ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Bu yeni yöntem, tek bir yetişkin fare motonöron ve kas lifleri tarafından üretilen kuvvet ölçümü aynı anda hücre içi kaydını verir. Normal ve genetik olarak değiştirilmiş hayvanların motor birimlerin elektrik ve mekanik özelliklerinin kombine soruşturma nöromüsküler sistemin çalışması için bir atılımdır.
Abstract
Bu (1) kolaylıkla tespit hedeflerin (kas lifleri) sahip olan ve bu nedenle bir çok iyi bilinen bir fonksiyonu olan eşsiz özelliklerini ile merkezi sinir sisteminin bir nöron, çünkü belkemiği motor nöron uzun sinir fonksiyonu çalışmak için iyi bir model sistem olmuştur (kas kasılması kontrol etmek için), (2) pek çok spinal ve azalan ağların yakınsak hedef ", nihai ortak bir yoldan" dolayısıyla adı olan, ve (3) bu mümkün keskin hücre içi elektrotlar ile nüfuz yapan büyük bir soma sahip olan . Dahası, in vivo çalışma zaman, aynı anda motor nöronlar ve kas hedefler geliştirilmiştir güç elektrik faaliyeti kaydetmek mümkündür. In vivo olarak motonöronlar hücre içi kayıt yapılması bu nedenle aynı zamanda, çalışma için mümkün olan benzersiz bir konumda deneye koymak, "motor ünitesi" (motonöron, kendi akson ismi verilen bütün bölümlerinde veo 1 innerve kas lifleri): motonöron bası girişleri, motor nöron ve elektrofizyolojik özellikleri ve motonöronlar fizyolojik fonksiyonu bu özelliklerin etkisi, onun motor ünitesi tarafından üretilen kuvvet yani. Hazırlık felç olamaz ve böylece hücre içi kayıt için mekanik stabilite azalır Ancak, bu yaklaşım çok zordur. Bu nedenle, bu tür deneyler sadece kedilerde ve sıçanlarda elde edilmiştir. Normal ve genetiği değiştirilmiş farelerde benzer deneyler yapmak mümkün olsaydı Ancak, spinal motor sistemlerinin çalışma müthiş bir sıçrama yapabilir.
Teknik nedenlerden dolayı, farelerde spinal şebekelerin çalışma çoğunlukla motonöronlar ve spinal ağlar olgunlaşmamış vitro hazırlıkları, neonatal sınırlı olmuştur, motonöronlar hedefleri ayrılmış ve dilimleri, mo okudu zaman vardırtoneurons girişleri çoğu ayrılmıştır. Yakın zamana kadar, sadece birkaç grup bize erişkin farelerde in vivo 5,6 motonöronlar çok kararlı kayıtları elde etmek için izin veren yeni bir hazırlık yayınlanan ekibimize dahil, in vivo 2-4 motonöronlar intrasellüler kayıtları gerçekleştirmek için başarmıştı. Bununla birlikte, bu kayıtların örn. bu motonöronlar kuvveti çıkış kayıt için ihtimali olmadan, felç hayvanlarda elde edilmiştir. Burada biz motonöronlar ve elektrofizyolojik özellikleri ve bunların motor ünitesi tarafından geliştirilen kuvvet eş zamanlı kayıtları elde etmek mümkün edildiği bu orijinal hazırlığı bir uzantısı sunmak. Bize kuvvet profiline göre motonöronlar farklı türleri belirlemek ve böylece onların işlevini açığa olanak sağladığından, önemli bir başarıdır. Genetik modeller spinal segmental devresi 7-9 rahatsız, veya insan disea reproducting ile birleştiğindese 10,11, bu tekniğin spinal motor sisteminin çalışması için gerekli bir araç olmasını bekliyoruz.
Protocol
1. Adım
Pre-anestezik ilaçlar: anestezi indüksiyonundan önce 10-15 dk sırasıyla salivasyon ve ödem, önlemek için atropin (0.20 mg / kg) ve methylprenidsolone (0.05 mg) alt-kutanöz enjekte.
