ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
هذه الطريقة الجديدة تسمح وقت واحد تسجيل من داخل الخلايا العصبون الحركي الكبار ماوس واحدة وقياس القوة التي تنتجها الألياف العضلية لها. التحقيق الجمع بين الخصائص الكهربائية والميكانيكية من الوحدات الحركية في الحيوانات المعدلة وراثيا والعادي هو طفرة لدراسة الجهاز العصبي العضلي.
Abstract
كان العصبون الحركي الشوكي طويلة نظام نموذجا جيدا لدراسة وظيفة العصبية لأنها من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي مع خصائص فريدة من (1) وجود أهداف محددة بسهولة (ألياف العضلات)، وبعد ذلك وظيفة معروفة جدا (للسيطرة على تقلص العضلات)، (2) أن يكون الهدف من العديد من شبكات متقاربة في العمود الفقري والهابطة، ومن هنا جاء اسم "الطريق الشائع النهائي"؛ و (3) وجود سوما كبيرة مما يجعل من الممكن لاختراق لهم الأقطاب داخل الخلايا حادة . وعلاوة على ذلك، عندما درس في الجسم الحي، فمن الممكن لتسجيل النشاط الكهربائي في وقت واحد من العصبونات الحركية والقوة التي وضعها أهداف عضلاتهم. أداء التسجيلات داخل الخلايا في الجسم الحي من العصبونات الحركية بالتالي وضع experimentalist في موقف فريد من القدرة على دراسة، في الوقت نفسه، كل من المقصورات "وحدة موتور" (الاسم الذي يطلق على العصبون الحركي، محور عصبي والخمسين، وألياف العضلات أنه يعصب 1): المدخلات التي تؤثر على العصبون الحركي، والخصائص الكهربية للالعصبون الحركي، وأثر هذه الخصائص على وظيفة العصبونات الحركية الفسيولوجية لل، أي القوة التي تنتجها وحدة المحرك لها. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو صعبة للغاية لأن إعداد لا يمكن أن تكون مشلولة، وبالتالي يتم تقليل الاستقرار الميكانيكية للتسجيل داخل الخلايا. وهكذا، تم فقط هذا النوع من التجارب التي تحققت في القطط والفئران في. ومع ذلك، يمكن دراسة نظم المحركات الشوكي إحداث نقلة هائلة إذا كان من الممكن إجراء تجارب مماثلة في الفئران العادية والمعدلة وراثيا.
لأسباب فنية، ومعظمها تم دراسة شبكات العمود الفقري في الفئران حديثي الولادة تقتصر على الأعمال التحضيرية في المختبر، حيث العصبونات الحركية في العمود الفقري والشبكات هي غير ناضجة، يتم فصل العصبونات الحركية من أهدافها، وعندما درس في شرائح، مويتم فصل toneurons من معظم مدخلاتها. حتى وقت قريب، لم يحصل إلا على مجموعات قليلة تمكنت من تنفيذ تسجيلات العصبونات الحركية داخل الخلايا في الجسم الحي 2-4، بما في ذلك فريق العمل لدينا الذي نشر على إعداد الجديد الذي سمح لنا للحصول على تسجيلات مستقرة جدا من العصبونات الحركية في الجسم الحي في الفئران البالغة 5،6. ومع ذلك، تم الحصول على هذه التسجيلات في الحيوانات بالشلل، أي دون أن يتمكن من تسجيل الإخراج قوة هذه العصبونات الحركية. هنا نقدم امتدادا لهذا المستحضر الأصلي الذي تمكنا من الحصول على تسجيلات في وقت واحد من الخصائص الكهربية للالعصبونات الحركية والقوة التي وضعتها وحدة السيارات الخاصة بهم. هذا إنجاز هام، لأنه يتيح لنا التعرف على أنواع مختلفة من العصبونات الحركية استنادا الى البيانات الشخصية قوتها، وبالتالي الكشف عن وظيفتها. إلى جانب النماذج الوراثية إزعاج الدوائر قطعي الشوكي 7-9، أو reproducting disea الإنسانSE 10،11، فإننا نتوقع أن تكون هذه التقنية أداة أساسية لدراسة الجهاز الحركي الشوكي.
Protocol
1. خطوة واحدة
قبل الدواء مخدر: 10-15 دقيقة قبل تحريض التخدير، وضخ الأتروبين (0.20 ملغ / كلغ) وmethylprenidsolone (0.05 ملغ) الفرعية لمنع اللعاب cutaneously وذمة، على التوالي.
