Одновременное внутриклеточной регистрации мотонейронов поясничного и силы, возникающей в ее мотор в взрослой мыши Published: December 5, 2012 doi: 10.3791/4312

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Marin Manuel¹, C.J. Heckman¹

¹Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

Этот новый метод позволяет одновременно внутриклеточной регистрации одного мотонейрона мыши взрослых и измерению силы, возникающей в ее мышечных волокон. В сочетании исследования электрических и механических свойств моторных единиц в нормальных и генетически модифицированных животных является прорывом для изучения нервно-мышечной системы.

Protocol

1. Шаг первый

Предварительно анестетика лекарства: 10-15 мин до анестезии, вводят атропин (0,20 мг / кг) и methylprenidsolone (0,05 мг) подкожно, чтобы предотвратить слюноотделение и отек, соответственно.

2. Шаг второй

Индукция анестезии: инъекционные пентобарбитала натрия (70 мг / кг) или смесью кетамина / ксилазина (100 мг / кг и 10 мг / кг, соответственно) внутрибрюшинно. Пусть мышь идти под пока нет рефлекса ноги щепотку может быть получен. Если анестезии кажется слишком легким, дополнения с 1/4 от дозы.

3. Шаг третий

* Примечание: эта операция является терминал процедуры.

При хирургической анестезии плоскость была достигнута, перенесите мышью на возвышении теплое одеяло в положении лежа.

1. Накройте морду мыши с маской доставки чистой O ₂ при расходе около 100 мл / мин.
2. Бритье также право задних конечностей.
3. Переверните мышь положении лежа на спине, но будьте осторожны, чтобы оставить кислородную маску на место.

4. Шаг четвертый

Закрепить мыши на место со швами петлей вокруг конечности и закреплены на четырех углах рабочей поверхности.

5. Шаг пятый

Вставьте датчик температуры для контроля температуры мышь ядра. Отрегулируйте одеяло отопления / мощность лампы для поддержания внутренней температуры от 36 ° C до 38 ° C.

6. Трахеотомия и искусственной вентиляции

1. Использование тупыми ножницами, сделать разрез на трахее и потяните кожу от обеих сторон.
2. Использование тупым пинцетом, разорвать слюнных желез так, чтобы разоблачить две тонкие мышцы (грудинно-подъязычный), охватывающий трахеи.
3. Использование тупым пинцетом, разделить два MUSCле вдоль медиального разделения выявить трахеи.
4. Использование Дюмон 7 щипцы, сдвиньте две длины от 4,0 шелковых шва под трахеи.
5. Сделайте поперечный надрез в трахее между двумя хрящевых колец, но старайтесь не полностью раздел трахеи.
6. Вставьте трахеи трубки вниз по трахее, а затем закрепите его с обеих сторон вставки открытия, связывая нити над ним. Трахеи трубки подключены к мыши вентилятора (SAR-830/AP, КВО Inc) и капнографа (μcapstar, КВО Inc.) Вентилятор подключен через соблюдение сумку, к источнику чистой O _2. Настройте параметры вентилятора (частота дыхания 100-150 ударов в минуту, в конце-дыхательный объем 170-310 мкл), так что мышь не борется против искусственной вентиляции легких и в конце выдоха рСО ₂ стабильный между 4 и 5%.

7. Размещение внутривенного вливания

1. Использование методов тупой диссекции, подвергать яремнойвены на одной стороне шеи. На этом уровне яремной вены распадается на два основных стволов, передней и задней лицевой вены.
2. Выполните следующие шаги дважды, по одному на каждый из этих стволов:
   1. Использование Dumont 4 или 5 пинцетом, осторожно отделить вены от окружающих его соединительной ткани.
   2. Использование Дюмон 7 щипцы, сдвиньте две длины от 6,0 шелковых нитей под вены. отделить их как можно дальше вдоль вены.
   3. Нанесите небольшое судно клип на проксимальной стороне вены (сторона ближе к сердцу), и галстук с дистальной части вены.
   4. Использование очень тонкая диафрагма ножницами, сделать небольшой поперечный разрез в вену, с большой осторожностью, чтобы не раздел вены полностью.
   5. Вставьте предварительно заполненных 1FR катетер (premicath, Выгон) в отверстие, до судна клип.
   6. Проведение вену и катетер вместе в Dumont 4 пинцетом, осторожно снять судно клип, затем нажмите катетер несколько морэлектронной миллиметров в вену.
   7. Закрепить катетер, связывая его с обеих швов на обеих сторонах вставки.
3. Один из катетеров связано с шприцем или шприца для введения дополнительной дозы анестетика при необходимости (обычно каждые 10-30 мин). Дозу IV либо 6 мг / кг пентобарбитала натрия или 1250 +40 мкг / кг / мин кетамина / ксилазина ^12. Другой катетер подключен к шприцевой насос для медленной внутривенной инфузии (50 мкл / ч) 4% раствора глюкозы содержащие NaHCO ₃ (1%) и plasmion (14%).