2. Adım İki
Anestezinin indüksiyonu: sodyum pentobarbital (70 mg / kg) ya da ketamin / ksilazin (10 mg / kg, sırasıyla 100 mg / kg ile) intra-peritoneal oluşan bir karışım enjekte edilir. Fare hiçbir ayak tutam refleksi elde edilebilir kadar küçük gidelim. Anestezi çok açık görünüyorsa, dozun 1/4 ile takviyesi.
3. Üçüncü Adım
* Not: Bu ameliyatı bir terminal işlemdir.
Anestezi cerrahi bir düzlem ulaşıldığında, bir yüzükoyun pozisyonda yükseltilmiş sıcak bir battaniye üzerinde fare aktarın.
- 100 ml / dakikalık bir akış saf O 2 sunan bir maske ile fare burun örtün.
- Ayrıca sağ bacak Tıraş.
- Sırtüstü pozisyonda fare çevirin ama yerde oksijen maskesi bırakmak ilgileneceğim.
4. Dördüncü Adım
Bacaklarda çevresinde dolanmıştı ve çalışma yüzeyinin dört köşesine bağlanmış sütürler ile yerde fare sabitleyin.
5. Adım Beş
Fare çekirdek sıcaklığı izlemek için bir sıcaklık probu yerleştirin. 36 ° C ve 38 ° C arasında çekirdek sıcaklığı korumak için ısıtma battaniye / lamba gücünü ayarlayın
6. Trakeotomi ve Yapay Havalandırma
- Künt makas kullanarak, trakea üzerinde bir kesim yapmak ve her iki tarafta uzakta deri çekin.
- Künt forseps kullanarak, trakea kapsayan iki ince kasları (sternohyoid) açığa gibi tükürük bezi böylece parçalıyorlar.
- Künt forseps kullanarak, iki musc ayırmaktrakea ortaya çıkarmak için onların medial ayrılması boyunca les.
- Bir Dumont 7 forseps kullanarak, trakea altında 4.0 ipek sütür iki uzunluğu kaydırın.
- Iki kıkırdak halkaları arasında trakea bir çapraz kesim olun ama bölüm trakea tamamen özen.
- Trakea aşağı trakeal tüp takın, sonra üzerine sütür bağlayarak yerleştirme boşluğunun her iki taraftan sabitleyin. Endotrakeal tüp, bir fare vantilatör (SAR-830/AP, CWE Inc) ve bir capnograph (μcapstar, CWE Inc) ile bağlanır. Ventilatör saf O 2 bir kaynak, bir uyum çantası aracılığıyla bağlanır. Farenin yapay havalandırma mücadele değildir ve end-tidal pCO 2 4 ile% 5 arasında istikrarlı şekilde ventilatör (solunum hızı 100-150 bpm, end-tidal hacmi 170-310 ul) parametrelerini ayarlayın.
7. İntravenöz Hatlarının Yerleşimi
- Künt diseksiyon teknikleri kullanarak, juguler maruzBoyun bir tarafında damar. Bu seviyede, juguler ven iki büyük sandıklar, anterior ve posterior yüz damarlar böler.
- Iki kez, bir bu sandıklar her biri için belirlenen aşağıdaki adımları uygulayın:
- Dumont 4 veya 5 forseps kullanarak, çevresindeki katılgandoku gelen ven dikkatle ayırın.
- Dumont 7 forseps kullanarak, ven altında 6,0 ipek dikişlerle iki uzunluğu kaydırın. venin uzunluğu boyunca mümkün olduğunca onları ayırmak.
- Ven (kalbe yakın taraf) proksimal tarafında küçük damar klipsi yerleştirin ve ven distal tarafına bağla.
- Çok ince iris makası kullanarak, tamamen bölümüne ven büyük özen değil alarak, damar küçük bir transvers kesi yapmak.
- Kadar gemi klibe, açılış önceden doldurulmuş 1FR kateter (premicath, VYGON) takın.
