Summary
Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.
Abstract
Der Verlust der Sehkraft betrifft etwa 3,4 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und wird voraussichtlich in den kommenden Jahren zu erhöhen. 1 Kürzlich, Gentherapie und Stammzelltransplantationen sind zu den wichtigsten therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Blindheit infolge degenerativer Netzhauterkrankungen. Verschiedene Formen der autologen Transplantation für altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), wie Iris Pigmentepithel-Transplantation haben ermutigende Ergebnisse erzeugt und klinischen Studien am Menschen sind für andere Formen der Gen-und Stammzelltherapie begonnen. 2 Dazu gehören RPE65 Genersatz Therapie bei Patienten mit angeborenen Amaurose Leber und einem RPE Zelltransplantation Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) in Stargardt-Krankheit. 3-4 Da es mittlerweile Gentherapievektoren und Stammzellen für die Behandlung bei Patienten mit retinalen Erkrankungen ist es wichtig zu überprüfen, diese mögliche Therapien im Tiermodell vor geltenING sie in Studien am Menschen. Die Maus ist ein wichtiges wissenschaftliches Modell zur Prüfung der therapeutischen Wirksamkeit von Vektoren für die Gentherapie und Stammzelltransplantation in die Augen. 5-8 In diesem Video Artikel präsentieren wir eine Technik, um Vektoren für die Gentherapie oder Stammzellen in den subretinalen Raum zu injizieren die Maus Auges minimiert Beschädigung des umgebenden Gewebes.
Protocol
Ein. Montieren Sie Geräte für den subretinalen Injektion
- Kauf oder eine 100 Mikrometer Durchmesser Nadel aus einer Glaskapillare. Dies kann manuell mit Hilfe eines P-97 Sutter Pipette Abzieher oder ähnliche Ausrüstung durchgeführt werden. Das Ende des Kapillarrohrs wird erhitzt und gezogen werden kann, bis er den gewünschten Durchmesser (100 um) erreicht. Ein kleinerer Durchmesser Nadel kann für die Gentherapie-Vektoren verwendet werden, jedoch ist dies die empfohlene Durchmesser für Zellinjektion ohne Schädigung der Zellen oder des Auges. Verglichen mit Stahlnadeln weist das Glas Kapillarnadel einen sehr feinen, jedoch stumpfe Spitze, zur Visualisierung der Injektionsflüssigkeit und Zugang zum Subretinalraum ohne retinalen Brechen ermöglichen. Reinigen Sie diese gezogen Nadeln bei Bedarf unter Verwendung von 70% igem Ethanol, und speichern Sie in einem sterilen Behälter. A 15 cm sterile Gewebekulturschale mit Klebeband, um die Nadeln in Position zu halten ist eine Art und Weise, halten die Injektionsnadeln abgedeckt und in einer sterilen Umgebung um. An diesem Punkt, komplete den Aufbau innerhalb des chirurgischen Raum, in dem das Verfahren stattfindet. Am einfachsten ist es, alle Geräte im Operationssaal zu allen Zeiten, damit es zu bleiben steril zu halten, vor allem, wenn dieses Verfahren innerhalb einer Barriere Anlage durchgeführt wird.
- Anzusaugen Silikon in die Injektionsnadel und Auswerfen der Silikon um eine Beschichtung entlang der Innenwände der Nadel zu verlassen. Die Silikonbeschichtung maximiert den Durchtritt von Zellen und Viren durch die Nadelbohrung, die ansonsten zu den inneren Wänden würde Glaskapillare kleben.
- Erhalten etwa 8 cm Länge von sterilen Kunststoffschlauch durch Schneiden eines 25 ¾-Gauge Blutentnahme mit Luer-Lock an dem Punkt eingestellt direkt nach der Nadel (Entfernen der Nadel aus der Schläuche).
- Füllen Sie eine 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge Slip-Spitze Spritze mit steriler Kochsalzlösung und entfernen Sie die Nadel aus der Spritze.