2. الخطوة الثانية
تحريض التخدير: ضخ الصوديوم بنتوباربيتال (70 ملغ / كغ) أو خليط من الكيتامين / زيلازين (100 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم على التوالي) داخل peritoneally. دعونا نذهب في الماوس حتى يمكن الحصول على أي منعكس قرصة أخمص قدميه. إذا كان التخدير يبدو خفيفة جدا، مع تكملة 1/4 من الجرعة.
3. الخطوة الثالثة
* ملاحظة: هذا هو إجراء جراحة المحطة الطرفية.
عندما تم التوصل إلى الطائرة من التخدير الجراحي، نقل الماوس على بطانية دافئة التي أثيرت في وضعية الرقود.
- تغطية خطم من الفأرة مع قناع تقديم O نقية 2 في تدفق حوالي 100 مل / دقيقة.
- حلاقة أيضا hindlimb الحق.
- الوجه الماوس لموقف ضعيف ولكن الحرص على ترك قناع الأكسجين في المكان.
4. الخطوة الرابعة
تأمين الماوس في مكان الغرز مع يحلق حول أطرافه وتأمين في أنحاء متفرقة من سطح العمل.
5. الخطوة الخامسة
إدراج التحقيق درجة حرارة لمراقبة درجة حرارة الماوس الأساسية. ضبط بطانية التدفئة / مصباح الطاقة للحفاظ على درجة الحرارة الأساسية بين C ° 36 و 38 ° C.
6. القصبة الهوائية والتنفس الصناعي
- باستخدام مقص حادة، وجعل قطع القصبة الهوائية وعلى شد الجلد بعيدا من كلا الجانبين.
- باستخدام ملقط حادة وتفتيت الغدة اللعابية وذلك لفضح 2 عضلات رقيقة (قصي لامي) الذي يغطي القصبة الهوائية.
- باستخدام ملقط حادة، فصل 2 MUSCليه على طول فصلهم الإنسي للكشف عن القصبة الهوائية.
- باستخدام ملقط دومون ج 7، 2 شريحة طول الخيط الحرير 4،0 تحت القصبة الهوائية.
- جعل خفض مستعرضة في القصبة الهوائية في الغضروفية بين حلقتين ولكن الحرص على عدم القسم تماما القصبة الهوائية.
- إدراج أنبوب القصبة الهوائية أسفل القصبة الهوائية، ومن ثم تأمين على جانبي افتتاح الإدراج عن طريق ربط الغرز أكثر من ذلك. يتم توصيل أنبوب القصبة الهوائية لجهاز التنفس الصناعي الماوس (SAR-830/AP، CWE شركة) وcapnograph ل(μcapstar، CWE شركة). يتم توصيل جهاز التنفس الصناعي، من خلال حقيبة الامتثال، إلى مصدر نقي O 2. ضبط المعلمات من التنفس الصناعي (100-150 نبضة في الدقيقة معدل التنفس، نهاية المد والجزر حجم 170-310 ميكرولتر) بحيث الماوس لا تحارب ضد التهوية الاصطناعية وPCO نهاية المد والجزر 2 هو مستقر بين 4 و 5٪.
7. وضع خطوط الوريد
- باستخدام تقنيات تشريح حادة، تعرض الوداجيالوريد على جانب واحد من العنق. على هذا المستوى، حبل الوريد انشقاقات داخل اثنان جذوع الرئيسية، عروق الوجه الأمامي والخلفي.
- نفذ الخطوات التالية مرتين، مجموعة واحدة لكل من هذه جذوع:
- باستخدام ملقط دومون 4 أو 5، بعناية فصل الوريد من الأنسجة المحيطة به حرف عطف.
- باستخدام ملقط دومون 7، 2 طول الشريحة من 6.0 خيوط الحرير تحت الوريد. تفصل بينهما قدر الإمكان على طول الوريد.
- وضع مقطع سفينة صغيرة على الجانب القريب من الوريد (الجانب الأقرب إلى القلب)، وربط قبالة الجانب البعيد من الوريد.
- باستخدام مقص القزحية ناعم جدا، وجعل شق صغير عرضية في الوريد، مع عناية كبيرة لا إلى قسم الوريد تماما.
- إدراج القسطرة معبأة سلفا 1Fr (premicath، Vygon) في الافتتاح، يصل إلى مقطع السفينة.
