Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

זרימת cilia שנוצר נוזל בשלפוחיות של Kupffer (KV) שולטת דפוסים של שמאל וימין של עובר דג הזברה. כאן, אנו מתארים טכניקה לווסת תפקוד גן ספציפי בתאי KV. בנוסף, אנו מראים כיצד לספק חרוזי ניאון לKV לדמיין זרימת נוזל.

Abstract

איברים פנימיים כגון לב, מוח, מעיים ולפתח סימטריות שמאל ימין (LR) כי הם קריטיים עבור הפונקציות הרגילות שלהם 1. ריסים ניעתי מעורבים בהקמת LR אסימטריה בעוברי החולייתנים, כוללים עכבר, צפרדע, ודג זברה 2-6. "הריסים" הללו LR לייצר זרימת נוזל סימטרית שיש צורך לעורר סימטרי קטרי משומר (TGF-β superfamily) איתות מפל במזודרם צלחת הרוחב מהשמאל, שהוא חשב לספק מידע דפוסי LR לפיתוח איברים 7. לכן, כדי להבין את המנגנונים בבסיס דפוסי LR, זה חיוני לזיהוי גנים ששולטים בארגון של תאי ריסי LR, תנועתיות ואורך ריסי LR והיכולת שלהם לייצר תזרים חזק סימטרי.

בעובר דג הזברה, ריסי LR נמצאים בשלפוחית ​​של Kupffer (KV) 2,4,5. KV מורכב משכבה אחת של תאי האפיתל monociliatedשמצרפים לום מלא נוזל. מיפוי הגורל הראה כי KV נגזר מקבוצה של 20-30 ~ תאים המכונית תאי גב Forerunner (DFCs) שנודדים בשולי blastoderm הגבו במהלך שלבי epiboly 8,9. במהלך השלבים מוקדמים somite, אשכול DFCs ולהתמיין לתאי אפיתל ריסים כדי ליצור KV בtailbud של העובר 10,11. היכולת לזהות ולעקוב אחר DFCs-בשילוב עם שקיפות אופטית והתפתחות מהירה של עובר דג זברת דג הזברה KV-להפוך את מערכת מודל מצוינת ללמוד תאי ריסי LR.

מעניין, אבות של המשפחה של תאי DFC / KV לשמור גשרי cytoplasmic בין תא החלמון עד 4 לאחר הפרית שעה (hpf), ואילו גשרי cytoplasmic בין תא החלמון והתאים עובריים אחרים הקרוב לאחר 2 hpf 8. ניצול של גשרי cytoplasmic אלה, פתחו אסטרטגית הזרקת שלב ספציפית, כדי לספק morpholino oligonucleotides (MO) באופן בלעדי לDFCs ומציאת הפונקציה של גן מטרה בתאים 12 אלה. טכניקה זו יוצרת עוברי chimeric שבתפקוד הגן הוא הפיל אותי בשושלת DFC / KV פיתוח בהקשר של עובר פראי מסוג. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV, אנחנו מזריקים microbeads ניאון לKV הלום ותנועת חרוז שיא באמצעות videomicroscopy 2. זרימת נוזל בקלות ודמיין ניתן לכמת על ידי מעקב עקירת חרוז לאורך זמן.

הנה, באמצעות טכניקת במה הספציפית DFC ממוקד מציאת הגן וההזרקה של microbeads ניאון לKV לדמיין זרימה, אנו מציגים פרוטוקול המספק גישה יעילה כדי לאפיין את תפקידו של גן מסוים בזמן ההתפתחות ותפקוד KV.

Protocol

סקירה כללית של זריקות עובר דג זברת שלב ספציפיים

אנטיסנס morpholino (MO), אשר נקלטת על mRNA ממוקד ולשבש ביטוי חלבון שמהתמליל, נמצאות בשימוש נרחב במציאת גן (פסד-of-פונקציה) לימודים בדג הזברה 13,14. הגדרות גנים, LLC מציעות MOS שמתויגים עם או carboxyfluorescein (פולט הירוק פלואורסצנטי) או lissamine (פולט האדום פלואורסצנטי) כדי לזהות MO בעוברים הזריקו באמצעות מיקרוסקופ ניאון. באמצעות הזרקת MO לתוך תא החלמון בשלבים שונים של פיתוח דג זברה, זה אפשרי כדי לספק את MO לתאים ספציפיים של העובר (איורי 1 א-F). MO מוזרק לתוך החלמון בין 1-4 השלבים הסלולריים (0-1 hpf) נכנס כל התאים העובריים (איורים 1 א ', ד', ד ') באמצעות קשרים עם החלמון שנמשכים עד השלב 32-15 התאים כדי להקל על מציאה העולמית. MO מוזרק לתוך החלמון בmidblastשלבי אולא (2.5-3 hpf) יכולים להיכנס לאבות של DFCs (האיורים 1B, E, E ') הסביר דרך גשרי cytoplasmic 8 ותפקוד גן מציאה במיוחד בשושלת DFC / KV תא 12, בלי להיכנס לשושלות תאים עובריות אחרות ביותר . כשליטה חשובה לבחון האם תפקוד הגן נדרש בDFC / KV או גם בחלמון 12,16, אפשר גם להגביל את MO לתא החלמון ידי הזרקה בין שלבי epiboly כיפה-30% (~ 4.5 hpf) לאחר כל גשרי cytoplasmic נסגרו (תרשימי 1C, F, ו '). זריקות אלה היו בשימוש בשילוב לנתח תפקוד גן בתאי DFC / KV 17-24. כדי להעריך את זרימת נוזל בKV, microbeads ניאון הם מוזרקים לתוך KV הלום בין 6-10 שלבי somite (12-14 hpf) ולאחר מכן צלם באופן מיידי באמצעות videomicroscopy (תרשימי 1G-J). Microbeads זמין שפולטים פלואורסצנטי אדום או ירוק (או שניהם), כך שניתן להשתמש שוניםערוצים לתמונת הניאון microbeads ומו.

