Samtidig Intracellulär inspelning av en Lumbar Motoneuron och styrkans Producerad av dess motor enhet i vuxen mus Published: December 5, 2012 doi: 10.3791/4312

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Marin Manuel¹, C.J. Heckman¹

¹Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Summary

Denna nya metod gör det möjligt att samtidig intracellulära inspelning av en enda vuxen mus motoneuron och mätning av den kraft som produceras av dess muskelfibrer. Den kombinerade undersökningen av de elektriska och mekaniska egenskaperna hos motorenheter i normala och genetiskt modifierade djur är ett genombrott för studiet av det neuromuskulära systemet.

Abstract

Spinal motoneuron har länge varit en bra modell för att studera neural funktion eftersom det är en neuron i det centrala nervsystemet med de unika egenskaperna hos (1) med lätthet identifierbara mål (muskelfibrerna) och därför har en mycket välkänd funktion (för att kontrollera muskelkontraktion), (2) är den konvergerande målet för många spinal och fallande nätverk, därav namnet "slutlig gemensam väg", och (3) med en stor soma som gör det möjligt att penetrera dem med skarpa intracellulära elektroder . Dessutom, när studerats in vivo, är det möjligt att spela samtidigt den elektriska aktiviteten hos motoneuroner och den kraft som utvecklats av deras muskler mål. Utföra intracellulära inspelningar av motoneuroner in vivo därför sätta experimentalist i den unika positionen att kunna studera på samma gång, alla fack i "motorenheten" (namnet på den motoneuron, dess axon ochmuskelfibrerna det innerverar ^1): input inkräkta på motoneuron de elektrofysiologiska egenskaper motoneuron, och effekterna av dessa egenskaper på den fysiologiska funktionen av motoneuroner, dvs den kraft som produceras av dess motorenhet. Emellertid är denna metod mycket utmanande eftersom preparatet inte kan vara förlamade och därmed den mekaniska stabiliteten för den intracellulära inspelningen reduceras. Sålunda har denna typ av experiment endast gjorts i katter och råttor. Emellertid kan studiet av spinal motorsystem göra en formidabel språng om det var möjligt att utföra liknande experiment i normala och genetiskt modifierade möss.

Av tekniska skäl har studier av spinal nätverk i möss mestadels begränsad till neonatal in vitro preparat där motoneuroner och spinal nätverk är omogen, är motoneuroner separerade från sina mål, och när studeras i skivor, MOtoneurons separeras från de flesta av sina insatsvaror. Tills nyligen hade endast ett fåtal grupper lyckats utföra intracellulära inspelningar av motoneuroner in vivo ^2-4, inklusive vår grupp som publicerade ett nytt preparat som tillät oss att få mycket stabila inspelningar av motoneuroner in vivo i vuxna möss ^5,6. Men dessa inspelningar som erhållits i förlamade djur, dvs utan möjlighet att spela in kraften ut dessa motoneuroner. Här presenterar vi en förlängning av denna ursprungliga beredningen som vi kunde få samtidiga inspelningar av elektrofysiologiska egenskaper motoneuroner och kraften som utvecklats av deras motorenhet. Detta är ett viktigt resultat, eftersom det tillåter oss att identifiera olika typer av motoneuroner baserat på deras styrka profil och därmed avslöjar deras funktion. Tillsammans med genetiska modeller störande spinal segmentell kretsar ^7-9, eller reproducting humant disease ^10,11, förväntar vi denna teknik för att vara ett viktigt verktyg för att studera spinal motorsystem.

Protocol

1. Steg ett

Pre-anestesi medicin: 10-15 min före induktion av anestesi, injicera atropin (0,20 mg / kg) och methylprenidsolone (0,05 mg) subkutant för att förhindra salivering och ödem, respektive.

2. Steg två

Induktion av anestesi: injicera pentobarbitalnatrium (70 mg / kg) eller en blandning av ketamin / xylazin (100 mg / kg och 10 mg / kg, respektive) intraperitonealt. Låt musen går under tills ingen tå nypa reflex kan erhållas. Om anestesi verkar för ljus, komplettera med 1/4 av dosen.

