet.
2. Val av en lämplig Neuron för V m-Imaging
Steg 2,1. Val av neuroner
Gör hjärnsnitt enligt standardförfaranden. Använd en mus som uttrycker EGFP i enskilda nervceller av interest. Med en roterande skiva konfokal system visualisera EGFP märkta nervceller i slice. Välj nervceller för V m-avbildning med intakta dendritiska / axonal träd och med processer som löper parallellt och nära ytan av skivan. Detta kan inte åstadkommas i vildtypsmöss eftersom axoner och dendriter tunna, för det mesta, är inte synliga i DIC mikroskopi läge.
3. Laddar nervceller med spänningskänsliga Dye
Steg 3,1. Påfyllning av fläckpipetten
Fyll pipetter glas patch från spetsen med färg-fri intracellulär lösning genom att negativt tryck i ca 15 s upp till 2/3 av elektroden kona. Färgämnet fri lösning i spetsen är nödvändig för att förhindra spill av färgämnet på skivan vilket ökar bakgrundsfluorescens och dramatiskt minskar signalbrusförhållandet. Back-fylla elektroden med lösningen innehållande membranet ogenomträngligt spänningskänsliga färgämne JPW3028 upplösti intracellulär lösning (0,8 mM).
JPW3028, den mest framgångsrika spänning sond för intracellulär tillämpning, är ett dubbelt positivt laddad analog av ANEP serie av lipofila styrylfärgämnen som fortfarande är tillräckligt vattenlösliga för att användas för mikroinjektion. Den di-etyl-analog av detta färgämne har praktiskt taget identiska egenskaper (inklusive spänning-känslighet) och är kommersiellt tillgänglig som JPW1114 (se tabell 1). Vi förbereder 20-lösning mM stamlösning i destillerat H 2 O. 50 | il alikvoter av stamlösningen hålls frysta vid -20 ° C. För den slutliga färgämneskoncentrationen av 0,8 mM, är 2 pl av stamlösningen löstes i 50 pl intracellulär lösning på dagen för experimentet. Beståndet färgämneslösningen är stabil och kan förvaras vid rumstemperatur under flera månader. Således, håller vi en 50 pl alikvot vid rumstemperatur tills den är förbrukad.
Steg 3,2. Etablera en giga-tätning snabbt
Steg 3,3. Övervaka graden av färgning
Under färgdiffusion i helcells-konfiguration, övervaka det fysiologiska tillståndet av neuron genom registrering framkallade aktionspotentialer i ström-clamp läge. Dessutom övervaka mängden färgning genom att registrera vilande ljusintensitet (RLI) från cellen soma med en ram på 2 K Hz och till en bråkdel av fullt ljus intensitet justerad med neutrala täthetsfilter (vi använder 0,04% av laserljuset intensiteten från en 400 mW laser). Fortsätt färgämnet laddningsprocessen tills aktionspotentialen börjar bredda, vanligtvis efter 20-40 minuter, beroende på elektrodens storlek och motstånd.
Breddningen av spetsen är helt reversibel och sannolikt på grund av kapacitiv last effekten av mättade koncentrationen av färgämnet i den somatiska membranet. Vågformen hos spetsen är helt återställd efter färgämneskoncentrationen jämviktas hela neuronen.
Steg 3,4. Ta bort färgen elektroden
I slutet av färgning period dra försiktigt plåstret pipetten från soma i spänning klämma konfiguration säkerställer att övergången från hel-cell till utsidan ut patch konfiguration uppnås i processen.
Steg 3,5. Vänta på färgdiffusion
ENT "> Inkubera segmentet under ytterligare 1,5-2 timmar vid rumstemperatur för att möjliggöra spänningskänsliga färgämne sprida sig till neuronala processer. Efter en betydande mängd färgämne diffunderar bort från soma till dendritiska och axonal processer, vågformen för AP är helt återställd.4. Optisk inspelning
Steg 4,1. Väljer ett cellulärt fack för avbildning
Leta somat av färgade neuron i svagt ljus nivå fluorescens och re-lapp neuron med en standard (ingen färg) lappelektrod enligt DIC. Visualisera neuronala processer i svagt ljus nivå vid en bildhastighet av 10-40 Hz i kontinuerligt inspelningsläge av CCD för spänning-avbildning. Minska ljusnivå med neutrala täthetsfilter till det minimum som krävs för att visualisera föremål för intresse. Vi använder 0,01% av 400 mW laserintensiteten under positionering av färgade neuronen. Använda en XY skede placera neuronala processen intresset för than mitten av avbildningsområdet. Skydda somat från excitationsljus med delvis stängda iris fält stopp av mikroskopet. Värn somat från hög intensitet excitationsljus kommer att minska den fotodynamiska skador under inspelning.