- Befestigen der Injektionsnadel an dem abgeschnittenen Ende des Kunststoffschlauchs und befestigen die Spritze mit dem Luer-Lock an dem anderenEnde.
- Anzusaugen steriler Kochsalzlösung, um die toten Raum in der Rohrleitung und Kapillarnadel Ausschleudern einige Kochsalzlösung durch die Nadel, um sicherzustellen, dass sie korrekt ohne Leckage befestigt füllen. Weiter aspirieren eine kleine, ungefähr 1 ul Luftmenge in die Spitze der Injektionsnadel. Dadurch wird die Salzlösung aus der Injektionsflüssigkeit zu trennen und einen visuellen Hinweis, der das Ende der Injektionsflüssigkeit während der chirurgischen Prozedur. Das Injektionsgerät sollte auf einer sauberen Oberfläche hinunter mit 70% Ethanol während der chirurgischen Prozedur abgewischt gehalten werden. Außerdem sollten alle Einrichtung während der chirurgischen Prozedur verwendet sowohl vor und nach mit 70% Ethanol gereinigt werden, für die Ausnahme der Injektionsnadeln, die bereits steril gehalten und einsatzbereit sein sollen. Diese Nadeln sollten nach der Operation beseitigt werden, und nicht wieder verwendet werden.
- Schließlich anzusaugen Injektionslösung, enthaltend die gewünschte verpackte Gentherapie viralen Vektor oder Stammzellen. Dies kann geschehen durchAufnehmen der Injektionslösung in einem sterilen Pipettenspitze, dann Pipettieren der Lösung auf die Oberfläche eines sterilen Zellkulturschale. Die Lösung kann nun problemlos in die Injektionsnadel mit der Spritze abgesaugt werden kann. Die benötigte Menge wird abhängig vom Alter des Maus variieren. Für unsere Zwecke verwenden postnatalen Tag 5 Mäusen, die mit 0,5 bis 0,8 ul Injektionsflüssigkeit injiziert werden kann. Kleinere Mengen, 0,5 ul oder weniger, für jüngere Mäusen und größere Mengen, wie 1 ul verwendet werden kann, kann für erwachsene Mäuse verwendet werden. Der virale Titer oder Anzahl der Zellen benötigt, um basierend auf den Virus / Zellen injiziert und ihre gewünschten Zielgewebe bestimmt werden können, da zu viele virale Partikel oder Zellen in einem kleinen Volumen der Toxizität für die Zellen der Netzhaut führen. In dem Video zur Visualisierung, haben wir 1,5 ul, eine größere Menge an Farbstoff als notwendig, um in das Auge injiziert verwendet.
2. Zugriff auf den subretinalen Raum
- Innerhalb des sterilen OP-Raum,stabilisieren oder zu betäuben die Maus nach dem örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll, das durch das Alter der Maus variieren. Gemeinsame Anästhesie für erwachsene Mäuse umfasst die Verwendung von Gas oder einem Isofluran intraperitoneale Injektion von 0,1 ml/10g Körpergewicht Ketamin (100 mg / ml) und Xylazin (20 mg / ml) in steriler Kochsalzlösung. Für perinatalen Mäusen, gehören gemeinsame Anästhesietechniken die Verwendung von Isofluran Gas oder cryoanesthesia (Hypothermie). Alle Anästhesietechniken muss von Ihrem lokalen IACUC Ausschuss vor genehmigt werden. Wir verwenden typischerweise postnatalen Tag (P) 5 Mäusen, obwohl ähnliche Techniken an Mäuse im Alter von P0 oder an erwachsenen Mäusen angewendet werden können. Der chirurgische Eingriff kann erst beginnen, wenn die Maus nicht mehr bewegen die Gliedmaßen und reagiert nicht mehr auf Prisen Fuß. Für perinatalen Mäusen, werden sie merklich heller in der Farbe, da der Blutfluss verlangsamen, eine andere Taste, um zu wissen, dass sie vollständig unter Narkose sind.