- عقد الوريد والقسطرة معا في ملقط دومون 4، إزالة بعناية مقطع السفينة، ثم دفع القسطرة لعدد قليل مورملليمتر ه في الوريد.
- تأمين القسطرة من خلال ربطه مع كل من الغرز على كلا الجانبين من الإدراج.
- يتم توصيل واحدة من القسطرة لحقنة أو مضخة لحقن حقنة جرعات تكميلية من التخدير كلما كان ذلك ضروريا (عادة كل دقيقة 10-30). الجرعة IV إما 6 ملغ / كغ من الصوديوم بنتوباربيتال أو 1250 +40 ميكروغرام / كغ / دقيقة من الكيتامين / زيلازين 12. يتم توصيل قسطرة أخرى لمضخة محقنة لبالتسريب الوريدي البطيء (50 ميكرولتر / ساعة) من حل الجلوكوز تحتوي على 4٪ NaHCO 3 (1٪) وplasmion (14٪).
8. إغلاق جلد الرقبة مع إبرة خياطة و، والعودة إلى ماوس ضعية الرقود
9. تشريح العضلات القائمة الخلفية والأعصاب
- باستخدام مقص، وإجراء شق من أعلى الفخذ إلى وتر أخيل. فصل الجلد من عضلات الكامنة، مع الحرص على عدم الاضرار الأوعية الدموية. كوى حسب الحاجة.
- تشريح بعناية ذات الرأسين الفخذية. كوى / ربطة حسب الحاجة لمنع النزيف. ويمكن لذات الرأسين الفخذية إزالة تماما أو ببساطة متكأ لفضح العصب الوركي وثلاثية الرؤوس عضلات ربلة.
- تشريح العصب الربلي من.
- باستخدام 8/0 خيط الحرير، ربط الجزء الأعلى من العصب الشظوية المشتركة والبعيدة لقطع عقدة. تشريح الأعصاب على طول الطريق حتى، أقرب إلى الورك ممكن.
- تحديد العصب قصبي في الأعصاب بين الشظوي المشترك والربلي. بين مختلف فروع العصب قصبي، وتحديد الفروع التعصيب في ربلة ثلاثية الرؤوس من الفروع التي تذهب أعمق (المشار إليه فيما العصب قصبي).
- باستخدام 8/0 الحريرالموضوع، ربط بين جميع فروع العصب قصبي مع الحفاظ على سلامة فروع في ربلة التعصيب ثلاثية الرؤوس. قطع العصب قصبي بشكل أقصى إلى عقدة العصب وتشريح تصل إلى أقصى حد ممكن.
- تغطية كاملة hindlimb مع الشاش مع مشروب المالحة لمنع أصاب مع مواصلة العمل على الخطوة التالية.
10. الثقب
- باستخدام مقص، وإجراء شق على طول العمود الفقري. فصل الجلد من عضلات الأساسية.
- جعل اثنين من الشقوق على كل جانب من فقرات لفصل العضلات تحت الجلد. ثم قطع كل وتر العضلات التي نعلق على جانب فقرات على كل جانب.
- باستخدام ملقط ومجرفة حادة غرامة، وإزالة ما تبقى من العضلات على الجانب الظهري من فقرات حول العمليات الشائكة أن تحدد بوضوح كل فقرة على حدة.
- تحديد فقرات T13 وL1. T13 هو أن يكون فقرة مشاركة الأضلاع المرفقة. والعمود الفقري ثسوء استخدام يجمد أن المشابك كننغهام النخاع الشوكي في العمود الفقري (Stoelting شركة). وضع المشابك الشوكي على كل جانب من T13 وL1. يجب الحرص على عدم ضغط الحبل الشوكي، ولكن وضع قليلا من التوتر في المحور الطولي. تأكد من أن يتم تأمين بشكل جيد العمود الفقري عن طريق الضغط برفق مع ملقط.
- قراضة باستخدام غرامة، وإزالة عمليات العمود الفقري ثم الصفائح أكثر من T13 وL1، مما يعرض الحبل الشوكي.
- تغطية الحبل الشوكي يتعرض مع قطع صغيرة من القطن أو مشروب مع spongel المالحة لمنع جفاف.
