Summary
इस शल्य चिकित्सा तकनीक माउस आँख की subretinal अंतरिक्ष में जीन थेरेपी वैक्टर और स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन को दिखाता है.
Abstract
दृष्टि की हानि संयुक्त राज्य अमेरिका में लगभग 3.4 लाख लोगों को प्रभावित करता है और आगामी वर्षों में वृद्धि की उम्मीद है 1 हाल ही में, जीन थेरेपी और स्टेम सेल प्रत्यारोपण रेटिना अपक्षयी रोगों से उत्पन्न अंधापन के इलाज के लिए महत्वपूर्ण चिकित्सकीय उपकरण बन गए हैं. ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण की उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन के लिए कई रूपों (AMD), आईरिस वर्णक उपकला कोशिका प्रत्यारोपण के रूप में उत्साहजनक परिणाम उत्पन्न किया है, और मानव नैदानिक परीक्षणों जीन और स्टेम सेल उपचार के अन्य रूपों के लिए शुरू कर दिया है 2 इन RPE65 जीन प्रतिस्थापन शामिल हैं. Leber जन्मजात अंधता और RPE सेल है Stargardt रोग में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) का उपयोग कर प्रत्यारोपण के साथ रोगियों में चिकित्सा 3-4 अब यह है कि जीन थेरेपी वैक्टर और स्टेम कोशिकाओं रेटिना रोगों के साथ रोगियों के उपचार के लिए उपलब्ध हैं, यह महत्वपूर्ण है सत्यापित करने के लिए पशु मॉडल में इन संभावित उपचारों से पहले लागू होते हैंउन्हें मानव अध्ययन में रही है. माउस जीन थेरेपी और आंखों में स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण वैक्टर की चिकित्सीय प्रभावकारिता परीक्षण के लिए एक महत्वपूर्ण वैज्ञानिक मॉडल बन गया है 5-8 इस वीडियो लेख में, हम जीन थेरेपी वैक्टर या स्टेम कोशिकाओं के subretinal अंतरिक्ष में इंजेक्षन तकनीक मौजूद है माउस आंख जबकि आसपास के ऊतकों को नुकसान को कम.
Protocol
1. Subretinal इंजेक्शन के लिए उपकरणों को इकट्ठा
- खरीद या एक गिलास केशिका ट्यूब से एक 100 सुक्ष्ममापी व्यास सुई. Sutter P-97 pipet डांड़ी या अन्य इसी तरह के उपकरणों का उपयोग करके मैन्युअल रूप से किया जा सकता है. केशिका ट्यूब के अंत और गर्म हो जाएगा खींच लिया है जब तक यह वांछित व्यास (100 मीटर) तक पहुँचता है. एक छोटे व्यास सुई जीन थेरेपी वैक्टर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, यह कोशिकाओं या आंख की क्षति के बिना सेल इंजेक्शन के लिए सिफारिश की व्यास है. स्टील की सुई की तुलना में, कांच केशिका सुई एक बहुत ही ठीक है, लेकिन कुंद टिप, रेटिना टूटना के कारण के बिना इंजेक्शन द्रव और subretinal अंतरिक्ष उपयोग के दृश्य के लिए अनुमति है. इन खींच लिया सुइयों साफ अगर एक बाँझ कंटेनर में 70% इथेनॉल, और दुकान का उपयोग करने की आवश्यकता है. टेप के साथ एक 15 सेमी बाँझ ऊतक संस्कृति डिश के लिए जगह में सुइयों पकड़ करने के लिए एक रास्ता है जो इंजेक्शन सुइयों को कवर और एक बाँझ वातावरण में रखने के लिए है. इस बिंदु पर compl,शल्य कमरे जहां प्रक्रिया जगह ले जाएगा के भीतर सेट अप Ete. यह आसान है आदेश के लिए यह बाँझ रहने के लिए हर समय में शल्य चिकित्सा के कमरे में सभी उपकरणों को रखने के लिए, खासकर अगर यह प्रक्रिया एक बाधा सुविधा के भीतर किया जाता है.