- Bir Dumont 4 forseps birlikte ven ve kateter şekilde tutarak, damar klibi kaldırmak, daha sonra kateter birkaç mor itinvene e milimetre.
- Ekleme bölgesinin her iki tarafında hem dikiş ile bağlayarak kateter elde edin.
- Kateterlerin biri anestezikler gerektiğinde (genellikle her 10-30 dk.) Ek doz enjekte etmek için şırınga veya bir şırınga pompası bağlandığında IV doz ya 6 mg / sodyum pentobarbital veya 1250 +40 mg / kg / ketamin / xylazine 12 dk kg. Diğer kateter NaHCO3 (% 1) ve plasmion (% 14) ihtiva eden bir% 4 glikoz çözeltisi yavaş yavaş damardan infüzyon (50 ul / saat) bir şırınga pompasına bağlanır.
8. İğne ve Sütür ile Boyun Cilt kapatın ve Yüzüstü Pozisyon Fare dön
9. Hind-bacak kas ve Sinirler diseksiyonu
- Makas kullanarak, Aşil tendonu için uyluğun üst bir kesi yapmak. Kan damarlarının zarar vermemeye dikkat ederek, altta yatan kasları gelen cilt ayırın. Gerektiği gibi Dağlamak.
- Dikkatle Biceps Femoris teşrih. Kanamayı önlemek için gerektiği gibi / ligatür Dağlamak. Biceps Femoris tamamen kaldırılmış ya da sadece siyatik sinir ve triseps kaslarından hazırlanan doku açığa recline olabilir.
- Sural sinir üzerinden teşrih.
- 8/0 ipek iplik kullanarak, Ortak peroneal sinirin distalinde bağlayıp düğüm distalinde kesti. Mümkün olduğunca kalça olduğunca yakın, sinir tüm yol kadar teşrih.
- Ortak peroneal ve sural sinirler arasındaki Tibial sinir tanımlayın. Tibial sinir farklı dalları arasında (bundan Tibial sinir olarak anılacaktır) derin gitmek dallarından Triseps surae innerve dalları tanımlamak.
- 8/0 ipek kullanmadalları Triseps surae innerve korurken iplik, Tibial sinir bütün dalları birbirine bağla. Düğüm için distale Tibial sinir kesin ve mümkün olduğu kadar sinir kadar teşrih.
- Bir sonraki adıma geçmeden ise kurutma önlemek için tuzlu batırılmış bir gazlı bez ile tüm bacak örtün.
10. Laminektomi
- Makas kullanarak, omurga boyunca bir kesi yapmak. Altta yatan kasları gelen cilt ayırın.
- Subkutan kasları ayırmak için vertebra her iki tarafında iki insizyon yapın. Sonra her iki tarafta omurga tarafında takın Her bir kas tendon kesti.
- Künt forseps ve ince bir küret kullanarak, açıkça her omur tanımlamak için spinöz süreçleri etrafında omurunun arka tarafındaki kas kalanını çıkarın.
- Vertebra T13 ve L1 tanımlayın. T13 kaburga ekli olması son vertebra olduğunu. Vertebral kolon wkötü Cunningham Omurilik vertebral kelepçeleri (Co Stoelting) kullanılarak immobilize edilebilir. T13 ve L1 her tarafında spinal kelepçeler yerleştirin. Omurilik sıkıştırmak için değil dikkatli olun, ama boylamasına eksenine gerginlik biraz koydu. Omurga de forseps ile hafifçe bastırarak güvenli olup olmadığını kontrol edin.
- Ince rongeurs kullanarak, böylelikle omurilik açığa T13 ve L1 sonra üzerinde lamina spinal süreçleri kaldırmak.
- Kuruma önlemek için tuzlu batırılmış pamuk veya spongel küçük bit ile maruz omurilik örtün.
- Omuriliği saran sırt üstünde bir ölçüye plastik banyo, yerleştirin. 4/0 ipek iplik kullanılarak yerinde banyo sabitleyin. Banyo Kwik-Cast mastik (TEFE) ile mühürleme suretiyle su geçirmez olduğundan emin olun.