- In perinatalen Mäusen, verwenden Vannas geraden Schere make eine ungefähre 1,5 mm Inzision entlang der geschlossenen Lidspalte. Seien Sie vorsichtig bei der Vertiefung, wo das Auge natürlich in die Zukunft öffnet geschnitten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Lider heilen und öffnen Sie richtig bei der Entwicklung der Maus. Chirurgische Klinge kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl wir Vannas Schere da sie das Risiko von Punktieren des Auges während dieser Vorgang weniger bevorzugen. In dem Video wurden die Schere direkt Punktion und Schnitt entlang der Lidrand verwendet. Beim Lernen dieser Technik sollte verwendet werden, um die Zangen Augenlids vor dem Schneiden heben und das Risiko der Beschädigung des Auges werden.
- Auseinanderziehen die Augenlider mit gebogenen Kornzange das Auge proptose und kneifen die Augenlider leicht unterhalb des Auges zu halten proptosed zur Injektion. Wenn der Deckel Einschnitt in Schritt zwei gemacht zu groß ist, wird das Auge schlüpfen wieder unter den Deckeln und damit eine ausreichende Belichtung während der Injektion. Für erwachsene Mäuse, mit leichtem Druck um die Augen mit drEssing Pinzette halten kann das Auge für die Injektion proptosed.
- Machen Sie eine kleine Sklera Einschnitt am oder hinter dem Globus Äquators durch Kratzer auf der Oberfläche mit einem 15-Grad-Mikrochirurgie Klinge. Dieser Einschnitt sollte nur groß genug, um die Spitze der Injektionsnadel passieren, aber nicht größer als die. Falls gewünscht, kann eine kleine, spitze Nadel wie einer Akupunkturnadel verwendet, um dieses Einschnitts in den subretinalen Raum anstelle der Mikrochirurgie Klinge herzustellen. In dunkel pigmentierten Tieren wird eine dunkelbraun-pigmentierten Gewebebereich (die Aderhaut-Netzhautpigmentepithels) sichtbar an der Stelle des Einschnitts. In leichteren pigmentierte oder Albinomäusen, kann eine chirurgische Markierungsstiftes zur Spitze der Klinge Mikrochirurgie, um eine Tinte, die den Ort Inzisionsstelle gehandhabt werden können. Wenn klar (Glaskörper) Flüssigkeit Rückflüsse aus dem Inzisionsstelle wurde die Klinge gelegt zu tief und trat in den Glaskörperraum und die therapeutische Viren oder Zellen die intravitreale Raum während der Injektion geben. Für visualizatiauf Zwecke haben wir den Einschnitt zu diesem Punkt in dem Video. Es ist immer noch möglich, eine subretinale Injektion in diesem Fall zu vervollständigen, aber die Netzhautablösung durch die Anwesenheit der Injektionsflüssigkeit verursacht möglicherweise nicht vollständig in dieser Maus zu heilen. Daher muss darauf geachtet werden, nur die äußere Oberfläche des Auges und nicht durch die Retina vor der Injektion geschnitten werden.
- Schieben Sie die Injektionsnadel in die Inzisionsstelle und fördern sie parallel zum äußeren Auges Wand, um den subretinalen Raum geben. Vorrücken zu nahe an der Außenwand oder zu tief innerhalb des Auges wird die Einspritzung in der falschen Stelle zu lenken. Das beste Verfahren zu verstehen, ob die Nadel in der richtigen Position ist, um die Technik zu praktizieren. Üben auf leicht pigmentiert oder Albinomäusen kann helfen, präzise und genaue Injektionen in den subretinalen Raum zu machen. Dies liegt daran, dass die Nadel und der Einspritzfluid sichtbar ist innerhalb dieser Augen.