- Aspirate इंजेक्शन सुई में सिलिकॉन और सिलिकॉन बेदखल करने के लिए सुई की भीतरी दीवारों के साथ एक कोटिंग छोड़. सिलिकॉन कोटिंग कोशिकाओं और सुई बोर के माध्यम से वायरस है, जो अन्यथा भीतरी गिलास केशिका दीवारों के लिए छड़ी होगी के पारित होने के अधिकतम हो.
- बिंदु पर सुई के बाद सीधे 25 रक्त ¾ गेज luer ताला के साथ सेट संग्रह (टयूबिंग से सुई को हटाने) में कटौती करके एक बाँझ प्लास्टिक टयूबिंग की लगभग 8 सेमी लंबाई से प्राप्त करते हैं.
- एक 1 मिलीलीटर बाँझ खारा के साथ उप - क्यू 26 5/8-gauge पर्ची टिप सिरिंज भरें और सिरिंज से सुई हटा दें.
- प्लास्टिक टयूबिंग की कटौती को समाप्त करने के लिए इंजेक्शन सुई संलग्न है और luer ताला दूसरे में सिरिंज संलग्नअंत.
- बाँझ खारा Aspirate टयूबिंग और केशिका सुई, सुई के माध्यम से बाहर खदेड़ना कुछ खारा यह सुनिश्चित करना है कि यह किसी भी रिसाव के बिना सही ढंग से जुड़ा हुआ है में मृत अंतरिक्ष भरने. अगले, इंजेक्शन सुई की नोक में एक छोटे से, लगभग 1 हवा की μl राशि, aspirate. इस इंजेक्शन द्रव से खारा अलग है और एक दृश्य शल्य प्रक्रिया के दौरान इंजेक्शन द्रव के अंत का संकेत क्यू प्रदान करेगा. इंजेक्शन तंत्र एक 70% इथेनॉल के साथ नीचे शल्य प्रक्रिया के दौरान साफ स्वच्छ सतह पर रखा जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, सभी उपकरण शल्य प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया दोनों से पहले और 70% इथेनॉल के साथ के बाद साफ किया जाना चाहिए इंजेक्शन सुई जो पहले से ही बाँझ और उपयोग के लिए तैयार रखा जाना चाहिए के अपवाद के लिए,. शल्य चिकित्सा के बाद इन सुइयों का निपटारा किया जाना चाहिए, और फिर से इस्तेमाल किया नहीं.
- अंत में, इंजेक्शन वांछित पैक जीन थेरेपी वायरल वेक्टर या स्टेम कोशिकाओं से युक्त समाधान निकालना. यह द्वारा किया जा सकता हैएक बाँझ pipet टिप में इंजेक्शन समाधान ले, तो एक बाँझ सेल संस्कृति डिश की सतह पर समाधान pipetting. समाधान अब आसानी से इंजेक्शन सिरिंज का उपयोग कर सुई में aspirated जा सकता है. जरूरत राशि माउस की उम्र के आधार पर अलग अलग होंगे. हमारे प्रयोजनों के लिए हम प्रसवोत्तर दिन 5 चूहों, जो इंजेक्शन तरल पदार्थ की 0.5-0.8 μl इंजेक्शन के साथ किया जा सकता है का उपयोग करें. छोटे मात्रा, 0.5 μl या कम, छोटे चूहों और 1 μl के रूप में बड़ी मात्रा में है, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वयस्क चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वायरल या कोशिकाओं के अनुमापांक संख्या वायरस / कोशिकाओं इंजेक्शन जा रहा है और अपने वांछित लक्ष्य ऊतक के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए, के रूप में भी कई वायरल या एक छोटी मात्रा में कणों की कोशिकाओं रेटिना की कोशिकाओं के लिए विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. वीडियो में, दृश्य प्रयोजनों के लिए, हम 1.5 μl, आवश्यक से एक डाई के अधिक से अधिक राशि के लिए आंख में सुई का इस्तेमाल किया है.
