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Summary
इस नई विधि में एक एकल वयस्क माउस motoneuron और अपनी मांसपेशी फाइबर द्वारा उत्पादित बल की माप के साथ - साथ intracellular रिकॉर्डिंग परमिट. सामान्य और आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं में मोटर इकाइयों के विद्युत और यांत्रिक गुणों की संयुक्त जांच neuromuscular प्रणाली के अध्ययन के लिए एक सफलता है.
Protocol
1. एक कदम
पूर्व चतनाशून्य करनेवाली औषधि दवा: संज्ञाहरण के शामिल होने से पहले 10-15 मिनट, atropine (0.20 मिलीग्राम / किग्रा) और (0.05 मिलीग्राम) methylprenidsolone उप cutaneously इंजेक्षन राल निकालना और edema, क्रमशः रोकने के.
2. दो कदम
संज्ञाहरण के प्रेरण: pentobarbital सोडियम (70 मिग्रा / किग्रा) या ketamine / xylazine (100 मिलीग्राम / किग्रा और 10 मिलीग्राम / किग्रा, क्रमशः) अंतर peritoneally के एक मिश्रण इंजेक्षन. चलो माउस के तहत जाना है जब तक कोई पैर की अंगुली चुटकी पलटा प्राप्त किया जा सकता है. यदि संज्ञाहरण भी प्रकाश लगता है, खुराक के 1/4 के साथ पूरक.
3. तीन कदम
* ध्यान दें: इस सर्जरी के एक टर्मिनल प्रक्रिया है.
जब संज्ञाहरण के एक शल्य विमान पहुँच गया है, एक उठाया गर्म कंबल पर एक प्रवण स्थिति में माउस हस्तांतरण.
- एक मुखौटा 100 मिलीग्राम / मिनट के आसपास एक प्रवाह में शुद्ध 2 हे पहुंचाने के साथ माउस के कवर थूथन.
- भी सही hindlimb दाढ़ी.
- लापरवाह स्थिति माउस पलटें, लेकिन देखभाल करने के लिए जगह में ऑक्सीजन मास्क छोड़.
4. चार चरण
अंगों के आसपास looped और काम की सतह के चार कोनों में सुरक्षित sutures के साथ जगह में माउस सुरक्षित.
5. पांच चरण
तापमान जांच सम्मिलित करने के लिए माउस कोर के तापमान पर नजर रखने के लिए. हीटिंग कंबल / दीपक शक्ति को समायोजित करने के लिए 36 डिग्री सेल्सियस और 38 डिग्री सेल्सियस के बीच कोर तापमान बनाए रखने के
6. ट्रेकिआटमी और कृत्रिम वेंटिलेशन
- कुंद कैंची का प्रयोग, ट्रेकिआ पर एक कट बनाने के लिए और त्वचा दोनों पक्षों पर दूर खींच.
- कुंद संदंश का प्रयोग, लार ग्रंथि के अलावा आंसू के रूप में दो पतली मांसपेशियों (sternohyoid) ट्रेकिआ को कवर का पर्दाफाश करने के लिए.
- कुंद संदंश का प्रयोग, दो musc अलगलेस के साथ उनकी औसत दर्जे के लिए ट्रेकिआ प्रकट जुदाई.
- एक Dumont 7 संदंश का प्रयोग, ट्रेकिआ के तहत 4.0 रेशम सीवन के दो लंबाई स्लाइड.
- दो कार्टिलेजीनस छल्ले के बीच में एक ट्रेकिआ में आड़ा काट लेकिन देखभाल करने के लिए ट्रेकिआ अनुभाग पूरी तरह से नहीं.
- ट्रेकिआ नीचे ट्रैकियल ट्यूब डालें, तो इसे खत्म sutures बांधने से प्रविष्टि खोलने की दोनों पक्षों पर यह सुरक्षित है. tracheal ट्यूब एक माउस (SAR-830/AP, CWE इंक) वेंटीलेटर और एक capnograph (μcapstar, CWE इंक) से जुड़ा है. वेंटीलेटर, एक अनुपालन बैग के माध्यम से जुड़ा हुआ है, शुद्ध 2 हे के एक स्रोत. (साँस लेने की दर 100-150 bpm, अंत ज्वार की मात्रा 170-310 μl) तो वेंटीलेटर कृत्रिम वेंटिलेशन कि माउस के खिलाफ नहीं लड़ रहे हैं और अंत ज्वारीय 2 पीसीओ 4 और 5% के बीच स्थिर है के मापदंडों को समायोजित करें.