Steg 4,2 Rekord optiska signaler i samband med membran potentiella transienter
Spela optiska signaler i samband med backpropagated AP i enskilda dendritiska grenar. Spela optiska signaler relaterade till åtkomstpunkter i axonet. Spela optiska signaler i samband med backpropagating AP i Dendritutskotten. Använd bildhastighet lämpliga för exakt rekonstruktion av signalvågformen och hålla inspelning perioder och exponering för hög intensitet excitationsljus så korta som möjligt för att minimera färg blekning och fotodynamisk skada. Till exempel undersöker sekvensen av initiering och utbredning av enstaka aktionspotentialer i axonet kräver inspelning perioder av 5-10 ms. Excitationsljuset intensivtty under inspelning är en kompromiss mellan signal-till-brus-förhållande på ena sidan och graden av färgblekning och fotodynamisk skada på den andra sidan. Vi använder 100% av intensiteten av 400 mW laser inspelning från långa sektioner av axoner när ett område av 300 mm i diameter är tänd. När excitationsljuset fokuseras till en 30 ^ m diameter område för dendritisk ryggrad avbildning, använder vi 10-25% av laserljuset intensitet. Under hur lång tid inspelningen är en viktig faktor för den optimala excitationsljus intensitet, kortare inspelning perioder tillåta högre ljusintensiteter. Den optimala belysningsintensitet bestämmes bäst empiriskt för varje beredning och inställningarna mätning.
5. Dataanalys
Steg 5,1. Rätta rådata för kända fel
Analysen och visning av data genomfördes med NeuroPlex programmet (RedShirtImaging) skriven i IDL (ITT Visuell Information solutjoner, Boulder, Colorado) och anpassade Visual Basic rutiner. Enligt villkoren för låga ljusnivåer, blir bakgrundsfluorescensen en betydande faktor för AF / F-signal storlek. Rådata först korrigeras för denna effekt genom att subtrahera den genomsnittliga intensiteten bakgrundsfluorescens bestäms från ett ofärgade område på skiva. Därefter justera signalerna programvara som används för att korrigera för temporal jitter i AP-initiering samt för eventuella små rörelser av preparatet under medelvärdesbildning. I den temporala domänen var AP-signaler linje med korskorrelation av elektriskt inspelade AP i varje försök till referenssignalen förvärvades i början av medelvärdesbildning (Figur 1B). I den rumsliga domänen var bilderna inriktade i två dimensioner offline genom bilden korskorrelation för att kompensera för eventuella små rörelser i sidled av preparatet. Den korrekta inriktningen av bilden i z-dimensionen verifieras innan varje försök; smal l justeringar var ofta nödvändigt. De rumsligt och tidsmässigt inriktade signaler genomsnitt som visas i Figur 1B. Långsamma förändringar i ljusintensitet på grund blekning av färgen korrigerades genom att dividera data genom en lämplig dubbel exponentiell funktion härrör från inspelningen prövningar utan stimulering (Figur 1B). Vågformen hos AP-signalen rekonstrueras från en uppsättning av datapunkter med kubisk spline interpolation, en bitvis kontinuerlig kurva som passerar genom varje datapunkt. För att bekräfta att den spänningskänsliga färgsignal spår membranpotential utan signifikant distorsion vid millisekunder skala, den elektriska AP signalen från somat jämfört med den optiska AP-signalen från den intilliggande axonet kulle som visas i figur 3B. De två signalerna överlagra mycket nära, vilket möjliggör skottet brus i optisk inspelning.
les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
Figur 1. Dataanalys (Animation). (A) Övre panel: hög upplösning konfokal bild av en färgad neuron med axonet i inspelningen position. Inspelning elektrod kopplad till soma och extracellulära stimulerande elektrod intill basala dendrit visas schematiskt. Aktionspotentialer framkallas av extracellulär, synaptisk stimulering. Nedre panelen: låg spatial upplösning fluorescens bild av axonet som erhålls genom CCD används för V m avbildning (B) elektroden inspelningar från soma (svarta spår), optiska inspelningar från AIS (röda spår), och från nod Ranvier (gröna spår). . Top spår: rådata från 9 försök visar temporal jitter i AP initiering. Andra raden av spår: tidsmässigt inriktade signaler. Tredje raden av spår: genomsnittlig signal. Fjärde raden av spår: blekmedel korrigering. Botten spår: kubisk spline-interpolering med en passage av temporal utjämning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik konfokalmikroskopi bör göra det möjligt tydlig identifiering av intakta neuronala processer som är nära ytan av skivan och ligger i ett plan i fokus. Valet av nervceller som är lämpliga för spänning avbildning före spänningskänsliga färg belastning är kritisk. Ett exempel på konfokala bilder av L5 pyramidala neuroner uttrycker EGFP i en kortikal skiva (Crym transgen mus linje) visas i figur 2. Axoner enskilda neuroner syns tydligt. Celler med långa intakta axoner (vita pilar) i ett plan av fokus nära ytan av skivan valdes.