2. Subretinal अंतरिक्ष प्रवेश
- बाँझ शल्य कमरे के भीतर,स्थिर या स्थानीय रूप से मंजूरी दे दी पशु हैंडलिंग प्रोटोकॉल, जो माउस की उम्र के हिसाब से बदलती के अनुसार माउस anesthetize. वयस्क चूहों के लिए आम संज्ञाहरण isoflurane गैस या अंतर peritoneal ketamine के 0.1 ml/10g शरीर के वजन (100 मिलीग्राम / एमएल) और बाँझ खारा में xylazine (20 मिग्रा / मिली) के एक इंजेक्शन का उपयोग भी शामिल है. प्रसवकालीन चूहों के लिए, सामान्य संज्ञाहरण तकनीक isoflurane गैस या cryoanesthesia (हाइपोथर्मिया) का उपयोग शामिल है. सभी संज्ञाहरण तकनीकों का उपयोग करने से पहले अपने स्थानीय IACUC समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए. हम आम तौर पर प्रसवोत्तर दिन का उपयोग (पी) 5 चूहों, हालांकि इसी तरह की तकनीक P0 या वयस्क चूहे के रूप में युवा के रूप में चूहों के लिए लागू किया जा सकता है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया नहीं जब तक माउस अंग और नहीं रह pinches पैर की अंगुली जवाब चल रह गया है शुरू कर सकते हैं. प्रसवकालीन चूहों के लिए, वे काफ़ी बाद से रक्त के प्रवाह को धीमा है, यह जानते हुए भी कि वे संज्ञाहरण के तहत पूरी तरह से कर रहे हैं के लिए एक और महत्वपूर्ण रंग में हल्का हो जाएगा.
- प्रसवकालीन चूहों में Vannas सीधे कैंची का उपयोग मीटरake बंद ढक्कन विदर साथ एक अनुमानित 1.5 मिमी चीरा. इंडेंटेशन, जहां स्वाभाविक रूप से आंख भविष्य में खुलेगा में कटौती करने के लिए सावधान रहो. यह सुनिश्चित करता है कि lids चंगा और माउस के विकास के दौरान ठीक से खुल जाएगा. एक सर्जिकल ब्लेड इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हम Vannas कैंची के बाद से वे इस प्रक्रिया के दौरान आंख puncturing के जोखिम को कम पसंद करते हैं. वीडियो में, कैंची और पलक मार्जिन साथ पंचर कटौती करने के लिए सीधे इस्तेमाल किया गया. जब इस तकनीक सीखने, संदंश को काटने से पहले पलक उठा और आंख हानिकारक के जोखिम को कम करने के लिए किया जाना चाहिए.
- घुमावदार ड्रेसिंग संदंश साथ अलग पलकें खींचो नजर proptose और पकड़ यह इंजेक्शन के लिए proptosed आंख के नीचे थोड़ा पलकें चुटकी. यदि ढक्कन दो कदम में बनाया चीरा बहुत बड़ी है, आँख lids के तहत वापस पर्ची और इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान पर्याप्त जोखिम को रोकने जाएगा. वयस्क चूहों, डॉ. के साथ आंख के आसपास मामूली दबाव लागू करने के लिएसंदंश essing इंजेक्शन के लिए proptosed आंख पकड़ सकते हैं.
- एक छोटे scleral चीरा या एक microsurgery 15 डिग्री ब्लेड के साथ सतह scratching द्वारा दुनिया की भूमध्य रेखा के पीछे. यह चीरा ही काफी बड़े के लिए इंजेक्शन सुई की नोक के पास है, लेकिन कोई उस से भी बड़ा होना चाहिए. अगर पसंद है, एक एक्यूपंक्चर सुई के रूप में इस तरह के एक छोटे, तेज़ सुई microsurgery ब्लेड की बजाय subretinal अंतरिक्ष में इस चीरा बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंधेरे में pigmented जानवरों में, एक काले भूरे pigmented ऊतक (रंजित रेटिना वर्णक उपकला) चीरा के बिंदु पर दिखाई हो जाएगा. लाइटर pigmented या सूरजमुखी मनुष्य चूहों में, एक शल्य चिकित्सा अंकन कलम microsurgery ब्लेड की नोक एक स्याही जगह चीरा साइट का संकेत छोड़ने के लिए लागू किया जा सकता है. यदि स्पष्ट (कांच का) चीरा साइट से तरल पदार्थ refluxes, ब्लेड भी गहरी रखा गया था और कांच का गुहा और प्रवेश चिकित्सकीय वायरस या कोशिकाओं को इंजेक्शन के दौरान intravitreal अंतरिक्ष में प्रवेश कर सकते हैं. Visualizati लिएप्रयोजनों पर, हम वीडियो में इस बात के लिए चीरा बना दिया है. यह अभी भी इस मामले में एक subretinal इंजेक्शन को पूरा करने के लिए संभव है, लेकिन रेटिना टुकड़ी इंजेक्शन तरल पदार्थ की उपस्थिति की वजह से पूरी तरह से इस माउस में ठीक नहीं हो सकता है. इसलिए, देखभाल करने के लिए इंजेक्शन से पहले केवल आंख की बाहरी सतह और रेटिना के माध्यम से कटौती नहीं लिया जाना चाहिए.