- وضع مخصص حمام البلاستيكية المصنوعة على اعلى ظهره، المحيطة الحبل الشوكي. تأمين حمام في مكانها باستخدام 4/0 خيط الحرير. تأكد من أن الحمام هو ماء بإغلاق مع كويك الصب تسرب (WPI).
- مرة واحدة في كويك الصب قد جفت، وإزالة القطن تغطي النخاع الشوكي، وملء حوض الاستحمام مع الزيوت المعدنية.
- باستخدام ملقط دومون 5 دقيقة جدا ومقص القزحية، وسحب بلطف على زميله الجافيةص المحيطة الحبل الشوكي، وفتحه قدر الإمكان في كل اتجاه. طي الجافية على كل جانب من الحبل الشوكي.
- خفض منصة مرتفعة على الماوس الذي هو الكذب وذلك للحفاظ على علقتها المشبك الفقري.
- استخدام المشبك آخر الفقري لكبح عملية الشائكة في المنطقة العجزية لدعم المنطقة الخلفية من الحيوان.
- استعرضوا يستخدم المشبك الثالث إلى شل hindlimb الحق والكاحل، بزاوية 90 درجة عند الركبة.
11. وتر العرقوب تشريح
- مع الطرف عازمة على 90 درجة في الركبة والكاحل في، إزالة الشاش تغطي منطقة hindlimb، وتشريح في وتر العرقوب خالية من الأنسجة المحيطة. تشريح قدر الإمكان ربلة ثلاثية الرؤوس في الأنسجة المحيطة من أيضا.
- قطع وتر العضلة الأخمصية بالقرب من عقبي، ثم قطع مرة أخرى لإزالة وتر تماما.
- باستخدام إبرة مترابطة، نعلق الموضوع 6/0 الحرير من خلال اله وتر العرقوب وجعل عقدة الثلاثي حول الوتر.
- وضع محول القوة على مقربة من عقدة، وقطع الجزء الأعلى من وتر، وإرفاقه محول باستخدام القوة خيط الحرير.
- إدراج اثنين من أطوال أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ تحت اللفافة للعضلات ربلة ثلاثية الرؤوس. وترتبط هذه الأسلاك إلى مكبر للصوت AC خارج الخلية لتسجيل EMG.
- وضع العصب الشظوي المشترك والعصب قصبي على ربط قطبين ثنائي القطب.
- وضع العصب ربلة ثلاثية الرؤوس على الكاثود من القطب هوك، مع القطب الموجب لمس العضلات القريبة.
- ربط جميع الأقطاب إلى وحدة تحفيز العزلة.
- وضع القطب الكهربائي الكرة على السطح الظهري للحبل الشوكي، متصل مكبر للصوت AC خارج الخلية لتسجيل إمكانات الحبل ظهر. تضع الإلكترود المرجعي جي / أجكل في اتصال مع العضلات مرة أخرى.
12. الخطوة الثانية عشر
تحفيز العصب ربلة ثلاثية الرؤوسباستخدام مربع بنسبة 50 نبضة μsec من شدة زيادة في التردد المنخفض (<1 هرتز) حتى أقصى سعة لوحظ نشل. التحرك ببطء وقوة محول لتمتد العضلات في حين رصد مدى الاستجابة نشل نشل السعة حتى تصل إلى الحد الأقصى.
13. تسجيلات من داخل الخلايا العصبونات الحركية
من هذه النقطة، وتستخدم تقنيات الكهربية القياسية لإعداد الكهربائي داخل الخلايا، اختراق الخلايا العصبيه في الحبل الشوكي وتحديد بأنها العصبون الحركي.
- سحب الزجاج لmicropipette تلميح ~ ميكرومتر 1 باستخدام مجتذب ماصة (P-97 Micropipette بولير، الآلات سوتر). ملء القطب مع حل 3M بوكل (مقاومة القطب 10-20 MΩ).
- باستخدام micropositioner، دفع micropipette، متصلة مكبر للصوت داخل الخلايا (Axoclamp 2B، الآلات اكسون) في الحبل الشوكي. رصد الإمكانيات الميدانية المحلية التي تسببها تحفيز همنظمة العمل ضد الجوع لتحديد موقع العصب المحرك تجمع للربلة ثلاثية الرؤوس.
- بعناية الاقتراب العصبونات الحركية المفترضة في حين رصد مقاومة مسرى مكروي. عند الضغط على غشاء، يزيد المقاومة. في وقت ما يمكن أن يسهل الاختراق باستخدام "الطنانة" وظيفة مكبر للصوت من داخل الخلايا.