Figur 2. Val av L5 kortikala neuroner för V m-avbildning av AP-signaler från axoner. Låg (vänster) och hög (höger) förstoring bilder av samma skiva regionen, 488 nm excitation med Yokogawasnurrande skiva skanner.
Den rumsliga mönstret av Na-kanal klustring i axonet initiala segmentet (AIS) spelar en avgörande roll i avstämning neuronala beräkningar och förändringar i Na-kanal distribution har visats mediera nya former av neuronal plasticitet i axonet. Emellertid kan immunocytokemiska uppgifter om kanal distributionen inte direkt förutsäga Spatiotemporal egenskaper aktionspotentialen initiering, och tidigare elektrofysiologiska åtgärder är antingen indirekt (extracellulär) eller saknar tillräcklig rumslig upplösning (intracellulär) att direkt karakterisera spetsen trigger zonen (TZ). En kritisk metodologisk förbättring i känslighet membranpotentialen bildteknik som beskrivs här möjliggör direkt bestämning av placering och längden på spetsen TZ enligt funktionella termer. Ett exempel på inspelning AP signaler vid hög rumslig och temporal upplösning som visas i figur 3. Figur 3B visar attden tillgängliga känsligheten hos V m-avbildning var tillräcklig för noggrann övervakning av under tröskelvärdet depolarisationen föregår regenerativ AP-signalen. Dessutom bekräftade jämförelse av de optiska AP signalerna från soma / axon kulle och från en mer distal nod Ranvier att AP har markant olika dynamik vid dessa två platser 8, 15, såväl uppåtslaget och nedåtslaget för AP var snabbare i noden i Ranvier. För mer information om Spatiotemporal upplösning begränsningar i mätningarna av storlek och placering spetsen TZ se figurerna 3 och 5 i Popovic et al. (2011).
Figur 3. Aktionspotential signaler från axonet. (A) Övre panel: hög upplösning konfokal bild av en L5 kortikala neuron laddad med spänning-känslig färg med axonet i inspelningen position; projektion frOM en z-stapel av konfokala bilder. Inspelning / stimulera lappelektrod bifogas soma. Undre panel: låg rymdupplösning fluorescens bild av axonet erhållits genom CCD används för V m.-avbildning. (B) AP relaterade signaler registreras vid en bildhastighet av 10 kHz. Spår på höger: AP transienter från tre platser: 1-elektrod inspelning från soma, 2-optiska inspelning från Axon kulle, 3-optisk inspelning från den första noden i Ranvier. Botten spår: Överlagringständare signalen från samma tre platser.
Den icke-linjära samverkan mellan de excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSP) och BAPS i dendriter som är ansvarig för induktionen av LTP är inte helt klarlagd. Denna interaktion är kritiskt beroende amplitud båda signalerna och måste därför vara rumsligt oenhetlig. Den experimentella test av denna förutsägelse kräver rumsligt väl upplösta mätningar som inte utförts eftersom dendritiska grenar med liten diameter är inte enccessible till elektroden mätningar. Membranpotentialen avbildningsteknik beskrivs här medger övervakning av elektriska signaleringen från flera platser i hela dendritiska bersån såsom visas i fig 4. Mönstret av BAP aktivitet i dendritiska bersån kännetecknas av natrium dominerade strömspikar i proximala regioner som gradvis ändras till långvarig kalcium ström dominerade depolariserande händelser i distala dendriter.
Figur 4. Aktionspotential signaler från flera platser på dendritiska berså av L5 kortikal neuron. Vänster panel: högupplöst bild av en L5 kortikala neuron laddad med en spänningskänsliga färg, projektion från en z-bunt konfokala bilder. Höger panel: en explosion av 4 AP initierade vid 100 Hz genom korta depolariserande strömpulser (bottenspår) levereras till soma. Backpropagating enInsatser potentiella signaler från sex utvalda ställen (1-6) längs apikala och sneda dendriter. Spår 1 till 3 erhölls från en enda provinspelning. Trace 4 är en fyra rättegång genomsnittet, medan spår 5 och 6 är sexton rättegång genomsnitt.