7. अंतःशिरा लाइन्स की नियुक्ति
- कुंद विच्छेदन तकनीकों का प्रयोग, कंठ का बेनकाबगर्दन एक तरफ पर नस. इस स्तर पर, गले नस दो प्रमुख चड्डी, पूर्वकाल और कूल्हों चेहरे नसों में विभाजन है.
- निम्नलिखित दो बार, इन चड्डी के प्रत्येक के लिए एक सेट कदम करना:
- Dumont 4 या 5 संदंश का प्रयोग, उसके आसपास के संयोजक ऊतक से ध्यान नस अलग.
- Dumont 7 संदंश का प्रयोग, नस के तहत 6.0 रेशम sutures के दो लंबाई स्लाइड. जहाँ तक संभव हो उन्हें नस की लंबाई के साथ अलग.
- शिरा (दिल के करीब की ओर) के समीपस्थ पक्ष पर एक छोटे पोत क्लिप जगह, और नस के बाहर की ओर टाई.
- बहुत ठीक परितारिका कैंची का प्रयोग, नस में एक छोटा सा चीरा अनुप्रस्थ, महान देखभाल नस रही पूरी तरह से अनुभाग के लिए नहीं है.
- खोलने में एक पहले से भरे 1Fr कैथेटर डालें (premicath, Vygon), पोत क्लिप के लिए.
- नस और कैथेटर एक Dumont 4 संदंश में एक साथ होल्डिंग, ध्यान से पोत क्लिप निकालने के लिए, तो कैथेटर कुछ mor धक्कानस में ई मिलीमीटर.
- यह प्रविष्टि के दोनों पक्षों पर दोनों sutures के साथ बांधने से कैथेटर सुरक्षित.
- कैथेटर के एक सिरिंज या एक सिरिंज पंप से जुड़ा है anesthetics जब भी आवश्यक (आमतौर पर हर 10-30 मिनट). की पूरक खुराक इंजेक्षन चतुर्थ खुराक या तो 6 मिलीग्राम / pentobarbital सोडियम या 1250 ग्राम / किलो / ketamine / xylazine 12 मिनट 40 किलो है. अन्य कैथेटर एक 4% ग्लूकोज युक्त समाधान 3 NaHCO (1%) और plasmion (14%) की एक धीमी अंतःशिरा निषेचन (50 μl / घंटा) के लिए एक सिरिंज पंप से जुड़ा हुआ है.
8. सुई और सिवनी के साथ गर्दन की त्वचा, और प्रवण स्थिति माउस लौटें
9. हिंद अंग मांसपेशियों और नसों के विच्छेदन
- कैंची का प्रयोग, स्नायुजाल जांघ के ऊपर से एक चीरा बनाने. अंतर्निहित मांसपेशियों से त्वचा अलग है, देखभाल करने के लिए रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं है. के रूप में की जरूरत दाग़ना.
- ध्यान से मछलियां नितम्बास्थि काटना. दाग़ना / संयुक्ताक्षर के रूप में रक्तस्राव को रोकने के लिए आवश्यक है. मछलियां जाँघ की हड्डी पूरी तरह से हटाया जा सकता है या बस sciatic तंत्रिका और Surae मांसपेशियों Triceps बेनकाब reclined.
- बाहर पिडली का तंत्रिका काटना.
- / 0 8 रेशम धागे का उपयोग, आम peroneal तंत्रिका के बाहर का हिस्सा टाई और गाँठ को बाहर में कटौती. तंत्रिका सभी तरह काटना, के रूप में संभव के रूप में कूल्हे के करीब है.
- Tibial तंत्रिका आम peroneal और पिडली का तंत्रिकाओं के बीच में पहचानें. Tibial तंत्रिका की विभिन्न शाखाओं के अलावा, कि गहरी (आगे से tibial तंत्रिका के रूप में जाना जाता है) जाना शाखाओं से Triceps Surae innervating शाखाओं की पहचान.