8. Закрыть кожу шеи с иглы и шовный и вернуть мышь, чтобы положении лежа

9. Препарирование Задние конечности Мышцы и нервы

1. Используя ножницы, сделать разрез от верхней части бедра до ахиллова сухожилия. Отделить кожу от нижних мышц, стараясь не повредить кровеносные сосуды. Прижигание по мере необходимости.
2. Осторожно рассекают двуглавой мышцы бедра. Прижигание / вязи, необходимых для предотвращения кровотечения. Двуглавой мышцы бедра может быть полностью удалены или просто лежа, чтобы разоблачить седалищного нерва и трицепс голени мышц.
3. Проанализируйте из Sural нерва.
4. Использование 8/0 шелковой нитью, связать дистальной части общего малоберцового нерва и сократить дистальнее узел. Проанализируйте нерва вплоть до, как можно ближе к хип насколько это возможно.
5. Определить большеберцового нерва между ними общего малоберцового и Sural нервы. Среди различных ветвей большеберцового нерва, определить ветвей, иннервирующих трицепс голени с веток, которые идут глубже (далее именуемый большеберцового нерва).
6. Использование 8/0 шелканить, связать воедино все ветви большеберцового нерва при сохранении нетронутыми ветви, иннервирующие трицепс голени. Вырезать большеберцового нерва дистальнее узел и анализировать нерва вверх насколько это возможно.
7. Охват целого задних конечностей марлей впитал с физиологическим раствором для предотвращения высыхания в то время как приступить к следующему шагу.

10. Ламинэктомия

1. Используя ножницы, сделать надрез вдоль позвоночника. Отделить кожу от нижних мышц.
2. Сделать два надреза на каждой стороне позвонка отделить подкожные мышцы. Затем разрезать каждый сухожилия мышц, которые прикрепляются на стороне позвонка с каждой стороны.
3. Использование тупым пинцетом и штраф кюретки, удалите оставшуюся часть мышц на спинной стороне позвонков вокруг остистого отростка четко идентифицировать каждого позвонка.
4. Определить позвонки T13 и L1. T13 является последним позвонком, чтобы ребра прилагается. Позвоночного столба WЯ буду иммобилизованных помощью Cunningham спинного мозга позвоночных зажимы (Stoelting Co.) Поместите спинного зажимы с каждой стороны T13 и L1. Будьте осторожны, чтобы не сжимать спинного мозга, но положить немного напряжения в продольной оси. Убедитесь, что позвоночник хорошо защищена, нажав аккуратно пинцетом.
5. При использовании тонкой rongeurs, удалить спинной процессов, то пластинки над T13 и L1, тем самым подвергая спинного мозга.
6. Изолируйте открытый спинной мозг с небольшой бит из хлопка или spongel впитал с физиологическим раствором, чтобы предотвратить высыхание.
7. Разместить заказ пластиковой ванны на верхней части спины, окружающие спинной мозг. Закрепите ванну на месте с помощью 4/0 шелковой нитью. Убедитесь, что баня является водонепроницаемым, закрыв его с Kwik-Cast герметик (WPI).
8. После Kwik-Cast высохнет, снимите хлопка покрытие спинного мозга, и наполняйте ванну с минеральным маслом.
9. Использование Дюмон 5 щипцы и очень тонкая диафрагма ножницами, осторожно потяните на мат оболочкиГ окружающий спинной мозг, и открыть его как можно дальше в обоих направлениях. Сложите оболочку с каждой стороны спинного мозга.
10. Опустите поднятой платформе, на которой лежит мышь, чтобы держать его приостановлено позвоночного зажима.
11. С помощью другого позвоночного зажима для фиксации остистого отростка крестцовой области для поддержки спины области животного.
12. Третий зажим используется для иммобилизации правой задней конечности и голеностопного сустава, согнутой под углом 90 ° угол в колене.