- ध्यान से चीरा साइट में इंजेक्शन सुई डालने और यह बाहरी आँख की दीवार समानांतर subretinal अंतरिक्ष में प्रवेश करने के लिए अग्रिम. आंख के भीतर भी बाहरी दीवार के करीब है या बहुत गहरी गलत स्थान में आगे बढ़ने के इंजेक्शन को निर्देशित करेंगे. समझने की है कि सुई सही स्थान के लिए सबसे अच्छा तरीका करने के लिए तकनीक का अभ्यास है. हल्के pigmented या सूरजमुखी मनुष्य चूहों पर अभ्यास subretinal अंतरिक्ष में सटीक और सही इंजेक्शन बनाने में मदद कर सकते हैं. इसका कारण यह है सुई और इंजेक्शन द्रव इन आँखों के भीतर दिखाई है.
- सिरिंज सवार प्रकाश दबाव लागू करें औरजिन वांछित तरल पदार्थ का इंजेक्शन. यदि सही ढंग से सुई subretinal अंतरिक्ष के भीतर रखा जाता है, मध्यम backpressure महसूस किया जाएगा. यदि सुई कांच का भीतर है, वहाँ काफी कम और इंजेक्शन के दौरान संभवतः कुछ तरल पदार्थ भाटा backpressure होगा. अगर कोई महत्वपूर्ण backpressure है, कम से कम एक अतिरिक्त 15 सेकंड के लिए जगह में सुई धीरे हटाने से पहले सुई पकड़. यह उच्च intraocular दबाव बजाय इंजेक्शन वायरस या कोशिकाओं चीरा साइट वापस बाहर refluxing के बराबर करने के लिए अनुमति देगा. हवा और खारा के कुछ subretinal बढ़ा इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान आवश्यक दबाव की वजह से अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया जा सकता है. देखभाल नहीं हवा या खारा से अधिक इंजेक्षन, क्योंकि यह आंख से बाहर इंजेक्शन वायरस या कोशिकाओं फ्लश कर सकते हैं लिया जाना चाहिए. बहुत ज्यादा द्रव subretinal अंतरिक्ष में इंजेक्शन की उपस्थिति से स्थायी रूप से रेटिना टुकड़ी का कारण यह भी संभव है. दृश्य प्रयोजनों के लिए अतिरिक्त डाई और हवा int इंजेक्ट किया गया थावीडियो में subretinal अंतरिक्ष ओ. यह स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है कि कैसे कुछ डाई वापस प्लावित जाएगा subretinal अंतरिक्ष के बाहर अगर ज्यादा भी इंजेक्शन है, लेकिन यह भी कैसे हवा बुलबुला subretinal अंतरिक्ष के भीतर रहता है और कांच का में गायब नहीं करता. यह करने के लिए जोर है कि इन इंजेक्शनों आँख का सही स्थान के भीतर सभी थे इस्तेमाल किया गया था, तो एक कल्पना कर सकते हैं कि कैसे सुई चीरा साइट में प्रवेश करना चाहिए. Subretinal अंतरिक्ष में सभी इंजेक्शन इंजेक्शन तरल पदार्थ की उपस्थिति के कारण एक अस्थायी रेटिना टुकड़ी का कारण. यदि इंजेक्शन प्रक्रिया को सही ढंग से पूरा हो गया है, इस अस्थायी रेटिना टुकड़ी 24 घंटे और चूहों के भीतर चंगा सभी आगे के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आंख लगभग एक शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की वजह से सप्ताह के लिए नरम रह सकती है तो, समय की इस अवधि के दौरान एक दूसरे इंजेक्शन से बचा जाना चाहिए.