- Kwik-Cast kuruduktan sonra, omurilik kapsayan pamuk çıkarın ve mineral yağı ile banyo doldurmak.
- Dumont 5 forseps ve çok ince iris makası kullanarak, yavaşça dura arkadaşı çekinr omuriliği saran, ve her iki yönde de, mümkün olduğu kadar açın. Omuriliğin her iki tarafında dura katlayın.
- Bu vertebral kelepçe tarafından askıya tutmak gibi fare yüzden yalan olduğu ortaya platformu alçaltın.
- Hayvanın geri bölge desteklemek için sakral bölgenin bir spinöz sıkıştırmak için başka bir vertebral kelepçe kullanır.
- Üçüncü bir kelepçe sağ bacak ve ayak bileğinizi immobilize etmek için kullanılır, diz 90 ° fleksiyonda.
11. Aşil Tendon Diseksiyon
- Ekstremite diz ve ayak bileği 90 ° bükülmüş olan bacak alanı kapsayan gazlı bez çıkarın ve çevre dokulara serbest Aşil tendonu teşrih. Olduğu kadar aynı zamanda bunları çevreleyen dokudan mümkün Triseps surae olarak teşrih.
- Kalkaneus yakın Plantaris kas tendon kesin, ardından tamamen tendon kaldırmak için tekrar kesti.
- Bir dişli iğne kullanarak, inci ile 6/0 ipek iplik takmake Aşil tendon ve tendon etrafında bir üçlü düğüm yapmak.
- Düğüm yakın kuvvet dönüştürücü yerleştirin, tendon distal bölümünü kesmek ve ipek iplik kullanarak kuvvet dönüştürücü takın.
- Triseps surae kas fasya altında paslanmaz çelik tel iki uzunlukları yerleştirin. Bu teller EMG kayıt için bir hücre dışı AC yükselticiye bağlanmıştır.
- Iki bipolar kanca elektrotlar üzerinde Common peroneal sinir ve Tibial sinir yerleştirin.
- Anot yakındaki bir kas dokunmadan, bir kanca elektrot katot üzerinde Triseps surae sinir yerleştirin.
- Bir izolasyon ünitesi tüm uyarıcı elektrotlar bağlayın.
- Kord sırtında potansiyelleri kaydetmek için bir ekstraselüler AC amplifikatöre bağlı omuriliğin dorsal yüzeyi üzerinde bir top elektrot yerleştirin. Bir arka kas ile temas halinde bir Ag / AgCİ referans elektrotuna yerleştirin.
12. Adım Oniki
Triseps surae sinir teşvikMaksimum seğirme genlik görülünceye kadar düşük frekans (<1 Hz) artan bir yoğunluk 50 μsec kare darbe kullanarak. Yavaş yavaş kasılan genlik ulaşana kadar seğirme yanıtı genliği izlerken kas germek için kuvvet dönüştürücü hareket ettirin.
13. Motonöronlar intrasellüler Kayıtlar
Bu noktadan itibaren, standart elektrofizyolojik teknikler, hücre içi bir elektrot hazırlamak omurilikteki bir nöron nüfuz ve motonöron olarak tanımlamak için kullanılır.
- Bir pipet çektirmesi (P-97 Mikropipet Çektirme, Sutter Instruments) kullanılarak bir ~ 1 mikron ucu bir cam mikropipet çekin. KCl bir 3M çözeltisi (elektrot MΩ 10-20 direnci) ile elektrot doldurun.
- Bir micropositioner kullanarak, omurilik içine bir hücre içi amplifikatör (Axoclamp 2B, Axon Instruments) bağlı mikropipet, sürücü. E uyarılması tarafından ortaya çıkarılan yerel alan potansiyelleri Monitörach sinir Triseps surae ve motor havuzu bulmak için.
- Mikroelektrot direncini izlerken varsayılan motonöronlar dikkatle yaklaşmak. Bir zar karşı iterken, direnci artırır. Penetrasyon bazen hücre içi amplifikatör "buzz" fonksiyonu kullanılarak kolaylaştırılabilir.