11. Ахиллова сухожилия Dissection

1. С конечности согнуты под углом 90 ° в колене и в лодыжке, снимите марлю охватывающие задние конечности области, и анализировать ахиллова сухожилия бесплатно окружающие ткани. Проанализируйте как можно больше трицепс голени от окружающих тканей, а также.
2. Разрежьте сухожилие Plantaris мышц близка к пяточной кости, а затем вырезать его снова, чтобы удалить сухожилия полностью.
3. Используя резьбовые иглу, приложите 6/0 шелковой нитью через йэлектронной ахиллова сухожилия и сделать тройной узел вокруг сухожилия.
4. Поместите датчик силы близко к узлу, сократить дистальной части сухожилия, и приложите его к силе преобразователь помощью шелковой нити.
5. Вставьте два отрезка проволоки из нержавеющей стали под фасции мышц трицепс голени. Эти провода подключены к усилителю внеклеточной переменного тока для ЭМГ.
6. Поместите общий малоберцовый нерв и большеберцового нерва на двух биполярных электродов крючком.
7. Поместите нерва трицепс голени на катоде крючок электрода, с анодом прикосновения поблизости мышцы.
8. Подключить все стимулирующие электроды для изоляции блока.
9. Поместите шарик электрода на дорсальной поверхности спинного мозга, связанных с внеклеточным усилителя переменного тока для записи шнур спины потенциалов. Поместите Ag / AgCl электрод в контакте с задней мышцей.

12. Шаг двенадцатый

Стимулировать нерва трицепс голенис использованием 50 мкс прямоугольного импульса повышения интенсивности низких частот (<1 Гц) до максимальной амплитуды дергаться не наблюдается. Медленно перемещайте датчик силы, чтобы растянуть мышцы, контролируя амплитуду дергаться ответа пока не дергаться амплитуда достигает максимального значения.

13. Внутриклеточные записи мотонейронов

С этой точки зрения, стандартные электрофизиологические методы используются для подготовки внутриклеточного электрода, проникают нейронов в спинном мозге и определить его как МН.

1. Вытяните стекло микропипетки на ~ 1 мкм наконечник с помощью пипетки съемника (P-97 микропипетки съемник, Sutter Instruments). Заполните электрода с раствором KCl 3M (сопротивление электрода 10-20 МОм).
2. Использование микроподвижки, ездить микропипетки, связанных с внутриклеточными усилителя (Axoclamp 2B, Axon Instruments) в спинной мозг. Мониторинг локальных потенциалов поля вызванной стимуляцией электроннойАх нервов, чтобы найти двигатель бассейне голени трицепсы.
3. Осторожно подходить предполагаемого мотонейронов при мониторинге сопротивление микроэлектрода. При нажатии на мембрану, сопротивление увеличивается. Проникновение иногда может быть облегчена с помощью "шум" функции внутриклеточных усилителя.

14. Процедура эвтаназии

В конце эксперимента, животное усыпляют от передозировки пентобарбитала (210 мг / кг), а затем обезглавливание.

Representative Results

На рисунке 1 показано, как определить мотонейрона из группы трицепс голени после проникновения. При низкой интенсивности стимуляции, только моносинаптических ВПСП могут наблюдаться (рис. 1А). При более высокой интенсивности, ВПСП может быть достаточно большой, чтобы вызвать "ортодромном" шип (рис. 1б). При еще более высоких интенсивности стимуляции, все-или-ничего антидромной всплеска оказывается, с более короткой задержкой, чем моносинаптических ВПСП (рис. 1С). Если достаточный ток подается через микроэлектрод, чтобы вызвать всплеск, ЭМГ-активность может быть записан на мышцах после небольшой задержки, а затем мышечных (рис. 1D). После идентификации мотонейрона, его электрофизиологических свойств может быть охарактеризовано. Например, на рисунке 2 показано, как входное сопротивление можно измерить с помощью гиперполяризующего и деполяризующих импульсов тока (рис. 2A), и построение изменения мембранного потенциала по сравнению с количеством вводимого тока (рис. 2В).