- नवजात चूहों के लिए, घुमावदार ड्रेसिंग संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे lids पीछे आंख और कक्षा में धक्का. यह उपयोगी हो सकता हैएक मिनट के लिए प्रतीक्षा क्रम में वायरस subretinal अंतरिक्ष के भीतर व्यवस्थित करने के लिए और कारण जब धीरे से अपनी कक्षा में आंख वापस धक्का नहीं चीरा साइट के बाहर प्लावित की अनुमति है. सर्जरी के बाद, एक 0.5% bupivacaine ड्रॉप (marcaine) एक 25 गेज सुई से बाँझ खारा में 0.25% पतला इंजेक्शन स्थल पर रखा जा सकता है. चूहे subretinal सर्जरी के बाद संकट के लक्षण प्रकट नहीं दिखा है और एक लंबे समय से अभिनय सामयिक एनाल्जेसिक के रूप में bupivacaine का उपयोग पिछले तीन वर्षों के लिए पर्याप्त किया गया है. चूहे हमेशा शल्य प्रक्रिया के बाद संकट के किसी भी लक्षण के लिए देखो, जैसे संक्रमण, सूजन, या माउस के सामान्य दैनिक गतिविधियों में कमी के लिए निगरानी की जानी चाहिए. यदि इन होते हैं, पशुचिकित्सा और अधिसूचित किया जाना चाहिए buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) के रूप में आगे दर्द दवाओं एक intraperitoneal इंजेक्शन के रूप में दिया जा सकता है.
- संज्ञाहरण से स्थानीय रूप से मंजूरी दे दी जानवर से निपटने प्रोटोकॉल के अनुसार माउस जागो. माउस एक हीटिंग पी पर रखा जाना चाहिएविज्ञापन सामान्य शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए के रूप में यह चतनाशून्य करनेवाली औषधि से उठता है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए कम से कम पांच मिनट ले, गिनती संज्ञाहरण से गुजरना करने के लिए माउस के लिए समय नहीं चाहिए. इसलिए, एक हीटिंग पैड वास्तविक प्रक्रिया के दौरान आवश्यक नहीं है, लेकिन, जबकि एक तकनीक सीख रहा है प्रक्रिया के रूप में समय की एक लंबी अवधि में ले सकता है की जरूरत हो सकती है. माउस एक साफ पिंजरे में वापस नहीं रखा जाना चाहिए जब तक यह करने के लिए अपने दम पर चारों ओर ले जाने के लिए शुरू हो गया है. नवजात शिशुओं के लिए, कोमल पैर की अंगुली pinches के लिए उन्हें मदद करने के लिए पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने होगा, और वे माँ के साथ वापस रखा जा रहा है अपने गुलाबी रंग और आंदोलन से पहले हासिल करना चाहिए. चूहे संकट के किसी भी लक्षण के लिए समय पर निगरानी के रूप में पहले से सूचीबद्ध किया जाना चाहिए.
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Representative Results
माउस आँख की एक बैठक प्रमुख संदर्भ के लिए लेबल की संरचनाओं के साथ दिखाया गया है, तीर दोनों intravitreal और subretinal इंजेक्शन शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं (arrowheads, चित्रा 1) के लिए स्थानों को प्रदर्शित करने के साथ. जीन थेरेपी वैक्टर, lacZ lentiviral वेक्टर (चित्रा 2) के रूप में इंजेक्ट किया जा सकता है, इन स्थानों का उपयोग. इसके अतिरिक्त, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (चित्रा 3), जैसे स्टेम सेल, माउस आंख में इन साइटों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है.