- Wenden Sie leichten Druck auf den Spritzenkolben und seinGin Injektion des gewünschten Fluids. Wenn die Nadel korrekt in den subretinalen Raum gestellt wird, moderate Gegendruck zu spüren sein. Wenn die Nadel in den Glaskörper, wird es deutlich weniger Gegendruck und möglicherweise etwas Fluid Rückfluß während der Injektion sein. Wenn eine erhebliche Gegendruck, halten die Nadel an Ort und Stelle für mindestens weitere 15 Sekunden vor dem Entfernen der Nadel langsam. Dies ermöglicht es dem hohen Augeninnendruck zu entzerren anstelle des Rückfluss des eingespritzten Virus oder Zellen wieder aus der Einschnittstelle. Ein Teil der Luft und Kochsalzlösung kann in den subretinalen Raum aufgrund des erhöhten Drucks während der Injektion benötigt injiziert werden. Es sollte darauf geachtet, nicht über injizieren Luft oder Kochsalzlösung, da es bündig kann das injizierte Virus oder Zellen aus dem Auge werden. Es ist auch möglich, dauerhafte Netzhautablösung aus dem Vorhandensein von zu viel Flüssigkeit in den subretinalen Raum injiziert verursachen. Zur Visualisierung wurde überschüssiger Farbstoff und Luft injiziert into die subretinalen Raum in dem Video. Es ist deutlich zu sehen, wie ein Teil des Farbstoffes Rücken wird gespült werden aus dem subretinalen Raum, wenn zu viel eingespritzt wird, sondern auch, wie die Luftblase im subretinalen Raum bleibt und nicht in den Glaskörper verschwinden. Dies wurde verwendet, um zu betonen, dass diese Injektionen alle innerhalb der richtigen Stelle des Auges waren, so kann man visualisieren, wie die Nadel den Einschnitt Website eingeben. Alle Injektionen in den subretinalen Raum zu einer vorübergehenden Netzhautablösung aufgrund des Vorhandenseins der Injektionsflüssigkeit. Wenn die Injektion Verfahren korrekt abgeschlossen ist, wird diese temporäre Netzhautablösung innerhalb von 24 Stunden und Mäuse heilen kann für alle weiteren Experimente verwendet werden. Das Auge kann bleiben für etwa eine Woche wegen des chirurgischen Eingriffs weich, so dass eine zweite Einspritzung während dieser Zeit sollte vermieden werden.
- Für neugeborenen Mäusen, verwenden Sie die gebogenen Dressing Pinzette vorsichtig die Augen hinter den Lidern und in die Umlaufbahn. Es kann nützlichfür eine Minute, um zu ermöglichen, um das Virus innerhalb des subretinalen Raumes absetzen und nicht dazu führen, dass aus der Einschnittstelle gespült werden, wenn sanftes Drücken des Auges zurück in seine Umlaufbahn. Nach der Operation eines Tropfens 0,5% Bupivacain (Marcain) bis 0,25% in steriler Kochsalzlösung aus einer 25-Gauge-Nadel verdünnt können an der Injektionsstelle platziert werden. Mäuse zeigen keine offensichtlichen Anzeichen von Leiden nach subretinale Chirurgie und die Verwendung von Bupivacain als langwirksame aktuelles Analgetikum ist seit den letzten drei Jahren reichlich. Mäuse sollten immer nach dem chirurgischen Eingriff überwacht werden, um auf Anzeichen von Stress suchen; wie Infektionen, Schwellungen oder einer Abnahme der normalen täglichen Aktivitäten der Maus. Wenn diese auftreten, sollte der Tierarzt benachrichtigt und weitere Schmerzmittel wie Buprenorphin (0,05 mg / kg) kann als eine intraperitoneale Injektion verabreicht werden.
- Wake the mouse aus der Narkose nach örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll. Die Maus sollte auf einer Heizplatte p gehalten werdenad beizubehalten normale Körpertemperatur, wie es aus der Narkose aufwacht. Der chirurgische Eingriff sollte weniger als fünf Minuten in Anspruch nehmen, nicht mitgerechnet die Zeit für die Maus auf die Anästhesie unterziehen. Daher ist ein Heizkissen nicht während des eigentlichen Verfahrens notwendig, kann aber benötigt, während man das Erlernen der Technik, da das Verfahren eine längere Zeit dauern könnte. Die Maus sollte nicht wieder in einem sauberen Käfig gelegt werden, bis sie begonnen hat sich zu bewegen auf seine eigenen. Für Neugeborene wird sanften Fuß drückt ihnen helfen, in vollem Umfang von der Narkose erholen, und sie sollten ihre rosa Farbe und Bewegung, bevor sie wieder mit der Mutter gelegt zurückzugewinnen. Mäuse sollten im Laufe der Zeit auf Anzeichen von Stress überwacht werden, da zuvor aufgeführten.