Сократительных свойств блока двигателя также может быть изучена с использованием различных протоколов стимуляции. Например, в силу частотой отношения могут быть получены путем введения коротких импульсов тока при различных частотах в мотонейронов (рис. 3А). Устойчивая сила государства может быть заговор против частота импульсов тока, чтобы показать силу сигмоидальных частоты кривой (рис. 3В).

Если анестезии под контролем, можно записать из одного блока двигателя в течение более 15 мин. В этом промежуток времени она должна быть возможность запустить большой массив протоколов охарактеризовать как мотонейрона и сократительных свойств мышечных волокон он иннервирует.

/ 4312/4312fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Пример процедуры идентификации мотонейрона. Панели С трех последовательных реакция мотонейрона к увеличению электрической стимуляции седалищного нерва. Вертикальная пунктирная линия показывает время стимуляции. Каждая панель имеет внутриклеточно записал мембранный потенциал (верхний луч) и афферентный залп, записанные на поверхности поясничного мозга (нижний луч). А. В интенсивностью выше порога по набору группы I афферентов (1,1 х Т), ВПСП появился в ответ на электрическую стимуляцию. ВПСП был моносинаптических, потому что его центральная задержка, 0,4 мс (небольшие вертикальные пунктирные линии), был слишком коротким для путь с участием более чем одного синапса. В. Повышение интенсивности стимуляции (2,0 х Г) увеличил размер ВПСП, пока не стало достаточно большой, чтобы вызвать ортодромном шип. C. При интенсивности стимуляции была увеличена еще больше(2,1 х Г), аксон был завербован, и антидромной потенциал действия появился с 1,2 мсек задержкой по отношению к стимуляции времени. При проведении длина 38мм, аксональной скорость проведения была 32 м / с. D. Когда ток подается (нижний луч) в трицепс голени мотонейрона (различных мотонейронов, чем в AC), потенциал действия может быть вызван в сомы ( второй след от дна). Этот потенциал действия путешествует по аксону, пересекает нервно-мышечного соединения и триггеры потенциалов действия мышцы в мышечные волокна иннервируются записал мотонейрона. Потенциал действия соединения (второй следом сверху) может быть записана с помощью EMG электродов. Подергивание сокращение мышечных волокон показан в верхней следа. Сокращение времени на блок двигателя можно оценить по подергивание реакция между двумя вертикальными пунктирными линиями. Рисунок адаптироваться в части из работы ^5.

Рисунок 2. Оценка входное сопротивление мотонейрона. А. Средний ответ на серию импульсов тока (внизу следы) длительностью 500 мс и от -3 до +2 нА. Обратите внимание на прогиб от напряжения реакция мотонейрона (заполняется стрелке): напряжение быстро достигло своего пика (черные точки) до стабилизации на нижнем плато значение (черный квадрат). После импульса тока была прекращена, отскок (пустая стрелка) появляется. B. Земельный отклонение напряжения (ΔV) по сравнению с интенсивностью импульса тока. Точки были измерены на пике ответа, в то время как квадраты были измерены в конце импульса, как показано на символы на верхней части рис B1. Прямые линии являются лучшим линейным приступы максимальной чувствительностью (пунктир) и плато ответ (штрих-пунктир). Склоны этих линий пике входного сопротивления и плато яnput сопротивление мотонейрона, соответственно. Рисунок адаптированы из работы ^5.

Рисунок 3. . Характеристика силу частотой отношения блок двигателя тройку панели показывают: на дне следа, импульсы тока повторяются с частотой указано в верхней части каждой панели и используется для выявления потенциалов действия в мотонейрона, на втором проследить снизу, мембранный потенциал мотонейрона, показывая потенциалов действия на частоте импульсов; на второй следом сверху, ЭМГ; на верхней следы силы, возникающей в поезде потенциала действия. Нижняя панель показывает Общий график количества сил, достигнутых в ходе отдельных поездов заговор против частота потенциалов действия в каждом поезде. Кривая сигмоидальных.

Discussion

Подготовка описано здесь является первой, которая позволяет, во взрослой мыши, одновременное внутриклеточной регистрации поясничных мотонейронов и измерению силы, возникающей в мышечные волокна иннервируются ее аксона.