एक lentiviral lacZ रिपोर्टर cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर (1x10 टीयू 8 / एमएल, Lentigen निगम, चित्रा 2A) द्वारा संचालित जीन ले सदिश का 1 μl C57BL/6J चूहों के subretinal अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया गया था. आंखें उम्र के छह सप्ताह में कुंद विच्छेदन द्वारा enucleated थे और 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान एक्स - लड़की (5mm कश्मीर 3 Fe (CN) 6, 2 मिमी 2 MgCl, 0.02% 40 एनपी, और 0 में डूबे.1% सोडियम) 37 पर रातोंरात deoxycholate डिग्री सेल्सियस आंखें 2% formaldehyde/0.2% glutaraldehyde में 30 मिनट और एक सूक्ष्म तक्षणी पर sectioned के लिए तय किया गया lacZ रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति. फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं का लगभग 10% में एक्स - लड़की उत्पाद (नीला) के रूप में पहचान की (चित्रा 2B). lacZ अभिव्यक्ति बरकरार है और आसपास के ऊतकों के intracellular उपस्थिति माउस आँख में सफल subretinal इंजेक्शन का संकेत मिलता है.
C57BL/6J माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ते) एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP, वेलकम ट्रस्ट सेंगर इंस्टीट्यूट) के साथ लेबल रहे थे. इन कोशिकाओं को फिर से एकत्र किए गए थे बाँझ में निलंबित फॉस्फेट-buffered खारा और प्रसवोत्तर दिन के subretinal अंतरिक्ष (पी) 5 C57BL/6J चूहों में प्रत्यारोपित 1x10 लगभग 5 1 μl प्रति इंजेक्शन कोशिकाओं के साथ. आंखें उम्र के दो सप्ताह में कुंद विच्छेदन द्वारा enucleated थे, एक sucrose ढाल में तय की और अक्टूबर embedding मध्यम में जमे हुए (ऊतक टेक). आंखें sectioned और विज़ थे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Zeiss) के तहत ualized. GFP लेबल ES कोशिकाओं की उपस्थिति इंजेक्शन माउस आंख (चित्रा 3A) के subretinal अंतरिक्ष के अंदर पाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, C57BL/6J-Tyr ग - 2j / जम्मू (C2J) माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ते) पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) के साथ electroporated थे और इन विट्रो में रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं में विभेदित. भेदभाव के एक महीने के बाद, YFP लेबल RPE तरह C2J ES कोशिकाओं बाँझ में निलंबित कर दिया गया है फॉस्फेट-buffered खारा और P5 C57BL/6J चूहों के subretinal अंतरिक्ष में इंजेक्शन. उम्र के 15 सप्ताह में, एक माउस visualized रेटिना भीतर YFP (Spectralis स्कैनिंग लेजर Confocal नेत्रदर्शक, हीडलबर्ग इंजीनियरिंग, 3B चित्रा) की उपस्थिति के लिए रहते इमेजिंग autofluorescence का उपयोग किया गया था.
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चित्रा 1. माउस आँख की योजनाबद्ध एक कार्टून ड्राइंग दोनों intravitreal और subretinal इंजेक्शन के रूप में चिह्नित प्रक्रियाओं (तीर) के लिए साइटों के साथ माउस आंख की संरचनाओं चित्रण.
चित्रा 2. एक जीन थेरेपी वायरल वेक्टर Subretinal इंजेक्शन. ए lentivirus वेक्टर मानचित्र दिखा lacZ रिपोर्टर जीन cytomegalovirus प्रमोटर (सीएमवी) के द्वारा संचालित है. प्रसवोत्तर पाँच दिन में subretinal इंजेक्शन के बाद एक छह सप्ताह पुरानी C57BL/6J माउस में रेटिना में lacZ रिपोर्टर जीन बी अभिव्यक्ति. RGC, रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं, लीग, भीतर परमाणु परत है, फोटोरिसेप्टर भीतरी क्षेत्रों (तीर); ONL, बाहरी परमाणु परत (photoreceptors) (arrowhead), ओएस, फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों.