14. Ötenazi Prosedürü
Deneyin sonunda, hayvanlar pentobarbital bir doz dekapitasyon ardından (210 mg / kg IV) ile ötenazi edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, nüfuz sonrası Triseps surae grubundan bir motonöron tanımlamak için gösterilmiştir. Düşük uyarım şiddeti anda, sadece monosinaptik EPSP (Şekil 1A) görülebilir. Yüksek yoğunlukta, EPSP bir "ortodromik" başak (Şekil 1B) tetiklemek için yeterli büyüklükte olabilir. Daha yüksek uyarım şiddeti anda, bir all-or-none antidromik başak monosinaptik EPSP (Şekil 1C) daha kısa bir gecikme ile görüntülenir. Yeterli hava akımı bir başak tetiklemek için mikroelektrot yoluyla enjekte edilirse, bir EMG aktivitesi kas seğirme (Şekil 1D) ardından, kısa bir gecikmeden sonra kas üzerine kaydedilebilir. Motonöron tanımlanmasından sonra, onun elektrofizyolojik özelliklerini karakterize edilebilir. Örneğin, Şekil 2, giriş direnci hiperpolarize ve akım darbeleri (Şekil 2A) depolarize, ve grafik kullanılarak ölçülebilir nasıl çalıştığını göstermek (Şekil 2B) enjekte edilen akım miktarı vs membran potansiyelinin varyasyonları.
Motor ünitesinin kasılma özellikleri de stimülasyon çeşitli protokoller kullanılarak incelenebilir. Örneğin, kuvvet-frekans ilişkileri motonöron (Şekil 3A), çeşitli frekanslarda kısa akım darbeleri enjekte edilmesiyle elde edilebilir. Kararlı durum güç daha sonra bir sigmoidal kuvvet-frekans eğrisi (Şekil 3B) ortaya akım darbeleri sıklığı karşı çizilebilir.
Anestezi da kontrol altına ise, en fazla 15 dakika süreyle, tek bir motor ünitesinden kaydetmek mümkündür. Bu zaman atlamalı yılında motonöron ve innerve kas lifleri kontraktil özelliklerini hem karakterize protokolleri büyük bir dizi çalıştırmak mümkün olmalıdır.
/ 4312/4312fig1.jpg "/>
Şekil 1. Bir motonöron tanımlamak için prosedür örneği. Paneller A siyatik sinir artan elektrik stimülasyonu için motonöron C izleyen üç yanıt. Dikey kesikli çizgi uyarım süresi gösterir. Her panel hücre içinde kaydedilen membran potansiyeli (üst trace) ve lomber kord (alt iz) yüzeyinde kaydedilen afferent voleybolu olduğunu. A. sadece eşiğin üstünde bir yoğunluk ise hiç afferentlerin alımı için (1.1 x T), bir EPSP elektrik uyarılmasına tepki olarak ortaya çıktı. Bu yaşıma kadar merkezi gecikme, 0.4 msn (küçük dikey noktalı çizgiler), birden fazla sinaps içeren bir yol için çok kısa olduğu için EPSP monosinaptik oldu. B. uyarım şiddeti (2.0 x T) Artan EPSP boyutu arttı Bir ortodromik başak. C. tetiklemek için yeterince büyük uyarım şiddeti daha da artmış zaman(2.1 x T), akson almış ve bir antidromik aksiyon potansiyeli süresi uyarım ile ilgili olarak bir 1.2 msan gecikme ile ortaya çıkmıştır. 38mm bir iletim uzunluğu göz önüne alındığında, aksonal iletim hızı 32 m / s idi. D. zaman geçerli (surae motonöron (AC farklı motor nöron), bir aksiyon potansiyeli soma anlaşılabilir bir Triceps içine (alt iz) enjekte edilir alttan ikinci iz). Bu aksiyon potansiyeli, akson aşağı gitti nöro-kas kavşağı geçer ve kaydedilen motonöron tarafından innerve kas liflerinde kas aksiyon potansiyelleri tetikler. Bileşik aksiyon potansiyeli (üstten ikinci izleme) EMG elektrotlar kullanılarak kaydedilebilir. Kas liflerinin seğirme daralma üst iz gösterilir. Motor ünitesinin kontraksiyon zamanı iki dikey kesikli çizgi arasındaki seğirme yanıtı tahmin edilebilir. Şekil ref 5 kısmen uyarlanmıştır.