3. Steg tre

* Obs: denna operation är en terminal förfarande.

När en kirurgisk plan av anestesi har uppnåtts, överföra musen på en upphöjd varm filt i liggande ställning.

1. Täck nosen av musen med en mask levererar ren o ₂ vid ett flöde kring 100 ml / min.
2. Raka också rätt bakben.
3. Vänd musen för ryggläge men vara noga med att lämna syrgasmasken på plats.

4. Steg fyra

Säkra musen på plats med suturer slinga runt benen och säkras vid de fyra hörnen av arbetsytan.

5. Steg fem

Sätt en temperatursond för att övervaka temperaturen mus kärnan. Justera värmefilt / lampa för att bibehålla kärntemperatur mellan 36 ° C och 38 ° C.

6. Trakeotomi och artificiell ventilation

1. Med hjälp av trubbiga saxar, göra ett snitt över luftstrupen och dra huden bort på båda sidor.
2. Med trubbiga pincett, riva sönder spottkörteln att exponera två tunna muskler (Sternohyoid) täcker luftstrupen.
3. Med hjälp av trubbiga pincett, separera två Muscles längs deras mediala separationen att avslöja luftstrupen.
4. Med hjälp av en Dumont 7 tång, skjut två längd 4,0 silke sutur enligt luftstrupen.
5. Gör ett snitt i luftstrupen mellan två brosk ringar men se till att inte helt avsnitt luftstrupen.
6. Sätt trakealröret ner i luftstrupen, och fäst den på båda sidor om införingsöppningen genom att binda suturerna över den. Den trakealtub är anslutet till en mus ventilator (SAR-830/AP, CWE Inc.) och en kapnograf (μcapstar, CWE Inc). Ventilatorn är ansluten, via en överensstämmelse påse, till en källa av ren O _2. Justera parametrarna för fläkten (andning 100-150 bpm, slutet tidalvolym 170-310 ul) så att musen inte kämpar mot artificiell ventilation och slutet av utandningen pCO ₂ är stabil mellan 4 och 5%.

7. Placering av de intravenösa linjer

1. Använda trubbig dissektion tekniker, exponera jugularven på ena sidan av halsen. På denna nivå, delar halsvenen i två stora stammar, de främre och bakre ansiktet vener.
2. Gör följande steg två gånger, som ett för var och en av dessa stammar:
   1. Använda Dumont 4 eller 5 tång, försiktigt separera ven från dess omgivande bindväv.
   2. Använda Dumont 7 tång, skjut två längd 6,0 ​​silke suturer under venen. separera dem så långt som möjligt längs längden av venen.
   3. Placera ett litet fartyg klämma på den proximala sidan av venen (sidan närmast hjärtat), och fästa den distala sidan av venen.
   4. Med mycket fina iris sax, göra en liten tvärgående snitt i venen, med stor omsorg att inte avsnitt venen helt.
   5. Sätt en förfylld 1FR kateter (premicath, Vygon) i öppningen, upp till fartyget klippet.
   6. Håll ven och katetern tillsammans i ett Dumont 4 tång, försiktigt bort fartyget klippet och tryck sedan katetern några more millimeter in i venen.
   7. Fästa katetern genom att binda den med båda suturer på båda sidor av insättningen.
3. En av katetrarna ansluts till en spruta eller en sprutpump för att injicera kompletterande doser av anestetika vid behov (vanligtvis varje 10-30 min). Den intravenösa dosen är antingen 6 mg / kg pentobarbitalnatrium eller 1250 40 | ig / kg / min av ketamin / xylazin ^12. Den andra katetern är ansluten till en sprutpump för en långsam intravenös infusion (50 | il / timme) av en 4% glukoslösning innehållande NaHCOs ₃ (1%) och plasmion (14%).