14. القتل الرحيم الداخلي
في نهاية التجربة، والموت الرحيم للحيوان عن طريق جرعة زائدة من بنتوباربيتال (210 ملغ / كغ IV)، تليها قطع الرأس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يوضح كيفية تحديد العصبون الحركي من مجموعة ثلاثية الرؤوس الربلية بعد الاختراق. في كثافة منخفضة التحفيز، يمكن ملاحظة فقط الكامن الاستثاري بعد المشبكي أحادي المشبك (الشكل 1A). في أعلى كثافة، قد الكامن الاستثاري بعد المشبكي تكون كبيرة بما يكفي لتحريك "سوي المسار" سنبلة (1B الشكل). في كثافة أعلى من ذلك التحفيز، وهو كل شيء أو لا شيء معاكس للمسيرة الارتفاع يبدو، مع أقصر من الكمون الكامن الاستثاري بعد المشبكي أحادي المشبك (الشكل 1C). إذا تم حقن الحالي بما فيه الكفاية من خلال مسرى مكروي لاشعال ارتفاع، يمكن تسجيل نشاط العضلات EMG على بعد مهلة قصيرة، تليها شد العضلات (1D الشكل). بعد التعرف على العصبون الحركي، يمكن وصف خصائصه الكهربية. على سبيل المثال، الشكل 2 يوضح كيف يمكن قياس المقاومة باستخدام مدخلات hyperpolarizing وإزالة إستقطاب البقول الحالية (الشكل 2A)، والتآمر التغيرات المحتملة في غشاء مقابل كمية التيار حقن (الشكل 2B).
ويمكن أيضا خصائص مقلص من وحدة المحرك دراستها باستخدام بروتوكولات مختلفة من التحفيز. على سبيل المثال، يمكن الحصول على قوة العلاقة التردد عن طريق حقن نبضات قصيرة من الحالية على ترددات مختلفة في العصبون الحركي (الشكل 3A). ويمكن بعد ذلك قوة حالة مستقرة يمكن رسم مقابل وتيرة النبضات الحالية لتكشف عن وجود قوة السيني التردد منحنى (الشكل 3B).
إذا كان التخدير تحت السيطرة تماما، فمن الممكن أن يسجل من وحدة محرك واحد لأكثر من 15 دقيقة. في هذا الوقت مرور ينبغي أن يكون من الممكن لتشغيل مجموعة كبيرة من البروتوكولات لتحديد خصائص كل من العصبون الحركي وخصائص مقلص من الألياف العضلية ذلك يعصب.
/ 4312/4312fig1.jpg "/>
الشكل 1. مثال على الإجراء لتحديد العصبون الحركي. ألواح A. إلى الاستجابة الثلاثة المتعاقبة C من العصبون الحركي لتحفيز كهربائي متزايد من العصب الوركي الخط العمودي متقطع يدل على الوقت من التحفيز. كل لوحة هي غشاء المحتملة سجلت داخل خلوي (تتبع أعلى) وابل وارد سجلت على سطح الحبل القطني (أسفل التتبع). A. في شدة فقط فوق عتبة تجنيد afferents المجموعة الأولى (1.1 × T)، وهي يبدو الكامن الاستثاري بعد المشبكي ردا على التحفيز الكهربائي. وكان أحادي المشبك لأن الكامن الاستثاري بعد المشبكي الكمون المركزي، 0.4 ميللي ثانية (الخطوط المنقطة الصغيرة العمودي)، كانت قصيرة للغاية لمسار تنطوي على أكثر من المشبك. B. زيادة كثافة التحفيز (2.0 × T) زيادة حجم الكامن الاستثاري بعد المشبكي حتى كان كبيرة بما يكفي لعرض سوي المسار ارتفاع. C. عندما تمت زيادة كثافة التحفيز أكثر (2.1 X T)، تم تجنيد محور عصبي، وإمكانات العمل معاكس للمسيرة ظهر ميللي ثانية مع الكمون 1.2 مع الاحترام للوقت التحفيز. نظرا لطول التوصيل من 38mm، كان محور عصبي سرعة التوصيل 32 متر / ثانية. D. عندما يتم حقن الحالية (تتبع أسفل) في الثلاثية الرؤوس الربلية العصبون الحركي (العصبون الحركي مختلفة مما كانت عليه في AC)، يمكن أن يكون أثار إمكانات العمل في سوما ( 2 التتبع من أسفل). هذه الإمكانية العمل يسافر باستمرار محور عصبي، يعبر تقاطع العضلية العصبية، ويطلق إمكانات العمل والعضلات في الألياف العضلية معصب من قبل العصبون الحركي المسجلة. يمكن تسجيل إمكانات العمل المركب (التتبع الثاني من الأعلى) باستخدام أقطاب EMG. يظهر تقلص نشل ألياف العضلات للفي تتبع العليا. ويمكن تقدير الوقت الانكماش وحدة من المحركات استجابة نشل بين خطوط عمودية 2 متقطع. الرقم تكييفها في جزء من المرجع 5.