- 0 8 / रेशम का उपयोगधागा, एक साथ tibial तंत्रिका की सभी शाखाओं टाई जबकि बरकरार innervating शाखाओं Triceps Surae रखने. Tibial तंत्रिका distally गाँठ और कट तंत्रिका टुकड़े करना जहाँ तक संभव हो.
- एक नमक के साथ आत्मसात dessication रोकने के लिए जब अगले कदम के साथ आगे बढ़ने से धुंध के साथ पूरे hindlimb कवर.
10. Laminectomy
- कैंची का प्रयोग, रीढ़ की हड्डी के साथ एक चीरा बनाने. अंतर्निहित मांसपेशियों से त्वचा अलग करें.
- चमड़े के नीचे की मांसपेशियों को अलग कशेरुकाओं के प्रत्येक पक्ष पर दो चीरों बनाओ. मांसपेशियों है कि प्रत्येक पक्ष पर कशेरुकाओं के पक्ष में देते हैं तो प्रत्येक पट्टा काटा.
- कुंद संदंश और एक ठीक curette का उपयोग, कशेरुकाओं की पृष्ठीय पक्ष पर spinous प्रक्रियाओं के आसपास मांसपेशी के शेष के लिए स्पष्ट रूप से प्रत्येक व्यक्ति पृष्ठवंश की पहचान हटा दें.
- T13 कशेरुक और L1 पहचानें. T13 पिछले पृष्ठवंश पसलियों संलग्न है. कशेरुका स्तंभ wबीमार कनिंघम स्पाइनल कॉर्ड कशेरुका clamps (कं Stoelting) का उपयोग कर स्थिर हो. T13 और L1 के प्रत्येक पक्ष पर रीढ़ की हड्डी में clamps रखें. रीढ़ की हड्डी नहीं सेक सावधान रहो, लेकिन अनुदैर्ध्य अक्ष में तनाव का एक छोटा सा डाल. जाँच करें कि स्पाइनल कॉलम संदंश के साथ धीरे नीचे दबाने से सुरक्षित है.
- प्रयोग ठीक rongeurs, रीढ़ की हड्डी में प्रक्रियाओं तो T13 और L1 laminae निकालने के लिए, जिससे रीढ़ की हड्डी को उजागर.
- छोटे कपास या spongel के बिट्स नमक के साथ आत्मसात desiccation रोकने के साथ कवर उजागर रीढ़ की हड्डी है.
- पीठ के शीर्ष पर एक कस्टम बनाया प्लास्टिक स्नान, रीढ़ की हड्डी के आसपास रखें. 0 4 / रेशम धागे का उपयोग जगह में स्नान सुरक्षित. सुनिश्चित करें कि स्नान Kwik कास्ट सीलेंट (डब्ल्यूपीआई) के साथ सील कर पनरोक है.
- एक बार Kwik कास्ट सूख गया है, रीढ़ की हड्डी को कवर कपास हटाने, और खनिज तेल के साथ स्नान को भरने.
- Dumont 5 संदंश और बहुत ठीक परितारिका कैंची का प्रयोग, धीरे ड्यूरा दोस्त पर पुलr रीढ़ की हड्डी के आसपास है, और यह दोनों दिशा में जहाँ तक संभव हो खुला. रीढ़ की हड्डी के प्रत्येक पक्ष पर ड्यूरा मोड़ो.
- कम उठाया मंच जिस पर माउस तो झूठ बोल रहा है के रूप में रखने के लिए यह कशेरुका क्लैंप से निलंबित कर दिया.
- अन्य कशेरुका क्लैंप का उपयोग त्रिक जानवर के पीछे क्षेत्र के समर्थन में क्षेत्र के एक spinous प्रक्रिया क्लैंप.
- एक 3 क्लैंप सही hindlimb और टखने स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, घुटने में एक 90 डिग्री के कोण पर flexed.