8. Stäng nackskinnet med nål och sutur och tillbaka musen för liggande

9. Dissektion av Hind-lem muskel och nerver

1. Med sax, göra ett snitt från toppen av låret till hälsenan. Separera huden från underliggande muskulatur och var noga med att inte skada blodkärlen. Bränna behov.
2. Försiktigt dissekera biceps femoris. Bränna / ligatur som behövs för att förhindra blödning. Biceps femoris kan avlägsnas helt eller bara tillbakalutad att exponera ischiasnerven och triceps surae muskler.
3. Dissekera ut Sural nerv.
4. Använda 8/0 silkestråd, binda upp den distala delen av den gemensamma PERONEAL nerv och skär distalt om knuten. Dissekera nerven hela vägen upp, så nära höften som möjligt.
5. Identifiera tibialnerven mellan de gemensamma peroneal och Sural nerver. Bland de olika grenarna av tibialnerven, identifiera de branscher innerverar triceps surae från grenarna som går djupare (hädanefter benämnd tibialnerven).
6. Använda 8/0 silketråd, knyta ihop alla grenar tibialnerven samtidigt intakt grenarna innerverar Triceps surae. Skär den tibialnerven distalt till knuten och dissekera nerven upp så långt som möjligt.
7. Täck hela bakben med en gasväv insupit med koksaltlösning för att förhindra uttorkning samtidigt fortsätter med nästa steg.

10. Laminektomi

1. Med hjälp av sax, göra ett snitt längs ryggraden. Separera huden från de underliggande musklerna.
2. Gör två snitt på vardera sidan av kotorna för att separera de subkutana musklerna. Sedan skär varje sena de muskler som fäster på sidan av kotorna på varje sida.
3. Använda trubbiga pincett och en fin kyrett, ta bort resten av muskeln på ryggsidan av kotorna runt ryggkotornas processer för att tydligt identifiera varje enskild kota.
4. Identifiera kotor T13 och L1. T13 är den sista ryggkotan att ha revben bifogas. Kotpelaren wsjuka immobiliseras med hjälp av Cunningham ryggmärgen vertebrala klämmor (Stoelting Co). Placera spinal klämmorna på vardera sidan av T13 och L1. Var noga med att inte komprimera ryggmärgen, men satte lite spänning i den längsgående axeln. Kontrollera att ryggraden är väl säkrad genom att trycka ner försiktigt med pincett.
5. Med fina rongeurs, ta bort spinal processer då lamellerna över T13 och L1, därigenom utsätta ryggmärgen.
6. Täck den exponerade ryggmärgen med små bitar av bomull eller spongel insupit med koksaltlösning för att förhindra uttorkning.
7. Placera en skräddarsydd plast bad ovanpå ryggen, som omger ryggmärgen. Säkra badet på plats med 4/0 silkestråd. Se till att badet är vattentätt genom att försegla den med Kwik-Cast tätningsmedel (WPI).
8. När Kwik-Cast har torkat, ta bort bomullen täcker ryggmärgen och fyll badet med mineralolja.
9. Använda Dumont 5 pincett och mycket fina iris sax, försiktigt dra i dura mateR som omger ryggmärgen och öppna den så långt som möjligt i båda riktning. Vik dura på varje sida av ryggmärgen.
10. Sänk den upphöjda plattform som musen ligger för att hålla den upphängd i ryggraden klämman.
11. Använd en annan vertebral klämma för att klämma en spinalutskott av den sakrala regionen att stödja det bakre området av djuret.
12. En tredje klämma används för att immobilisera den högra bakben och fotled, böjd vid en 90 ° vinkel vid knäet.

11. Hälsenan Dissektion

1. Med lem böjd vid 90 ° vid knäet och ankeln, bort gasväv täcker bakben området, och dissekera hälsenan fri från omgivande vävnad. Dissekera så mycket som möjligt Triceps surae från omgivande vävnad samt.
2. Skär senan av plantaris muskeln nära calcaneus, klipp den igen för att ta bort senan helt.
3. Med hjälp av en gängad nål, bifoga 6/0 silkestråd genom the hälsena och gör en trippel knut runt senan.
4. Placera kraftgivare nära knuten, skär den distala delen av senan och anslut den till kraftgivare med silkestråd.
5. Sätt två längder av tråd av rostfritt stål under fascian av Triceps surae muskler. Dessa trådar är anslutna till en extracellulär AC förstärkare för EMG inspelning.
6. Placera den gemensamma PERONEAL nerv och tibialnerven på två bipolära krok elektroder.
7. Placera Triceps surae nerven på katoden av en krok elektrod, med anoden vidröra en närliggande muskel.
8. Anslut alla stimulerande elektroderna till en isoleringsanläggningen.
9. Placera en boll elektrod på den dorsala ytan av ryggmärgen, ansluten till en extracellulär växelströmsförstärkaren att spela sladd dorsum potentialer. Placera en Ag / AgCl-referenselektrod i kontakt med en bakre muskel.