العمر = "دائما"> 
الشكل 2. تقدير المقاومة مدخلات من العصبون الحركي. A. استجابة المتوسط إلى سلسلة من النبضات الحالي (آثار أسفل) دائم ميللي ثانية 500 و تتراوح من -3 إلى +2 غ. لاحظ تبلد على الاستجابة الجهد من العصبون الحركي (السهم الكامل): وصلت بسرعة الجهد ذروته (نقطة سوداء) قبل ان تستقر على قيمة أقل الهضبة (أسود مربع). بعد تم إنهاء نبض الحالية، انتعاشا (السهم فارغة) تظهر. B. مؤامرة من انحراف من الجهد (ΔV) مقابل شدة النبض الحالي. وقد تم قياس النقاط في ذروة الاستجابة، في حين تم قياس المربعات في نهاية النبض، كما هو مبين من قبل رموز في أعلى الشكل B1. خطوط مستقيمة هي الأنسب للاستجابة خطية الذروة (متقطع) والرد الهضبة (اندفاعة منقط). سفوح هذه الخطوط هي المقاومة مدخلات الذروة والهضبةالمقاومة مدخلات من العصبون الحركي، على التوالي. الرقم المرجعي مقتبس من 5.
الشكل 3. . توصيف للعلاقة قوة التردد وحدة من السيارات وثلاث لوحات تظهر أعلى: على أثر القاع، والبقول الحالية المتكررة على التردد المشار إليه على رأس كل لوحة وتستخدم لانتزاع إمكانات العمل في العصبون الحركي؛ في الثاني تتبع من أسفل، فإن إمكانية غشاء العصبون الحركي، والتي تبين إمكانات العمل في وتيرة نبضات بل على التتبع الثاني من الأعلى، والنشاط EMG، بل على تتبع أعلى القوة التي تنتجها القطار من إمكانات العمل. لوحة أسفل يظهر الرسم البياني ملخص لقدر من القوة تم التوصل إليها خلال القطارات الفردية المرسومة ضد تردد إمكانات العمل في كل قطار. المنحنى السيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعداد الموصوفة هنا هي الأولى التي تسمح، في الماوس الكبار، وبين الخلايا في وقت واحد تسجيل من العصبون الحركي القطنية وقياس القوة التي تنتجها الألياف العضلية معصب من محور عصبي والخمسين.
بسبب صغر حجم الحيوان، يمكن للمهارات الجراحية اللازمة لإعداد هذا يكون تحديا للحصول على. ومع ذلك، مرة واحدة ويتقن هذه المهارات، ويمكن إجراء الجراحة كاملة في ثلاث ساعات، والحيوانات يمكن أن يعيش لمدة تصل إلى 7 ساعات أكثر بعد انتهاء العملية الجراحية لتسجيلات. نجاح هذه التقنية يتوقف أساسا على الإدارة على التخدير. فإنه من الأهمية الحاسمة أن ترصد بعناية كمعلمات الفسيولوجية عدد ممكن (درجة الحرارة الأساسية، PCO 2، معدل ضربات القلب، وما إلى ذلك) والمحافظة عليها هو مداها الفسيولوجية لكل منها. يجب معالجة أي انحراف فورا على سبيل المثال من خلال زيادة / تخفيض الطاقة إلى حتناول بطانية، وتعديل المعلمات من التنفس، أو إضافة المزيد من التخدير. فمن تجربتنا أن الحالة الفسيولوجية للفأرة يمكن أن تتخذ منحى سريع من المستغرب نحو الأسوأ إذا لم يتم إيلاء اهتمام وثيق في جميع الأوقات لهذه المعايير.