Şekil 2. Bir motonöron girişi direnci tahmini. Bir akım darbeleri dizi (alt izleri) süren 500 msn ve -3 +2 nA değişen A. Ortalama yanıtı. Motonöron (dolu ok) gerilim yanıt sarkma edin: gerilim hızla düşük plato değeri (siyah kare) ile stabilize öncesi (siyah nokta) doruğa ulaştı. Geçerli nabız sonlandırıldı sonra, bir rebound (boş ok) görünür. Gerilim sapma (ΔV) vs akım pulsu yoğunluğu B. Plot. Şekil B1 üstüne sembollerle tasvir gibi meydanlar, darbe sonunda ölçülen edilmiş iken Dots, yanıtı zirvesinde ölçülmüştür. Düz çizgiler pik yanıtı (kesikli) ve plato cevabını (çizgili-noktalı) en iyi lineer uyuyor vardır. Bu satırların yamaçlarında pik giriş direnci ve plato i vardırsırasıyla motonöron arasında nput direnç. Ref 5 uyarlanmıştır Şekil.
Şekil 3,. . Bir motor birim kuvvet-frekans ilişkisi karakterizasyonu ilk üç panel gösterir: alt iz üzerinde, frekansta tekrar akım darbeleri her panelin üstünde gösterilir ve motonöron eylem potansiyelleri ortaya çıkarmak için kullanılır; saniye bakliyat frekansta aksiyon potansiyelleri gösteren alt motonöron bir zar potansiyeli, ikinci iz, üst, EMG aktivitesi ikinci iz üzerinde, üst iz aksiyon potansiyelinin tren tarafından üretilen kuvvet üzerinde. Alttaki panel bireysel trenler sırasında ulaşılan kuvvet miktarının özet grafik her bir tren aksiyon potansiyel frekans karşı grafiği gösterilmektedir. Eğrisi Sigmoidal olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan hazırlık erişkin fare, bir bel motonöron ve akson innerve kas lifleri tarafından üretilen kuvvet ölçümü aynı anda hücre içi kayıt de izin verir, ki ilk.
Çünkü hayvanın küçük boyutu, bu hazırlık için gerekli cerrahi becerileri kazanmaları zor olabilir. Bu becerileri hakim bir kez Bununla birlikte, tüm ameliyat üç saat içinde yapılabilir, ve hayvanlar kayıtlar için cerrahi prosedürün sona ermesinden sonra 7 saat daha e kadar hayatta kalabilir. Bu tekniğin başarısı anestezi yönetimi esasen şarta. Dikkatle mümkün olduğunca çok sayıda fizyolojik parametreleri (çekirdek sıcaklığı, pCO 2, kalp hızı, vb) izlemek ve bunları kendi fizyolojik aralığı korumak için kritik öneme sahiptir. Herhangi bir sapma h gücünü arttırarak / azaltarak örneğin derhal giderilmelidir, battaniye yeme solunum parametrelerini ayarlayarak, ya da daha fazla anestezik ekleyerek. Bu yakın ilgi bu parametrelerin her zaman ödenir değilse fare fizyolojik durumu kötü bir şaşırtıcı derecede hızlı dönüş alabilir bizim deneyim.