12. Steg Tolv

Stimulera Triceps surae nervmed användning av en 50 usek fyrkantspuls av ökande intensitet vid en låg frekvens (<1 Hz) tills maximal rycka amplitud observeras. Flytta långsamt kraftomvandlare att sträcka muskler samtidigt övervaka amplituden hos rycka svaret tills rycka amplituden når ett maximum.

13. Intracellulära Inspelningar av motoneuroner

Från denna punkt, är standard elektrofysiologiska tekniker som används för att framställa en intracellulär elektrod, penetrera en neuron i ryggmärgen och identifiera det som ett motoneuron.

1. Dra ett glas mikropipett till en ~ 1 um spets med en pipett avdragare (P-97 Mikropipett Avdragare, Sutter Instruments). Fyll elektroden med en KCl 3M lösning (resistansen hos elektroden 10-20 MQ).
2. Med hjälp av en micropositioner, driva mikropipett, ansluten till en intracellulär förstärkare (Axoclamp 2B, Axon Instruments) in i ryggmärgen. Övervaka det lokala fältet potentialer framkallas genom stimulering av earje nerv att lokalisera motor pool av triceps surae.
3. Försiktigt närma förmodade motoneuroner under övervakning av resistans mikroelektrod. När man trycker mot ett membran, ökar motståndet. Penetration kan ibland underlättas genom att använda "buzz" funktion intracellulära förstärkaren.

14. Eutanasi Procedur

Vid slutet av experimentet, är djuret avlivades genom en överdos av pentobarbital (210 mg / kg IV), följt av dekapitering.

Representative Results

Figur 1 visar hur man identifierar en motoneuron från Triceps surae gruppen efter penetration. Vid låg stimulering intensitet, kan bara en monosynaptiska EPSP observeras (Figur 1A). Vid högre intensitet, kan EPSP vara tillräckligt stor för att utlösa en "orthodromic" spik (Figur 1B). Vid ännu högre stimulans intensitet, visas en allt-eller-inget antidromic spik, med en kortare fördröjning än monosynaptiska EPSP (Figur 1C). Om tillräckligt ström injiceras genom mikroelektrod att utlösa en spik, kan en EMG-aktivitet registreras på muskeln efter en kort fördröjning, följt av en muskel rycka (figur 1D). Efter identifiering av motoneuron, kan dess elektrofysiologiska egenskaper karaktäriseras. Till exempel, figur 2 illustrerar hur den ingående resistansen kan mätas med användning av hyperpolarisering och depolariserande pulser av ström (figur 2A), och plottning variationerna i membranpotentialen mot den insprutade mängden ström (figur 2B).

De kontraktila egenskaper motorenheten kan också studeras med hjälp av olika protokoll för stimulering. Till exempel, kan den kraft-frekvensen relation erhållas genom injicering korta pulser av ström vid olika frekvenser i motoneuron (figur 3A). Vid steady state kraften kan därefter plottas mot frekvensen hos strömpulserna att avslöja en sigmoidal kraft-frekvenskurva (figur 3B).

Om anestesi är under kontroll, är det möjligt att spela in från en enda motorenhet för mer än 15 minuter. I denna tidsrymd bör det vara möjligt att köra ett stort utbud av protokoll för att karakterisera både motoneuron och sammandragande egenskaper muskelfibrer den innerverar.