Из-за малого размера животного, хирургические навыки, необходимые для этого препарата может быть сложной задачей приобрести. Однако, как только эти навыки освоены, вся операция может быть выполнена в течение трех часов, и животные могут выжить в течение 7 более часа после окончания хирургического вмешательства для записей. Успех этого метода существенно зависит от управления на анестезию. Это имеет решающее значение внимательно следить, как многие физиологические параметры, как возможно (температура ядра, рСО _2, частота сердечных сокращений и т.д.) и поддерживать их является их соответствующих физиологических пределах. Любые отклонения должны быть устранены немедленно, например, увеличение / уменьшение мощности на часесть одеяло, регулировки параметров дыхания, или добавить больше анестетиков. Наш опыт показывает, что физиологическое состояние мыши может принимать удивительно быстро ухудшиться, если пристальное внимание не выплачивается во всех случаях эти параметры.

Механическая стабильность имеет первостепенное значение при попытках достижения внутриклеточных записей. Это особенно верно в естественных условиях, где мотонейронов может двигаться под влиянием кровяного давления, дыхания и мышц. Даже если это невозможно гарантировать отличную устойчивость, наша процедура позволяет стабильной записи мотонейронов в течение десяти минут или больше. Это достигается за счет комбинации четырех зажимов иммобилизацию позвоночника и костей ног. Два зажима расположены как можно ближе от ламинэктомия сайт для иммобилизации спинного мозга в этой области. Мы обнаружили, что сокращение длины спинного мозга между двумя зажимами, а также оказывает немногонапряжение на костях при условии очень хорошей стабилизацией, как мы смогли сохранить внутриклеточных записей в течение нескольких часов в парализованных животных ^5. Тем не менее, в данном случае, животное не парализовало, и мышцы могут свободно контракта, особенно при стимуляции седалищного нерва. Это причина, почему мы стабилизировать целый скелет ноги с помощью двух зажимов, один на уровне крестца, иммобилизации целом бедра и, следовательно, предотвращение мышечных сокращений от передаются на позвоночник, и один на лодыжке, чтобы обездвижить ногу на 90 °.

Используя эту технику, можно определить физиологические типа мотонейрона основана на силе профиль его блок двигателя ^13. Мотонейронов могут быть классифицированы как медленно или быстро в зависимости от их сокращения времени дергаться, а в Fatigable или усталости устойчивостью на основе их способности поддерживать данное силы во время повторной стимуляции. Таким образом, этот препарат полоде определенное преимущество перед препаратами в пробирке. В в пробирке условия, спинного мозга извлекаются из тела животного и помещают в чашку или целые или нарезанные. Из-за слоя миелина окружающих серого вещества, надлежащего оксигенации может быть получено только у новорожденных животных, где миелинизации не полный ^14. Последние технические достижения позволили записей мотонейронов спинного мозга у взрослых ^15-17 ломтиков, однако, такой подход не решит основной недостаток в пробирке записи, которая является то, что нет никакого способа для определения физиологических типов записанных мотонейрона (S, FR, или FF, или даже альфа по сравнению с гамма), и заставить экспериментатор в бассейне вместе с записями мотонейронов, что по своей природе разные, с точки зрения функции, электрофизиологические свойства, а содержание белка (см. Мануэль и Zytnicki, 2011 ¹⁸ для обзора различных видов мотонейронов).

в естественных условиях может быть выполнена в генетически модифицированных животных для изучения непосредственного воздействия этого специфического изменения на функции опорно-двигательного аппарата: производить силу. Этот препарат также является очень перспективным для изучения нейродегенеративных заболеваний человека, как боковой амиотрофический склероз (ALS) или спинальной мышечной атрофией (СМА). Генетические модели действительно были получены, копирующих чертой симптомы этих заболеваний ^10,11. Новый препарат описано здесь открывается возможность изучения роли нервно-мышечного соединения при этих заболеваниях, проверяя поведение мотонейронов и мышечных волокон (как самостоятельно, так и вместе) в ходе прогрессирования заболевания. Недавно две независимые группы смогли разработать децеребрированных в естественных условиях подготовки мышь, которая проявляет спонтанной локомоции или фиктивногопередвижения ^19,20. Если вид стабильность записи, которые мы наблюдаем используя процедуру, описанную здесь может быть достигнут после децеребрации, это станет мощным инструментом для изучения не только мотонейроны, но и всех предварительно двигателя спинного схемах участвуют в формировании опорно-двигательного ритма .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G