11. स्नायुजाल विच्छेदन
- साथ अंग घुटने और टखने में 90 डिग्री पर तुला, hindlimb क्षेत्र को कवर धुंध हटाने, और ऊतकों आसपास के Achilles मुफ्त पट्टा टुकड़े करना. जितना संभव ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से आसपास से Triceps Surae रूप काटना.
- Plantaris कैल्केनीयस के करीब पेशी की कण्डरा कट, तो इसे फिर से कटौती करने के लिए पट्टा पूरी तरह से हटाने के लिए.
- एक लड़ी सुई का प्रयोग, वीं के माध्यम से 6/0 रेशम धागा संलग्नई स्नायुजाल और पट्टा के चारों ओर एक ट्रिपल गाँठ.
- बल गाँठ के करीब transducer रखें, कण्डरा के बाहर का हिस्सा काट, और बल transducer रेशम धागे का उपयोग करने के लिए देते हैं.
- Triceps Surae मांसपेशियों की प्रावरणी में स्टेनलेस स्टील के तार के दो लंबाई डालें. इन तारों EMG रिकॉर्डिंग के लिए एक बाह्य एसी एम्पलीफायर से जुड़े हैं.
- दो द्विध्रुवी हुक इलेक्ट्रोड पर आम peroneal तंत्रिका और tibial तंत्रिका रखें.
- एक हुक इलेक्ट्रोड के कैथोड पर anode पास में एक मांसपेशी को छूने के साथ Triceps Surae तंत्रिका, रखें.
- एक अलग इकाई के लिए सभी उत्तेजक इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
- रीढ़ की हड्डी है, कोशिकी एक एसी एम्पलीफायर से जुड़ा कॉर्ड dorsum क्षमता रिकॉर्ड की पृष्ठीय सतह पर एक गेंद इलेक्ट्रोड रखें. एक पीठ की मांसपेशियों के साथ संपर्क में एक संदर्भ एजी / AgCl इलेक्ट्रोड रखें.
12. बारह कदम
Triceps Surae तंत्रिका उत्तेजितबढ़ती तीव्रता के एक 50 μsec वर्ग नाड़ी का उपयोग कर एक कम आवृत्ति (<1 हर्ट्ज) में अधिकतम चिकोटी आयाम मनाया जाता है जब तक. धीरे बल transducer स्थानांतरित करने के लिए मांसपेशी खिंचाव है जबकि चिकोटी प्रतिक्रिया के आयाम निगरानी चिकोटी आयाम तक एक अधिकतम तक पहुँचता है.
13. Motoneurons के intracellular रिकॉर्डिंग
पर इस बिंदु से, मानक electrophysiological तकनीकों एक intracellular इलेक्ट्रोड तैयार, रीढ़ की हड्डी में एक न्यूरॉन घुसना और यह एक motoneuron के रूप में पहचान करने के लिए किया जाता है.
- एक ~ 1 सुक्ष्ममापी टिप करने के लिए एक विंदुक डांड़ी (P-97 micropipette डांड़ी, Sutter उपकरण) का उपयोग करते हुए एक गिलास micropipette खींचो. एक KCl 3M समाधान (MΩ 10-20 इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध) के साथ इलेक्ट्रोड भरें.
- एक micropositioner का प्रयोग, micropipette, रीढ़ की हड्डी में एक intracellular एम्पलीफायर (Axoclamp 2B, Axon उपकरण) से जुड़ा ड्राइव. मॉनिटर स्थानीय क्षेत्र ई की उत्तेजना से हासिल क्षमताach तंत्रिका Triceps Surae की मोटर पूल का पता लगाने के लिए.
- ध्यान से ख्यात motoneurons दृष्टिकोण, जबकि microelectrode के प्रतिरोध की निगरानी. जब एक झिल्ली के खिलाफ धक्का, प्रतिरोध बढ़ जाती है. पहुंच कुछ समय intracellular एम्पलीफायर के "चर्चा" समारोह का उपयोग करके मदद की जा सकता है.
14. इच्छामृत्यु प्रक्रिया
प्रयोग के अंत में, पशु pentobarbital की जरूरत से ज्यादा (210 मिलीग्राम / किग्रा चतुर्थ), कत्ल द्वारा पीछा द्वारा euthanized है.