/ 4312/4312fig1.jpg "/>
Figur 1. Exempel på förfarande för att identifiera en motoneuron. Paneler A till C tre successiva svar på en motoneuron till ett ökat elektrisk stimulering av ischiasnerven. Den vertikala streckade linjen indikerar tiden för stimuleringen. Varje panel är intracellulärt inspelade membranpotentialen (övre kurvan) och den afferenta volley registreras på ytan av ländmärgen (bottenspår). A. Vid en intensitet precis ovanför tröskelvärdet för rekrytering av grupp I afferenter (1,1 x T), ett EPSP syntes som svar på elektrisk stimulering. EPSP var monosynaptiska eftersom dess centrala latens, 0,4 msek (små vertikala streckade linjer), var för kort för en väg som omfattar mer än en synaps. B. Ökad stimulans intensitet (2,0 x T) ökade storleken på EPSP tills det var tillräckligt stor för att utlösa en orthodromic spik. C. När stimuleringen intensitet ökades ännu mer(2,1 x T), var axonet rekryteras, samt en antidromic aktionspotential dök med 1,2 msek latens med avseende på stimulering tiden. Givet en ledning längd 38mm, var axonal ledningshastighet 32 m / sek. D. När ström injiceras (nedre kurvan) till ett Triceps surae motoneuron (olika motoneuron än i AC), en aktionspotential kan framkallas i somat ( 2:a spår från botten). Denna aktionspotentialen färdas ner axonet, korsar neuromuskulär korsningen, och utlöser potentialer muskel åtgärder i muskelfibrerna innerveras av den inspelade motoneuron. Föreningen aktionspotential (andra spår uppifrån) kan registreras med hjälp av EMG elektroder. Den rycka kontraktion av muskelfibrer visas i den övre kurvan. Sammandragning tiden för motorenheten kan uppskattas från rycka svar mellan de två streckade vertikala linjer. Figur anpassad del från ref ^5.

Figur 2. Uppskattning av ingångsresistans på en motoneuron. A. Genomsnittlig svar på en rad strömpulser (nedre spår) som varar 500 msek och sträcker sig från -3 till +2 nA. Lägg märke till sag på spänningen svar motoneuron (fyllda pilen): spänningen snabbt nådde en topp (svart punkt) innan den stabiliserades på en lägre platå värde (svart fyrkant). Efter den aktuella pulsen har avslutats visas en återhämtning (tom pil). B. Rita av deformationen av spänningen (AV) vs intensiteten av den aktuella pulsen. Prickar har värderats till toppen av svaret, medan rutor har värderats till slutet av pulsen, som skildras av symbolerna på toppen av figur B1. Raka linjer är de bästa linjära anfall av den maximala känsligheten (streckad) och platån svar (streck-prickade). Sluttningarna av dessa linjer är toppen ingångsresistans och platån input resistans motoneuron, respektive. Figur anpassad från ref ^5.

Figur 3. . Karakterisering av kraft-frekvensen förhållandet av en motorenhet De tre fälten visar: på bottenspåret, indikerade strömpulser upprepade vid frekvensen på toppen av varje panel och som används för att framkalla aktionspotentialer i motoneuron, på den andra spåra från botten, membranpotentialen av motoneuron, visande aktionspotentialer vid frekvensen av pulserna, på den andra kurvan uppifrån, EMG aktivitet, på den översta kurvan den kraft som alstras av tåg av aktionspotentialen. Den nedre panelen visar sammanfattningen diagram över mängden kraft uppnås under de enskilda tågen plottas mot frekvensen av aktionspotentialer i varje tåg. Kurvan är sigmoidal.

Discussion

Framställningen som beskrivs här är det första som möjliggör, i vuxen mus, samtidig intracellulär inspelning av en lumbal motoneuron och mätning av den kraft som produceras av muskelfibrerna innerverade av dess axon.

På grund av den lilla storleken på djuret, kan de kirurgiska färdigheter som krävs för detta preparat vara utmanande att förvärva. Men när dessa färdigheter behärskas, kan hela operationen utföras i tre timmar, och djuren kan överleva i upp till 7 fler timmar efter slutet av det kirurgiska ingreppet för inspelningar. Framgången för denna teknik är i huvudsak beroende av ledningen på anestesi. Det är av avgörande betydelse att noggrant övervaka så många fysiologiska parametrar som möjligt (kärntemperaturen, pCO _2, hjärtfrekvens, etc.) och för att hålla dem är deras respektive fysiologiskt intervall. Varje avvikelse måste åtgärdas omedelbart till exempel genom att öka / minska strömmen till häta filt, justera parametrarna för andningsskydd, eller lägga till fler anestetika. Det är vår erfarenhet att det fysiologiska tillståndet av musen kan ta en överraskande snabb vändning till det sämre om uppmärksamhet inte betalas alltid till dessa parametrar.