Hypotesen att taggar har en elektrisk roll att ändra synaptisk effekt som ligger bakom plasticitet och eventuellt lärande och minne mekanismer har nyligen fått stor uppmärksamhet på grund av dess kritiska konsekvenser för hjärnans funktion (Yuste, 2010). Det finns dock mycket liten direkt experimentella bevis för eller emot denna hypotes. Osäkerheterna i tolkningen av indirekta resultat och avsaknaden av direkta bevis elektrisk beteende Dendritutskotten beror främst på en metodologisk begränsning - ryggar är små och inte är tillgängliga för konventionella elektrofysiologi. Således försöker utreda denna fråga i avsaknad av experimentella data som åberopatsdatorsimuleringar med uppskattningar av elektriska parametrar baserade på ryggraden morfologi och diffusionssystem egenskaper i ryggraden hals. Spänningen-imaging metod som beskrivs här gör det möjligt att övervaka åtgärder potentiella signaler och synaptiska potentiella signaler på rumslig skala av enskilda Dendritutskotten med hög känslighet. Experimenten kan nu utformas så att direkt testa de grundläggande teoretiska förutsägelser om elektrisk beteende Dendritutskotten. Ett exempel på optiska signaler relaterade till backpropagating AP i ett enskilt dendritiska ryggraden och dess överordnade dendrit visas i figur 5.
Figur 5. Aktionspotential signaler från en enskild dendritiska ryggraden. Vänstra panelen: övre mikrofotografier - anatomiska rekonstruktioner erhållna från en stapel av spinning-disk konfokala bilder. Lägre mikrofotografier - FLuorescence bilder av samma område som erhålls med CCD-kamera för V m.-avbildning. Höger panel: Fluorescensintensitet spår motsvarande BaP från platser 1-3 beskrivs på CCD-bilder. Temporal medelvärden av 9 försök. Bottenspår: elektrod inspelningar från soma. Notera att spår 3 från ett område utan en ryggrad har ingen detekterbar signal som indikerar låg nivå av ljusspridning i det ytliga skiktet av skivan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln beskriver en spänning-känslig metod färg inspelning för övervakning elektriska aktiviteten i enskilda nervceller med sub-mikrometer och sub-millisekund Spatiotemporal upplösning. Laserexcitation vid nära optimala våglängden (beträffande signal storlek) förbättrades känsligheten för inspelning med en faktor på ~ 50 jämfört med tidigare metoder. Den nuvarande känslighet möjliggör övervakning elektriska signaler från alla delar av enskilda nervceller, inklusive dendriter, axoner, axon säkerheter och axon terminaler samt enskilda taggar dendritiska. Med nuvarande känslighet, kan inspelningar av transienter membranpotentialen utföras vid bildhastigheter av upp till 20 kHz. Blygsamma signaler medelvärdesbildning (4-25 försök) kan lätt förbättra känsligheten hos inspelningen uttryckt som signal-till-brus-förhållande med en faktor av 2-5. Den största begränsningen av spänning avbildning är bristen på enkel kalibrering av optiska signaler från flera platser på en absolut skala spänning. På en del förberedelserär detta kan lösas genom att hitta en signal membranpotential som har en känd amplitud på alla platser. AP-signaler i axonet och i vissa helt exciterbara dendriter 6 ger en utmärkt kalibreringsstandard.
Kritiska steg i tillämpningen av denna metod är:
- Minimering ljusspridande effekt genom att begränsa inspelningar till neuroner belägna nära ytan av akuta hjärnsnitt (<30 pm). Detta krävs optimera skivning procedur för att erhålla en hög andel friska neuroner i det övre skiktet av skivan 1.
- Optimering av mängden klar lösning i spetsen av elektroden för att leverera färgämnet att säkerställa snabb lastning av neuroner.
- Eliminera mekanisk vibration av preparatet som kan vara en källa till överskjutande buller i optisk inspelning.
- Använda låg ljudnivå kontinuerlig mod (CW) lasrar med RMS bullret från amplitud <0,5% som en källa till excitat ljus.
- Styra fotodynamisk skada genom att välja lämplig intensitet excitationsljus förhållande till längden på inspelningen perioden och genom att separera varandra inspelningar av mörka perioder. Längre inspelning perioder kräver lägre ljusintensiteter att förhindra fotodynamisk skada.
De inspelning exemplen ovan indikerar en vändpunkt i ryggraden och axon fysiologi. Dessa inspelningar avslöjar den märkliga kraften att kunna spela in direkt elektriska händelser som bara kunde analyseras på teoretiska grunder i det förflutna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dejan Zecevic förklarar att han är en delägare i RedShirtImaging LLC., Ett företag specialiserat på hög hastighet, lågt brus CCD-kameror som används i spänning-känsligt färgämne inspelning. Alla andra författare rapporterar inga ekonomiska intressen eller potentiella intressekonflikter som rör den aktuella studien.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för våra samarbetspartners Knut Holthoff, Arthur Konnerth och Marco Canepari som deltog i den inledande utvecklingen av denna teknik samt Leslie M. Loew för vänligt ge färgämnen. Stöds av NSF bidrag IOS-0817969, NIH bidrag NS068407 och M136043 och Kavli Institute for Neuroscience vid Yale University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M.
- Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).
- Yuste, R. Dendritic Spines. , MIT Press. (2010).