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Representative Results
चित्रा 1 से पता चलता है कि किस तरह प्रवेश के बाद Triceps Surae समूह से एक motoneuron की पहचान करने के लिए. कम उत्तेजना की तीव्रता में, केवल एक monosynaptic EPSP (चित्रा 1 ए) देखा जा सकता है. उच्च तीव्रता EPSP काफी बड़े के लिए एक "orthodromic" स्पाइक (चित्रा 1B) ट्रिगर हो सकता है. भी उच्च उत्तेजना तीव्रता, एक सभी या कोई भी तंत्रिका आवेगों को सामान्य से विपरीत दिशा में संचालित करने वाला, प्रतिदिक कील monosynaptic EPSP (चित्रा 1C) की तुलना में एक कम विलंबता के साथ प्रकट होता है. यदि पर्याप्त वर्तमान microelectrode इंजेक्शन के माध्यम से एक कील ट्रिगर, एक EMG गतिविधि एक छोटी देरी के बाद पेशी पर दर्ज किया जा सकता है, एक मांसपेशी चिकोटी (चित्रा 1D) द्वारा पीछा किया. Motoneuron की पहचान के बाद, अपने electrophysiological गुण विशेषता जा सकता है. उदाहरण के लिए, चित्रा 2 वर्णन कैसे इनपुट प्रतिरोध hyperpolarizing और वर्तमान (2A चित्रा) की दालों depolarizing, और की साजिश रचने का उपयोग कर मापा जा सकता है इंजेक्शन वर्तमान (चित्रा 2B) की राशि बनाम झिल्ली क्षमता के रूपांतरों.
मोटर इकाई के सिकुड़ा गुणों भी उत्तेजना की विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, रिश्ते बल आवृत्ति motoneuron (चित्रा 3A) में विभिन्न आवृत्तियों पर वर्तमान दालों की कमी का इंजेक्शन लगाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. स्थिर राज्य बल फिर चालू करने के लिए एक sigmoidal वक्र बल आवृत्ति (3B चित्रा) प्रकट दालों की आवृत्ति के खिलाफ साजिश रची जा सकता है.
यदि संज्ञाहरण नियंत्रण में है, यह संभव है करने के लिए अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए एक एकल मोटर इकाई से रिकॉर्ड. समय की इस चूक में यह संभव हो सकता करने के लिए प्रोटोकॉल के एक बड़े सरणी को चलाने के लिए दोनों motoneuron और मांसपेशी फाइबर यह innervates की सिकुड़ा गुणों विशेषताएँ चाहिए.
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चित्रा 1. एक motoneuron की पहचान करने की प्रक्रिया का उदाहरण. पैनलों सी तीन एक motoneuron के लगातार sciatic तंत्रिका की एक बढ़ती हुई बिजली की उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए. ऊर्ध्वाधर धराशायी लाइन उत्तेजना के समय को इंगित करता है. प्रत्येक पैनल intracellularly दर्ज झिल्ली (शीर्ष ट्रेस) क्षमता और अभिवाही काठ कॉर्ड (नीचे ट्रेस) की सतह पर दर्ज वॉली ए सीमा से ऊपर सिर्फ एक तीव्रता (समूह मैं afferents की भर्ती के लिए टी 1.1 x), एक EPSP बिजली की उत्तेजना के जवाब में दिखाई दिया. EPSP monosynaptic था क्योंकि इसकी केंद्रीय विलंबता मिसे 0.4 (छोटे ऊर्ध्वाधर बिंदीदार लाइनों), एक मार्ग के लिए एक से अधिक synapse शामिल बहुत छोटा था. बी उत्तेजना तीव्रता (2.0 एक्स टी) बढ़ाने EPSP के आकार में वृद्धि हुई है जब तक यह था काफी बड़े के लिए एक orthodromic कील सी.. ट्रिगर जब उत्तेजना तीव्रता और भी अधिक बढ़ा दिया गया था(टी x 2.1), अक्षतंतु भर्ती किया गया था और एक तंत्रिका आवेगों को सामान्य से विपरीत दिशा में संचालित करने वाला, प्रतिदिक कार्रवाई संभावित उत्तेजना समय के लिए सम्मान के साथ एक 1.2 मिसे विलंबता के साथ दिखाई दिया. 