Intrasellüler kayıtları elde etmek için çalışırken Mekanik stabilite büyük önem taşımaktadır. Bu motonöronlar kan basıncı, solunum ve kas kasılmaları etkisiyle taşıyabilirsiniz vivo, özellikle doğrudur. Bu teminat mükemmel kararlılık imkansız olsa da, bizim prosedürü on dakika veya daha uzun süre motonöronlar istikrarlı kayıtları verir. Bu omurga ve bacak kemiklerinin hareketsizleştirici dört kelepçeler bir kombinasyonu ile elde edilir. İki kelepçeler o bölgede omuriliğin hareketsiz laminektomi sitesinden mümkün olduğunca yakın bulunmaktadır. Bu iki kıskaç arasına omurilik uzunluğu azaltılarak hem de bir parça uygulayan bulunduBiz felçli hayvanların 5 birkaç saat intraselüler kayıtları korumak için mümkün olduğu gibi kemikler üzerinde gerginlik, çok iyi bir istikrar sağlanmıştır. Ancak, mevcut davada, hayvan felç değildir ve siyatik sinirinin uyarılması, özellikle kas, sözleşme ücretsizdir. Bu biz 90 de bacak hareketsiz, iki kelepçeler, sakrum düzeyinde birini kullanarak tüm bacak iskeleti stabilize tüm kalça hareketsizleştirir ve dolayısıyla Vertebral kolon iletilmesini kas kasılmaları önlemek ve ayak bileği az bir nedeni de budur ° açı.
Bu tekniği kullanarak, kendi motor ünitesi 13 kuvvet profiline göre bir motor nöron fizyolojik türünü tanımlamak mümkündür. Motonöronlar Yavaş veya Hızlı bunların seğirme kasılma zamanı esas ve tekrarlayan uyarılma sırasında verilen bir kuvvet sürdürebilme yeteneğine dayalı Fatigable veya Yorulma Dirençli olarak sınıflandırılabilir. Gibi, bu hazırlık yazarlara olarakin vitro hazırlıkları üzerinde des kesin bir avantaj. In vitro koşullarında olarak, omurilik hayvanın vücut elde edilir ve tamamen veya yaprak ya da bir tabağına yerleştirilir. Miyelinasyon 14 tamamen yok olmasından dolayı gri madde çevreleyen miyelin tabakası, uygun bir oksijen sadece yenidoğan hayvanlarda elde edilebilir. Yeni teknik gelişmeler erişkin dilimleri 15-17 spinal motonöronlar kayıtları izin, ancak bu yaklaşım kaydedilen motonöron fizyolojik türünü tanımlamak için hiçbir şekilde (S, olmasıdır vitro kayıtları arasında büyük dezavantajı, çözmüyorsa FR veya FF, ya da hatta alfa vs gama), ve (bir inceleme için Manuel ve Zytnicki, 2011 18'e bakınız fonksiyon bakımından, elektrofizyolojik özellikleri ve protein içeriği de, özünde farklı motonöronlar dan deneye birlikte havuz kaydı için kuvvet motonöronlar farklı tipleri).
in vivo kayıtları bu motor sistemin fonksiyonunu bu belirli alterasyon doğrudan etkisi incelemek için genetik olarak değiştirilmiş hayvanların yapılabilmiş. Bu hazırlık da Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ya da Spinal Müsküler Atrofi (SMA) gibi nörodejeneratif insan hastalıklarının çalışma için oldukça umut verici. Genetik modeller gerçekten bu hastalıkların 10,11 damgasını belirtiler çoğaltmak olduğunu üretilmedi. Burada açıklanan yeni hazırlık motonöronlar ve hastalığın ilerlemesi esnasında kasların lifleri (hem bağımsız ve birlikte) davranışını test ederek bu hastalıkların nöromüsküler kavşak rolü okuyan imkanı yaratır. Son zamanlarda, bağımsız iki grup kendiliğinden bir hareket sergiliyor in vivo fare hazırlık decerebrated veya kurgusal geliştirmek başardıklokomosyon 19,20. Bu prosedürü kullanarak gözlemlemek kayıt sabitliği tür decerebration sonra elde edilebilir Burada açıklanan, bu motonöronlar değil, sadece çalışma için zorlu bir araç oluşturmaktadır, ancak lokomotor ritim üreten yer alan bütün ön-motor spinal devrelerin olacaktır .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Fondation pour la Recherche MEDICALE (FRM), ALS Araştırma (ALS Derneği), NIH NINDS Hibeler NS05462 ve NS034382 ve ANR Grant HyperMND için Milton Safenowitz Doktora Sonrası Bursu mali destek sayesinde mümkün oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine sulfate | Aguettant | ||
| Methylprenidsolone | Pfizer | Solu-Medrol | |
| Sodium pentobarbitone | Sanofi-Aventis | Pentobarbital | |