Mekanisk stabilitet är av största vikt när man försöker uppnå intracellulära inspelningar. Detta gäller särskilt in vivo, där motoneuroner kan röra sig under inverkan av blodtrycket, andning, och muskelsammandragningar. Även om det är omöjligt att garantin perfekt stabilitet, tillåter vårt förfarande stabila inspelningar av motoneuroner för tio minuter eller mer. Detta uppnås genom en kombination av fyra klämmor immobilisera ryggraden och benen benet. Två klämmor är placerade så nära som möjligt från laminektomistället att immobilisera ryggmärgen i detta område. Vi fann att minska längden på ryggmärgen mellan de två klämmoma samt utövar en liten bit avspänning på benen som mycket god stabilisering, som vi kunde upprätthålla intracellulära inspelningar i flera timmar i förlamade djur ^5. I förevarande fall är djuret inte förlamad, och musklerna är fria att ingå avtal, särskilt när stimulera ischiasnerven. Detta är anledningen till att vi stabiliserar hela benet skelettet med två klämmor, en på korsbenet nivå immobilisera hela höften och därmed förhindra muskelsammandragningar från att överföras till ryggraden, och en vid vristen för att immobilisera ben i 90 ° vinkel.

Med denna teknik är det möjligt att identifiera den fysiologiska typen av en motoneuron baserad på den kraft profilen av dess motorenhet ^13. Motoneuroner kan klassificeras som långsamt eller snabbt baserat på deras rycka kontraktion tid och i Fatigable eller trötthet Resistent baserat på deras förmåga att upprätthålla en given kraft under repetitiva stimulering. Som sådan, denna beredning bestämdes en definitiv fördel över in vitro preparat. I in vitro-betingelser, är ryggmärgen extraheras från kroppen hos djuret och placerades i en skål antingen hela eller skivade. På grund av lagret av myelin kring den grå materia kan korrekt syresättning endast erhållas i nyfödda djur där myelinisering är inte komplett ^14. Nya tekniska utvecklingen har gjort det möjligt inspelningar av spinal motoneuroner hos vuxna skivor ^15-17, dock inte lindra detta tillvägagångssätt inte den stora nackdelen med in vitro inspelningar, vilket är att det finns inget sätt att identifiera den fysiologiska typen av inspelade motoneuron (S, FR eller FF, eller ens alfa vs gamma), och tvinga experimentalist att sammanföra inspelningar från motoneuroner som i sig är annorlunda när det gäller funktion, elektrofysiologiska egenskaper och proteininnehåll (se Manuel & Zytnicki, 2011 ¹⁸ för en översikt av de olika typerna av motoneuroner).

in vivo inspelningar utföras på genetiskt modifierade djur för att studera de direkta effekterna av denna specifika förändring på funktionen av motorns systemet: producera kraft. Denna beredning är också mycket lovande för studier av neurodegenerativa sjukdomar hos människor som amyotrofisk lateralskleros (ALS) eller spinal muskelatrofi (SMA). Genetiska modeller faktiskt har genererats att replikera kännetecknet symptom på dessa sjukdomar ^10,11. Den nya beredningen som beskrivs här öppnar för möjligheten att studera den roll som neuromuskulära korsningar i dessa sjukdomar genom att testa beteende motoneuroner och muskler fibrer (både självständigt och tillsammans) under sjukdomsförloppet. Nyligen var två oberoende grupper kan utveckla en decerebrated in vivo mus beredning som uppvisar spontan rörelse eller fiktivaförflyttning ^19,20. Om den typ av inspelning stabilitet som vi ser med det förfarande som beskrivs här kan uppnås efter decerebration skulle detta innebära en formidabel verktyg för att studera inte bara av motoneuroner, men av alla de i förväg motor spinal kretsar involverade i att generera rörelseapparaten rytm .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G