38mm के एक प्रवाहकत्त्व लंबाई को देखते हुए, axonal चालन वेग 32 मीटर / सेकंड था डी. वर्तमान जब नीचे (ट्रेस) एक Triceps Surae (एसी की तुलना में अलग motoneuron) motoneuron, एक कार्रवाई संभावित सोमा में हासिल किया जा सकता है में इंजेक्ट किया जाता है ( नीचे से 2 ट्रेस). इस कार्रवाई संभावित अक्षतंतु नीचे यात्रा, न्यूरो पेशी जंक्शन पार, और मांसपेशी पेशी दर्ज motoneuron द्वारा innervated फाइबर में कार्रवाई की क्षमता से चलाता है. मिश्रित कार्रवाई संभावित (ऊपर से 2 ट्रेस) EMG इलेक्ट्रोड का उपयोग दर्ज किया जा सकता है. मांसपेशी फाइबर की चिकोटी संकुचन ऊपरी का पता लगाने में दिखाया गया है. मोटर इकाई के संकुचन के समय दो खड़ी धराशायी लाइनों के बीच चिकोटी प्रतिक्रिया से अनुमान लगाया जा सकता है. चित्रा 5 रेफरी से भाग में रूपांतरित किया.
चित्रा 2. एक motoneuron के इनपुट प्रतिरोध का आकलन. वर्तमान दालों की एक श्रृंखला (नीचे निशान) स्थायी 500 मिसे और -3 से दो ना लेकर औसत प्रतिक्रिया. Motoneuron (भरा तीर) के वोल्टेज प्रतिक्रिया पर शिथिलता सूचना: वोल्टेज तेजी से एक कम पठार मूल्य (काला वर्ग) के लिए स्थिर होने से पहले एक चोटी काले (डॉट) पर पहुंच गया. वर्तमान नाड़ी के बाद समाप्त कर दिया गया है, एक पलटाव खाली (तीर) प्रकट होता है. वोल्टेज के विक्षेपन (ΔV) बनाम वर्तमान नाड़ी की तीव्रता बी प्लॉट. डॉट्स प्रतिक्रिया के चरम पर मापा गया है, जबकि वर्ग नाड़ी के अंत में मापा गया है, के रूप में चित्रा B1 के शीर्ष पर प्रतीकों द्वारा दर्शाया. सीधे लाइनों शिखर (धराशायी) प्रतिक्रिया और पठार प्रतिक्रिया (डेश डॉटेड) का सबसे अच्छा रैखिक फिट बैठता हैं. इन लाइनों के ढलानों चोटी इनपुट प्रतिरोध और पठारmotoneuron के इनपुट प्रतिरोध क्रमशः. चित्रा 5 रेफरी से अनुकूलित.
चित्रा 3. एक मोटर इकाई बल आवृत्ति के रिश्ते की विशेषता शीर्ष तीन पैनलों बताते हैं: नीचे निशान पर, वर्तमान की दालों आवृत्ति पर दोहराया प्रत्येक कक्ष के शीर्ष पर संकेत और प्रकाश में लाना motoneuron में कार्रवाई क्षमता के लिए इस्तेमाल किया, 2 पर नीचे, motoneuron की झिल्ली क्षमता, दालों की आवृत्ति पर कार्रवाई क्षमता दिखाने से ट्रेस, 2 शीर्ष, EMG गतिविधि से निशान पर, शीर्ष निशान ऐक्शन पोटेंशिअल की ट्रेन द्वारा उत्पादित बल पर. नीचे के पैनल से पता चलता है व्यक्तिगत गाड़ियों के दौरान पहुंचे बल की राशि का सारांश ग्राफ हर रेलगाड़ी में कार्रवाई की क्षमता की आवृत्ति के खिलाफ साजिश रची. वक्र sigmoidal है.
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Discussion
यहाँ वर्णित तैयारी पहली बार है कि वयस्क माउस, एक काठ motoneuron और पेशी अपने अक्षतंतु द्वारा innervated फाइबर द्वारा उत्पादित बल की माप के साथ - साथ intracellular रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, है.