الاستقرار الميكانيكية هي ذات أهمية قصوى عند محاولة تحقيق التسجيلات داخل الخلايا. هذا ينطبق بشكل خاص في الجسم الحي، حيث يمكن ان تتحرك العصبونات الحركية تحت تأثير ضغط الدم، والتنفس، وانقباض العضلات. على الرغم من أنه من المستحيل أن الاستقرار الكفالة الكمال، يسمح الإجراء لدينا تسجيلات مستقرة من العصبونات الحركية لمدة عشر دقائق أو أكثر. ويتحقق ذلك عن طريق مزيج من أربعة مشابك شل حركة العمود الفقري وعظام الساق. وتقع اثنين المشابك في أقرب مكان ممكن من موقع الثقب لشل حركة الحبل الشوكي في هذا المجال. وجدنا أن الحد من طول الحبل الشوكي بين المشابك هما كذلك ممارسة قليلا منقدمت التوتر على العظام الاستقرار جيدة جدا، وكنا قادرين على الحفاظ على تسجيلات لعدة ساعات داخل الخلايا في الحيوانات بالشلل 5. ومع ذلك، في هذه الحالة، لا شلت الحيوان، وعضلات أحرار في العقد، وخصوصا عندما تحفيز العصب الوركي. هذا هو السبب في أننا استقرار الهيكل العظمي الساق بأكملها باستخدام اثنين من المشابك، واحدة على مستوى العجز، شل حركة الورك كله وبالتالي منع تقلصات العضلات من يتم إرسالها إلى العمود الفقري، واحد في الكاحل في شل المحطة في مدة 90 ° زاوية.
باستخدام هذه التقنية، فمن الممكن لتحديد نوع الفسيولوجية للالعصبون الحركي استنادا إلى بيان قوة من وحدة المحرك 13 منه. ويمكن تصنيف العصبونات الحركية وبطيئة أو بناء على نشل السريع على وقت الانكماش، ومقاومة في Fatigable أو التعب يعتمد على قدرتها على الحفاظ على قوة معينة خلال التحفيز المتكرر. على هذا النحو، ال Ø إعداد هذا قصر ميزة أكيدة على مدى الاستعدادات في المختبر. في المختبر في ظروف، يتم استخراج النخاع الشوكي من جسم الحيوان، ووضعها في صحن إما كليا أو شرائح. لأن طبقة المايلين المحيطة المادة الرمادية، لا يمكن إلا الأوكسجين السليم يمكن الحصول عليها في الحيوانات الوليد حيث تكون الميالين ليست كاملة 14. التطورات التقنية الأخيرة قد سمحت تسجيلات العصبونات الحركية في العمود الفقري في شرائح الكبار 15-17، ومع ذلك، فإن هذا النهج لا تخفيف من العيب الرئيسي في التسجيلات المختبر، وهو أنه لا يوجد طريقة لتحديد نوع الفسيولوجية للالعصبون الحركي سجلت (S، FR، أو FF، أو حتى جاما ألفا مقابل)، وفرض experimentalist لتجميع التسجيلات من العصبونات الحركية التي تختلف في جوهرها، من حيث الوظيفة، والخصائص الكهربية، ومحتوى البروتين (انظر مانويل وZytnicki، 2011 18 لإعادة النظر من أنواع مختلفة من العصبونات الحركية).