चित्रा 3. माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (ते) के Subretinal इंजेक्शन ए. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) लेबल प्रसवोत्तर पाँच दिन में ES कोशिकाओं के subretinal इंजेक्शन के बाद एक दो सप्ताह पुरानी C57BL/6J माउस. GFP पॉजिटिव कोशिकाओं को इंजेक्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (Zeiss) का उपयोग कर आंख की subretinal अंतरिक्ष के भीतर दिखाई दे रहे हैं. ग्रीन, GFP-ES कोशिकाओं (तीर), RGL, रेटिना नाड़ीग्रन्थि परत, लीग, भीतर परमाणु परत, ONL, बाहरी परमाणु परत (photoreceptors), ओएस /, आंतरिक और बाहरी फोटोरिसेप्टर खंडों, RPE, रेटिना वर्णक उपकला लेबल. बी एक 15 सप्ताह पुरानी C57BL/6J माउस पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन की उपस्थिति (YFP) लेबल RPE रेटिना भीतर C2J माउस ES कोशिकाओं के लिए autofluorescence रहते इमेजिंग (Spectralis स्कैनिंग लेजर confocal नेत्रदर्शक, हीडलबर्ग इंजीनियरिंग) का उपयोग कर दिखाया रेटिना.RPE तरह YFP ES कोशिकाओं के इंजेक्शन Subretinal प्रसवोत्तर पाँच दिन में किया गया था.
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Discussion
इस वीडियो तकनीक subretinal इंजेक्शन शल्य प्रक्रिया को सफलतापूर्वक पूरा करने, और यह सुनिश्चित करना है कि जीन थेरेपी सदिश या आवश्यक स्थान पर कुशलतापूर्वक नेत्र रोग के इलाज में स्टेम कोशिकाओं को रखा जाता है पर निर्देश प्रदान करता है. इस तकनीक RPE या photoreceptors के रूप में रेटिना की कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है, क्योंकि यह इन कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्र में जीन थेरेपी वैक्टर या स्टेम सेल व्युत्पन्न ऊतकों स्थानों. पिछले विधियों intravitreal इंजेक्शन, जहां द्रव कांच का गुहा के भीतर रखा गया है शामिल है और रेटिना के माध्यम से विस्थापित करने में इन विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए करना चाहिए. Intravitreal इंजेक्शन जीन थेरेपी वैक्टर के पारगमन कि लक्ष्य photoreceptors या RPE नहीं है, क्योंकि सभी वायरल कणों को सही स्थान में विस्थापित हो जाएगा कम कर देता है. इसके अलावा, स्टेम सेल तेजी से लोकप्रिय होते जा रहे हैं रोगग्रस्त RPE या photoreceptors की जगह, और इन विभेदित कोशिकाओं उप भीतर प्रत्यारोपित किया जाना चाहिएरेटिना अंतरिक्ष 5.
इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम subretinal अंतरिक्ष में प्रविष्टि है, क्योंकि इस क्रम में चिकित्सीय प्रभावकारिता है, रेटिना टुकड़ी या आसपास आंख को नुकसान के लिए क्षमता को कम करने के साथ साथ जीन थेरेपी वैक्टर या स्टेम सेल व्युत्पन्न ऊतकों के सही स्थान सुनिश्चित करता है ऊतक. देखभाल करने के लिए समय के आगे troubleshoot करने के लिए लिया जाना चाहिए, लगाने और subretinal अंतरिक्ष में तरल पदार्थ इंजेक्षन करने में सक्षम हो. यह रंगीन डाई और सूरजमुखी मनुष्य चूहों का उपयोग अभ्यास के माध्यम से किया जा सकता है, के रूप में वीडियो में दिखाया गया है, के बाद से इंजेक्शन सुई pigmented चूहों की आँख के भीतर दिखाई नहीं होगा. अभ्यास के बाद, शोधकर्ता दबाव में अंतर है जब सही ढंग से द्रव subretinal अंतरिक्ष के भीतर रखा जाता है और यह एक समय पर ढंग से पूरा करने के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के साथ सहज हो महसूस करने के लिए सीखना होगा.
इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के लिए कुछ संभावित संशोधन कर रहे हैं. इन इंजेक्शनों का प्रदर्शन किया जा सकता हैअलग अलग उम्र के चूहों पर एड, हालांकि जीन थेरेपी वैक्टर या स्टेम सेल व्युत्पन्न ऊतकों इंजेक्शन की राशि माउस की उम्र के आधार पर भिन्न हो सकता है. देखभाल करने के लिए निर्धारित कितना तरल पदार्थ नेत्र रोग के लिए उपचार को बढ़ावा देने, लेकिन टुकड़ी और रेटिना को नुकसान लम्बा नहीं लिया जाना चाहिए. खींच लिया केशिका सुई विभिन्न diameters संशोधित किया जा सकता है. छोटे सुइयों वायरल इंजेक्शन के लिए पर्याप्त हैं, लेकिन बड़े व्यास सेलुलर प्रत्यारोपण के लिए बेहतर हो सकता है. इसके अलावा, सर्जरी वयस्क चूहों पर किया जा सकता है. नेत्र ऊतक का घनत्व काफी अधिक हो जाएगा, तो नए सिरे से, तेज सर्जिकल ब्लेड subretinal अंतरिक्ष में प्रवेश करने के लिए आवश्यक हैं. सभी मामलों में, यह एक जीन थेरेपी सदिश या स्टेम सेल व्युत्पन्न ऊतक के एक सफल subretinal इंजेक्शन पूरा प्रोटोकॉल पर आधारित संशोधनों बनाया जा सकता है.
सभी subretinal इंजेक्शन एक अस्थायी रेटिना टुकड़ी भीतर इंजेक्शन द्रव की मौजूदगी के कारण का कारण होगाsubretinal अंतरिक्ष, लेकिन इस टुकड़ी शल्य प्रक्रिया के 24 घंटे के भीतर ठीक करना चाहिए. चूहे ध्यान से किसी भी शेष टुकड़ी के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच की जा सकता है. यह संभव है कि कुछ चूहों को स्वाभाविक रूप से एक अच्छी तरह से रखा इंजेक्शन के बाद भी ठीक नहीं हो सकता है. सभी चूहों के लिए परीक्षा से गुजरना करने में सक्षम हैं और इस 24 घंटे की समय अवधि के बाद प्रयोगों, लेकिन आंख के लिए नरम इंजेक्शन प्रक्रिया से दबाव में परिवर्तन की वजह से एक सप्ताह तक के लिए हो सकता है. इसलिए, इस तकनीक का एक सीमा 1 पश्चात सप्ताह के दौरान माध्यमिक इंजेक्शन प्रदर्शन करने की क्षमता है. एक और इंजेक्शन के तत्काल पश्चात की अवधि के दौरान संभव नहीं हो सकता है, के बाद से रेटिना टुकड़ी की घटना बढ़ जाती है कि सर्जरी के बाद ठीक नहीं हो सकता है. यह समय की एक लंबी अवधि के लिए इंतजार करना, माउस आंख फिर से इंजेक्शन लगाने से पहले, के रूप में एक महीने के रूप में लंबे समय के लिए सलाह दी है.
माउस नेत्र रोग और संभावित उपचारों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव बन गया हैमानव नैदानिक परीक्षण करने के लिए टोपी नेतृत्व 9-12 इस प्रक्रिया का एक दूसरा सीमा यह है कि नहीं सभी कोशिकाओं subretinal इंजेक्शन के बाद डीएनए वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं, के रूप में वे एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में होगा. जाएगा. हालांकि, इस प्रक्रिया को और अधिक बारीकी से लगभग मनुष्य के में जहां सेल हर ट्रांसफ़ेक्ट नहीं है एक नैदानिक प्रक्रिया हो सकता है. इस प्रकार, इस तकनीक के लिए जीन थेरेपी वायरल वैक्टर या स्टेम सेल व्युत्पन्न प्रत्यारोपण के लिए ऊतक उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन और मानव में अन्य vitreoretinal रोगों का इलाज चिकित्सा के लिए व्यवहार्यता स्थापित करने में मदद कर सकते हैं. भविष्य अनुप्रयोगों अलग रेटिना सेल प्रमोटरों और विभेदित स्टेम कोशिकाओं, या भी कई इंजेक्शन उपचार का एक संयोजन का उपयोग का उपयोग शामिल कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Takayuki नागासाकी से प्रायोगिक सहायता, अंधापन को रोकने के इस शोध अनुसंधान नेत्र और दृश्य अनुसंधान में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO वक्तव्य के साथ अनुपालन. KJW NIH 5T32EY013933 और 5T32DK007647-20 अनुदान द्वारा समर्थित है. VBM NIH अनुदान K08EY020530 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12"; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
References
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