जानवर के छोटे आकार की वजह से, शल्य इस तैयारी के लिए आवश्यक कौशल के लिए अधिग्रहण करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. हालांकि, एक बार उन कौशल में महारत हासिल कर रहे हैं, पूरी सर्जरी में तीन घंटे में प्रदर्शन किया जा सकता है, और जानवरों के लिए जीवित रहते हैं रिकॉर्डिंग के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के अंत के बाद 7 अधिक घंटे के लिए कर सकते हैं. इस तकनीक की सफलता संज्ञाहरण पर प्रबंधन पर अनिवार्य रूप से प्रासंगिक है. यह महत्वपूर्ण है ध्यान से संभव के रूप में कई शारीरिक मापदंड (कोर तापमान 2 पीसीओ, हृदय की दर, आदि) के रूप में की निगरानी करने के लिए और बनाए रखने के लिए उन्हें उनके संबंधित शारीरिक रेंज है. उदाहरण के लिए कोई विचलन तुरंत चाहिए वृद्धि / कम करने के लिए ज बिजली द्वारा remediedकंबल खाने, श्वासयंत्र के मापदंडों का समायोजन, या अधिक anesthetics जोड़ने. यह हमारा अनुभव है कि माउस की शारीरिक स्थिति बदतर के लिए एक आश्चर्यजनक जल्दी मोड़ ले कर सकते हैं अगर करीब ध्यान इन मापदंडों के लिए सभी समय पर भुगतान नहीं किया है.
यांत्रिक स्थिरता सर्वोपरि महत्व का है जब intracellular रिकॉर्डिंग हासिल करने की कोशिश कर रहा है. यह जहां motoneurons रक्तचाप, श्वसन, और मांसपेशी संकुचन के प्रभाव के अधीन स्थानांतरित कर सकते हैं, vivo में विशेष रूप से सच है. हालांकि यह गारंटी सही स्थिरता के लिए असंभव है, हमारी प्रक्रिया दस मिनट या उससे अधिक के लिए motoneurons के स्थिर रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है. यह चार कशेरुका स्तंभ और पैर की हड्डियों immobilizing clamps के एक संयोजन के द्वारा हासिल की है. दो clamps laminectomy साइट से संभव के रूप में बंद करने के लिए उस क्षेत्र में रीढ़ की हड्डी को स्थिर के रूप में स्थित हैं. हमने पाया है कि दो clamps के बीच रीढ़ की हड्डी की लंबाई कम करने के रूप में के रूप में अच्छी तरह का एक छोटा सा exertingहड्डियों पर तनाव बहुत अच्छा स्थिरीकरण प्रदान की है, के रूप में हम रुक 5 जानवरों में कई घंटे के लिए intracellular रिकॉर्डिंग को बनाए रखने में सक्षम थे. हालांकि, वर्तमान मामले में, पशु रुक नहीं है और मांसपेशियों को अनुबंध करने के लिए स्वतंत्र हैं, खासकर जब sciatic तंत्रिका उत्तेजक. यही कारण है इसलिए हम पूरे पैर दो clamps, एक त्रिकास्थि स्तर पर उपयोग कंकाल स्थिर, पूरे हिप immobilizing और इसलिए कशेरुका स्तंभ के लिए प्रेषित किया जा रहा है से मांसपेशी संकुचन को रोकने, और एक टखने में 90 एक पैर स्थिर ° कोण.