= "jove_content"> وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن الإمكانيات التي تتيحها هذه التقنية كثيرة. في الواقع، يمكن أن يؤديها في هذه التسجيلات الحية في الحيوانات المعدلة وراثيا لدراسة تأثير مباشر من هذا التعديل المحدد على وظيفة الجهاز الحركي: إنتاج القوة. هذا التحضير هو أيضا واعدة جدا لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان مثل الاعصاب التصلب الضموري العضلي الجانبي (ALS) أو ضمور العضلات الشوكي (SMA). وقد تم بالفعل إنشاء النماذج الوراثية التي تحاكي أعراض السمة المميزة لهذه الأمراض 10،11. إعداد جديدة وصفها هنا يفتح إمكانية دراسة دور تقاطعات العصبية والعضلية في هذه الأمراض عن طريق اختبار سلوك العصبونات الحركية والعضلات والألياف (سواء بشكل مستقل ومعا) خلال تطور المرض. مؤخرا، كانت مجموعتين مستقلة قادرة على وضع decerebrated في إعداد الماوس الجسم الحي أن تنقل معرض عفوية أو الوهميةتنقل 19،20. إذا كان نوع من الاستقرار التي نلاحظها تسجيل باستخدام الإجراء المذكورة هنا يمكن أن يتحقق بعد فصل المخ، فإن هذا يشكل أداة هائلة للدراسة ليس فقط من العصبونات الحركية، ولكن من جميع الدوائر قبل محرك العمود الفقري المشاركة في توليد الإيقاع الحركي .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقدم هذا العمل بفضل دعم مالي من مؤسسة بحوث بور MEDICALE لا (FRM)، وزمالة ما بعد الدكتوراه Safenowitz ميلتون للبحث ALS (ALS جمعية)، NIH منح NINDS NS05462 وNS034382، وANR HyperMND المنحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine sulfate | Aguettant | ||
| Methylprenidsolone | Pfizer | Solu-Medrol | |
| Sodium pentobarbitone | Sanofi-Aventis | Pentobarbital | |
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Glucose | |||
| Plasma expander | Roger Bellon | Plasmagel | |
| Blunt scissors | FST | 14079-10 | |
| Blunt fine scissors | FST | 15025-10 | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15002-08 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-32 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-31 | |
| Cunningham Spinal Adaptor | Stoelting Co. | ||
| Kwik-Cast sealant | WPI | #KWIK-CAST | |
| Ventilator | CWE Inc | SAR-830/AP | |
| Capnograph | CWE Inc | μcapstar | |
| Heating blanket | Harvard Apparatus | 507221F | |
| Intracellular amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 2B | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G |
References
- Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. Recruitment and some other factors of reflex inhibition. Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).
- Huizar, P., Kuno, M., Miyata, Y. Electrophysiological properties of spinal motoneurones of normal and dystrophic mice. The Journal of physiology. 248, 231-246 (1975).
- Alstermark, B., Ogawa, J. In vivo recordings of bulbospinal excitation in adult mouse forelimb motoneurons. Journal of neurophysiology. 92, 1958-1962 (2004).
- Meehan, C. F., Sukiasyan, N., Zhang, M., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Intrinsic properties of mouse lumbar motoneurons revealed by intracellular recording in vivo. Journal of neurophysiology. 103, 2599-2610 (2010).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J. Neurosci. 29, 11246-11256 (2009).
- Iglesias, C., et al. Mixed mode oscillations in mouse spinal motoneurons arise from a low excitability state. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5829-5840 (2011).
- Crone, S. A., Zhong, G., Harris-Warrick, R., Sharma, K. In mice lacking V2a interneurons, gait depends on speed of locomotion. J. Neurosci. 29, 7098-7109 (2009).
- Talpalar, A. E., et al. Identification of minimal neuronal networks involved in flexor-extensor alternation in the mammalian spinal cord. Neuron. 71, 1071-1084 (2011).
- Rabe, N., Gezelius, H., Vallstedt, A., Memic, F., Kullander, K. Netrin-1-dependent spinal interneuron subtypes are required for the formation of left-right alternating locomotor circuitry. J. Neurosci. 29, 15642-15649 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Simpson, D. P. Prolonged (12 hours) intravenous anesthesia in the rat. Laboratory animal science. 47, 519-523 (1997).
- Burke, R. E. Motor Unit Types - Functional Specializations in Motor Control. Trends Neurosci. 3, 255-258 (1980).
- Kerkut, G. A., Bagust, J. The isolated mammalian spinal cord. Prog. Neurobiol. 46, 1-48 (1995).
- Carp, J. S., et al. An in vitro protocol for recording from spinal motoneurons of adult rats. Journal of Neurophysiology. 100, 474-481 (2008).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An In Vitro Spinal Cord Slice Preparation for Recording from Lumbar Motoneurons of the Adult Mouse. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).
- Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion. Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).
- Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo. The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).
Tags
علم الأعصاب، العدد 70، علم وظائف الأعضاء، الفيزياء الحيوية، علم التشريح، والطب، نظام موتور، الحبل الشوكي، تسجيلات داخل الخلايا، العصبونات الحركية، EMG، القوة، قطني، الخلايا العصبية والمخ، والماوس، نموذج حيوانيErratum
Formal Correction: Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo
Posted by JoVE Editors on 01/04/2013.
Citeable Link.
A correction was made to Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo. There was an error in the name of one author, Marin Manuel. The author's name has been corrected to:
Marin Manuel
instead of:
Manuel Marin