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Representative Results
Eine Zeichnung der Maus Auge mit großen Strukturen als Referenz bezeichnet gezeigt, mit Pfeilen Darstellung der Standorte für beide intravitrealen und subretinale Injektion chirurgischen Eingriffen (Pfeilspitzen, Abbildung 1). Gentherapie-Vektoren, wie das lacZ lentiviralen Vektor (Figur 2), kann unter Verwendung dieser Positionen injiziert werden. Zusätzlich können Stammzellen, wie embryonalen Stammzellen der Maus (Abbildung 3), auch an diesen Stellen in der Maus transplantiert werden Auges.
1 ul eines lentiviralen Vektors, der das lacZ-Reportergen von dem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor (1x10 8 TU / ml, Lentigen Corporation, 2A) angetrieben wurde in den subretinalen Raum des C57BL/6J Mäuse injiziert. Die Augen wurden am Alter von sechs Wochen durch stumpfe Dissektion entkernt und eingetaucht in 1 mg / ml X-gal-Lösung (5 mM K 3 Fe (CN) 6, 2 mM MgCl 2, 0,02% NP 40, und 0.1% Natriumdesoxycholat) über Nacht bei 37 ° C. Augen wurden in 2% formaldehyde/0.2% Glutaraldehyd für 30 min und geschnitten auf einem Mikrotom fixiert. LacZ-Reportergen Expression wurde als X-gal Produkt (blau) in etwa 10% der Photorezeptorzellen detektiert (Fig. 2B). Die intrazelluläre Anwesenheit von lacZ Expression und der intakten umgebenden Gewebe zeigen die erfolgreiche subretinalen Injektion in der Maus Auge.
C57BL/6J Maus embryonale Stammzellen (ES)-Zellen wurden mit einem grün fluoreszierenden Protein (eGFP, Wellcome Trust Sanger Institute) markiert. Diese Zellen wurden dann gesammelt und in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung und transplantiert in den subretinalen Raum des postnatalen Tag (P) 5 C57BL/6J-Mäusen mit ca. 1x10 5 Zellen pro 1 ul injiziert. Augen waren zwei Wochen im Alter von durch stumpfe Dissektion entkernt, fixiert in einem Saccharose-Gradienten und eingefroren in Oktober Einbettmedium (Tissue-Tek). Augen waren geschnitten und vis ualized unter dem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss). Die Anwesenheit von GFP-markierten ES-Zellen können in den subretinalen Raum des Auges injiziert Maus (3A) entnommen werden. Zusätzlich wurden C57BL/6J-Tyr c-2j / J (C2J) Maus embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mit gelben fluoreszierenden Protein (YFP) elektroporiert und differenziert in retinale Pigmentepithel (RPE)-Zellen in vitro. Nach einem Monat der Differenzierung wurden die YFP-markierten RPE-ähnliche C2J ES-Zellen in steriler suspendiert phosphatgepufferter Kochsalzlösung injiziert und in den subretinalen Raum des P5 C57BL/6J-Mäusen. Bei 15 Wochen alt, war eine Maus visualisiert mit Live-imaging Autofluoreszenz für das Vorhandensein von YFP in der Netzhaut (Spectralis Scanning Laser Konfokale Ophthalmoskop, Heidelberg Engineering, 3B).
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Abbildung 1. Schematische Darstellung des Maus-Eye. Eine Karikatur Zeichnung, die Strukturen der Maus Auge mit Standorten sowohl für intravitreale und subretinale Injektion Verfahren markiert (Pfeilspitzen).