इस तकनीक का उपयोग करना, यह संभव है लिए अपनी मोटर 13 इकाई के बल प्रोफाइल के आधार पर motoneuron के शारीरिक प्रकार की पहचान. Motoneurons धीमी या तेज उनके चिकोटी संकुचन के समय के आधार पर, और Fatigable या थकान उनके लिए दोहराए उत्तेजना के दौरान एक भी बल को बनाए रखने की क्षमता के आधार पर प्रतिरोधी के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है. में, यह तैयारी प्रावधानों के रूप मेंdes इन विट्रो तैयारी में एक निश्चित लाभ. में इन विट्रो परिस्थितियों में, रीढ़ की हड्डी जानवर के शरीर से निकाला जाता है और एक या तो पूरा या कटा डिश में रखा गया है. ग्रे मामले आसपास myelin की परत की वजह से, उचित oxygenation केवल नवजात पशुओं में प्राप्त किया जा सकता है जहां myelination 14 पूरा नहीं हुआ है. हाल ही में तकनीकी विकास वयस्क 15-17 स्लाइस में रीढ़ की हड्डी में motoneurons की रिकॉर्डिंग की अनुमति दी है, लेकिन, इन विट्रो रिकॉर्डिंग में इस दृष्टिकोण की बड़ी खामी है, जो यह है कि वहाँ कोई दर्ज motoneuron शारीरिक प्रकार की पहचान करने के लिए एक रास्ता (एस कम नहीं करता है, FR, या एफएफ, या भी अल्फा बनाम गामा) motoneurons है कि आंतरिक रूप से अलग कर रहे हैं से experimentalist साथ रिकॉर्डिंग पूल के लिए मजबूर, समारोह के संदर्भ, electrophysiological गुण और प्रोटीन सामग्री में (एक समीक्षा के लिए मैनुअल और Zytnicki, 2011 18 motoneurons के विभिन्न प्रकार के).
vivo रिकॉर्डिंग में इन पशुओं में आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है मोटर प्रणाली के समारोह पर इस विशिष्ट परिवर्तन के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए शक्ति का उत्पादन. यह तैयारी भी Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस) या रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) जैसे neurodegenerative मानव रोगों के अध्ययन के लिए बहुत होनहार है. आनुवंशिक मॉडल वास्तव में उत्पन्न किया गया है कि इन 10,11 रोगों की पहचान के लक्षणों को दोहराने. नई तैयारी यहाँ वर्णित motoneurons और रोग की प्रगति के दौरान मांसपेशियों फाइबर (दोनों स्वतंत्र रूप से और एक साथ) के व्यवहार का परीक्षण द्वारा इन बीमारियों में neuromuscular जंक्शनों की भूमिका का अध्ययन करने की संभावना को खोलता है. हाल ही में, दो स्वतंत्र समूहों vivo माउस की तैयारी में एक decerebrated या सहज हरकत का प्रदर्शन करते है कल्पित विकसित करने में सक्षम थे19,20 हरकत. यदि रिकॉर्डिंग स्थिरता की तरह है कि हम प्रक्रिया का उपयोग कर निरीक्षण यहाँ वर्णित प्रमस्तिष्कवियोजन के बाद हासिल किया जा सकता है, यह न केवल motoneurons के अध्ययन के लिए एक दुर्जेय उपकरण का गठन, लेकिन सभी पूर्व मोटर स्पाइनल हरकत लय पैदा करने में शामिल सर्किट .
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम Fondation डालना ला Recherche MEDICALE (एफ आर एम), ALS अनुसंधान (ALS एसोसिएशन), NIH NINDS NS05462 और NS034382 अनुदान, और ANR अनुदान HyperMND के लिए मिल्टन Safenowitz Postdoctoral फैलोशिप से वित्तीय सहायता के लिए संभव धन्यवाद किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine sulfate | Aguettant | ||
| Methylprenidsolone | Pfizer | Solu-Medrol | |
| Sodium pentobarbitone | Sanofi-Aventis | Pentobarbital | |
| Ketamine | |||
| Xylazine | |||
| Glucose | |||
| Plasma expander | Roger Bellon | Plasmagel | |
| Blunt scissors | FST | 14079-10 | |
| Blunt fine scissors | FST | 15025-10 | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15002-08 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-32 | |
| Fine forceps serrated | FST | 11370-31 | |
| Cunningham Spinal Adaptor | Stoelting Co. | ||
| Kwik-Cast sealant | WPI | #KWIK-CAST | |
| Ventilator | CWE Inc | SAR-830/AP | |
| Capnograph | CWE Inc | μcapstar | |
| Heating blanket | Harvard Apparatus | 507221F | |
| Intracellular amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 2B | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G |
References
- Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. Recruitment and some other factors of reflex inhibition. Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).
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Formal Correction: Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo
Posted by JoVE Editors on 01/04/2013.
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Marin Manuel
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Manuel Marin