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Glucose | |||
| Plasma expander | Roger Bellon | Plasmagel | |
| Blunt scissors | FST | 14079-10 | |
| Blunt fine scissors | FST | 15025-10 | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15002-08 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-32 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-31 | |
| Cunningham Spinal Adaptor | Stoelting Co. | ||
| Kwik-Cast sealant | WPI | #KWIK-CAST | |
| Ventilator | CWE Inc | SAR-830/AP | |
| Capnograph | CWE Inc | μcapstar | |
| Heating blanket | Harvard Apparatus | 507221F | |
| Intracellular amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 2B | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G |
References
- Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. Recruitment and some other factors of reflex inhibition. Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).
- Huizar, P., Kuno, M., Miyata, Y. Electrophysiological properties of spinal motoneurones of normal and dystrophic mice. The Journal of physiology. 248, 231-246 (1975).
- Alstermark, B., Ogawa, J. In vivo recordings of bulbospinal excitation in adult mouse forelimb motoneurons. Journal of neurophysiology. 92, 1958-1962 (2004).
- Meehan, C. F., Sukiasyan, N., Zhang, M., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Intrinsic properties of mouse lumbar motoneurons revealed by intracellular recording in vivo. Journal of neurophysiology. 103, 2599-2610 (2010).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J. Neurosci. 29, 11246-11256 (2009).
- Iglesias, C., et al. Mixed mode oscillations in mouse spinal motoneurons arise from a low excitability state. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5829-5840 (2011).
- Crone, S. A., Zhong, G., Harris-Warrick, R., Sharma, K. In mice lacking V2a interneurons, gait depends on speed of locomotion. J. Neurosci. 29, 7098-7109 (2009).
- Talpalar, A. E., et al. Identification of minimal neuronal networks involved in flexor-extensor alternation in the mammalian spinal cord. Neuron. 71, 1071-1084 (2011).
- Rabe, N., Gezelius, H., Vallstedt, A., Memic, F., Kullander, K. Netrin-1-dependent spinal interneuron subtypes are required for the formation of left-right alternating locomotor circuitry. J. Neurosci. 29, 15642-15649 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
- Simpson, D. P. Prolonged (12 hours) intravenous anesthesia in the rat. Laboratory animal science. 47, 519-523 (1997).
- Burke, R. E. Motor Unit Types - Functional Specializations in Motor Control. Trends Neurosci. 3, 255-258 (1980).
- Kerkut, G. A., Bagust, J. The isolated mammalian spinal cord. Prog. Neurobiol. 46, 1-48 (1995).
- Carp, J. S., et al. An in vitro protocol for recording from spinal motoneurons of adult rats. Journal of Neurophysiology. 100, 474-481 (2008).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An In Vitro Spinal Cord Slice Preparation for Recording from Lumbar Motoneurons of the Adult Mouse. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice. Journal of Neurophysiology. , (2011).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway. J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).
- Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion. Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).
- Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo. The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).
Tags
Nörobilim Sayı 70 Fizyoloji Biyofizik Anatomi Tıp Motor Sistemi Spinal Kord intrasellüler Recordings motonöronlar EMG Kuvvet lomber nöron beyin fare hayvan modeliErratum
Formal Correction: Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo
Posted by JoVE Editors on 01/04/2013.
Citeable Link.
A correction was made to Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo. There was an error in the name of one author, Marin Manuel. The author's name has been corrected to:
Marin Manuel
instead of:
Manuel Marin