Abbildung 2. Subretinale Injektion einer Gentherapie viralen Vektor. A. Lentivirus Vektorkarte zeigt den lacZ-Reporter-Gen durch den Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor angetrieben wird. B. Expression des lacZ Reportergens in der Netzhaut in einem sechs Wochen alten C57BL/6J Maus nach subretinalen Injektion bei postnatalen Tag fünf. RGC, retinalen Ganglienzellen; INL, inneren Körnerschicht; IS, Photorezeptor inneren Segmente (Pfeil); ONL äußeren Körnerschicht (Fotorezeptoren) (Pfeilspitze); OS Photorezeptor äußeren Segmente.
Abbildung 3. Subretinalen Injektion von embryonalen Stammzellen der Maus (ES-Zellen). A. A 2 Wochen alt C57BL/6J Maus nach subretinalen Injektion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-markierten ES-Zellen bei postnatalen Tag fünf. GFP-positive Zellen sind sichtbar in den subretinalen Raum des Auges injiziert mittels Fluoreszenzmikroskopie (Zeiss). Green, GFP-markierten ES-Zellen (Pfeile); RGL, retinalen Ganglienzellen Schicht; INL, inneren Körnerschicht; ONL äußeren Körnerschicht (Fotorezeptoren); IS / OS, inneren und äußeren Segmenten Photorezeptor; RPE, Netzhautpigmentepithels. B. Eine 15 Wochen alte C57BL/6J Maus Netzhaut dargestellt durch Autofluoreszenz Live-imaging (Spectralis Konfokale Scanning Laser Ophthalmoskop, Heidelberg Engineering) für das Vorhandensein von gelb fluoreszierendes Protein (YFP)-markierten RPE-ähnliche C2J Maus-ES-Zellen in der Netzhaut.Subretinalen Injektion der RPE-like YFP-ES-Zellen wurde bei postnatalen Tag fünf durchgeführt.
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Discussion
Dieses Video-Technik enthält Anweisungen zum Ausfüllen des subretinalen Injektion chirurgischen Eingriff erfolgreich, und sicherzustellen, dass die Gentherapie-Vektor oder Stammzellen in der Lage erforderlich sind, um effizient behandeln die Augenerkrankung platziert werden. Diese Technik erlaubt die Targeting von Retinazellen wie RPE oder Photorezeptoren, da es die Gentherapievektoren oder Stammzellen abgeleiteten Geweben stellt sich in der Nähe dieser Zellen. Frühere Verfahren involviert intravitreale Injektionen, wo das Fluid in den Glaskörperraum aufgesetzt und muß durch die Netzhaut zu migrieren, um diese spezifische Bereiche zielen. Intravitreale Injektion reduziert die Transduktion von Vektoren für die Gentherapie, dass Ziel-Photorezeptoren oder der RPE, da nicht alle viralen Partikel in die richtige Position zu migrieren. Darüber hinaus werden Stammzellen immer beliebter, um kranken RPE oder Photorezeptoren zu ersetzen, und diese differenzierten Zellen müssen innerhalb der sub transplantiert werdenretinalen Raum. 5
Der entscheidende Schritt in diesem Verfahren ist der Eintritt in den subretinalen Raum, da dies sorgt für die richtige Lage des Gentherapievektoren oder Stammzellen abgeleiteten Geweben, um therapeutische Wirksamkeit besitzen, zusammen mit reduzierenden das Potential für Netzhautablösung oder Beschädigung des umgebenden Auges Gewebe. Darauf zu achten, im voraus zu beheben werden; zu können lokalisieren und Injizieren des Fluids in den subretinalen Raum. Dies kann durch den Einsatz von farbigen Praxis Farbstoff und Albinomäusen erfolgen, wie in dem Video dargestellt, da die Injektionsnadel nicht sichtbar im Auge von pigmentierten Mäusen. Nach der Praxis wird die Forscher lernen, die Druckdifferenz, wenn das Fluid richtig in den subretinalen Raum platziert und bequem mit dem chirurgischen Verfahren, um es rechtzeitig abzuschließen fühlen.
Es gibt einige mögliche Modifikationen für diesen chirurgischen Eingriff. Diese Injektionen werden durchgeführted an Mäusen unterschiedlichen Alters, obwohl die Menge des Gentherapievektoren oder Stammzellen abgeleiteten Gewebe injiziert könnte je nach Alter des Maus variieren. Es ist darauf zu bestimmen, wie viel Fluid Behandlung für die Augenerkrankung zu fördern, aber nicht verlängert Ablösen und eine Schädigung der Netzhaut werden. Der gezogene Kapillarnadel können modifiziert werden, um unterschiedliche Durchmesser aufweisen. Kleinere Nadeln sind ausreichend für virale Injektionen, aber größeren Durchmessern kann besser sein, für die zelluläre Transplantation. Darüber hinaus kann die Operation an erwachsenen Mäusen durchgeführt werden. Das Auge Gewebedichte wird viel größer sein, sind so frisch, scharf chirurgische Messer benötigt, um in den subretinalen Raum eindringen. In allen Fällen können Modifikationen basierend auf diesem Protokoll, um eine erfolgreiche subretinale Injektion eines Gentherapievektor oder Stammzellen abgeleiteten Gewebe durchführen kann.
Alle subretinale Injektion wird eine temporäre Netzhautablösung aufgrund der Anwesenheit des eingespritzten Fluids innerhalb der Ursachesubretinalen Raum, aber das Ablösen sollte innerhalb von 24 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff zu heilen. Mäuse können sorgfältig unter dem Mikroskop für jeden weiteren Ablösung überprüft werden. Es ist möglich, dass einige Mäuse können natürlich nicht heilen auch nach einem gut platzierten Injektion. Alle Mäuse können Untersuchung unterzogen und Experimente nach dieser 24-Stunden-Periode, aber das Auge kann weich aufgrund einer Änderung in dem Druck der Einspritzvorgang für bis zu einer Woche. Daher ist ein Problem bei dieser Vorgehensweise die Möglichkeit, sekundäre Einspritzungen während der ersten postoperativen Woche durchzuführen. Ein weiterer Injektion kann nicht während der unmittelbaren postoperativen Phase nicht möglich, da die Inzidenz der Netzhautablösung, die nicht nach der Operation heilt erhöht. Es wird empfohlen, für eine längere Zeitdauer zu warten, so lange wie einen Monat, bevor sie wieder Injizieren der Maus Auge.
Die Maus ist zu einem wichtigen Modellorganismus zur ophthalmologischen Krankheit und mögliche Therapien t studierenHut zu klinischen Studien am Menschen führen. 9-12 Eine zweite Einschränkung dieses Verfahrens ist, daß nicht alle Zellen mit DNA-Vektoren nach subretinale Injektion transfiziert werden, wie sie in einer transgenen Mausmodell wäre. Jedoch kann dieses Verfahren besser anzunähern ein klinisches Verfahren beim Menschen, wo nicht jede Zelle transfiziert wird. Somit kann diese Technik hilft die Durchführbarkeit für die Gentherapie virale Vektoren oder Stammzellen abgeleiteten Gewebetransplantation Therapie der altersabhängigen Makuladegeneration und andere vitreoretinalen Erkrankungen beim Menschen zu behandeln etablieren. Zukünftige Anwendungen kann die Verwendung von verschiedenen Promotoren und retinale Zelle differenzierten Stammzellen, oder sogar mehrere Injektionen unter Verwendung einer Kombination von Behandlungen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Forschung zur Erblindung verhindern; Experimentelle Unterstützung von Takayuki Nagasaki; Diese Forschung entspricht der ARVO Statement für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Visual Research. KJW durch die NIH Zuschüsse 5T32EY013933 und 5T32DK007647-20 unterstützt. VBM wird durch NIH K08EY020530 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12"; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
References
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