1. הזרקת שלב ספציפי של Morpholinos (MO)

הזרקה של MO לעוברי דג זברה כבר הוכיח בעבר 25,26. כאן, אנו מתארים בקצרה זריקות MO שלב ספציפיות. בעקבות כל הזריקות, עוברים מועברים לצלחת פטרי והודגרו ב 28.5 מעלות צלזיוס

  1. הזרקת MO גלובלית: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולטעון אותם לתוך צלחת הזרקה. טען MO ניאון למחט נימים ולעגן את המחט על microinjector (למשל הרווארד Apparatus PLI-90 פיקו מזרק). לשבור את קצה המחט ולהתאים את הגדרות הזרקה (לחץ ו / או שעה) כדי ליצור טיפת הזרקה שיש נפח של 1 nl כמתואר 25,26. שימוש stereomicroscope לנתח, להזריק 1 nl של MO בחלמון (איור 1 א) של ≥ 50 עוברים לניסוי. לעבוד במהירות כדי להשלים את הזריקות על ידי אייל 4-התאדואר.
  2. DFC ממוקד הזרקת MO: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס כאשר העוברים הגיעו לשלב 256-התא (~ 2.5 hpf), לטעון אותם במהירות אל תוך צלחת הזרקה ואז מזריק 1 nl של הניאון MO בחלמון של ≥ 100 עוברים בין שלבי 256-תא והתא 1000 (איור 1B).
  3. זריקת חלמון ממוקד-MO: איסוף עוברים מייד לאחר הפריה ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס בשלב הכיפה (~ 4 hpf), לטעון את העוברים לתוך צלחת הזרקה ואז מזריק 1 nl של הניאון MO בחלמון של ≥ 100 עוברים בין הכיפה ושלבי epiboly 30% (התרשים 1C).

2. בחירת עוברים הזריקו לניתוח

  1. כאשר הזריק MO עוברים מגיעים לשלב 75%-epiboly (8 hpf), להסיר עוברים מופרים ומתים, ואז עובר מסך חיים תחת מיקרוסקופ לנתח ניאון לחלוקת MO הניאון. אז allow נבחר עוברים להתפתח ב28.5 ° C.
    1. לMO זריקות עולמיות, בחר עוברים שפלואורסצנטי מופצים באופן שווה לאורך כל התאים העובריים (1D איור; 2A איור).
    2. לDFC ממוקד MO זריקות, בחר עוברים בי הניאון MO יש המתפרש על פני החלמון ונראה מרוכז בשולי blastoderm הגבו (DFCs) (האיור 1E; התרשים 2B). בשלב זה, זה יכול להיות קשה לדמיין DFCs ניאון בשל פלואורסצנטי הבהיר בחלמון הבסיסי. תשמרו על עצמך שלא לכלול בעוברים שMO הניאון כבר שולב תאים עובריים שונים מDFCs או נשאר מצטבר באזור ההזרקה (האיור 2D).
    3. לחלמון ממוקד MO זריקות, בחר עוברים בי MO פלואורסצנטי מופץ באופן שווה בחלמון ולא נצפה בכל תאים עובריים (האיור 1F; האיור 2C). שוב, הסר עוברים בי MO הניאון נשארמקובצת באזור ההזרקה.
  2. בין שלבי 2-4-somite (~ 11 hpf), עוברי מסך פעם שנייה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות הגדלה גבוהה יותר. לאחר מכן, הנח עוברים נבחרים להתפתח ב28.5 מעלות צלזיוס
    1. לזריקות MO הגלובליות, להבטיח עוברים נבחרים יש MO פלואורסצנטי מופץ באופן שווה KV וכל התאים העובריים (1D איור '; 2E איור).
    2. לDFC ממוקד MO זריקות, בחר בקפידה עוברים שפלואורסצנטי MO רק בתאי KV והחלמון (האיור 1E '). עוברים מהונדסים שמביע GFP בתאי KV, כגון Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, יכול לסייע בזיהוי של עוברים בי MO נמסר בהצלחה לתאי KV (האיור 2F). השלך עוברים בעלי MO פלואורסצנטי בתאים עובריים שתאי KV אחרים.
    3. לחלמון ממוקד MO זריקות, בחר עוברים שפלואורסצנטי MO באופן בלעדי בחלמון (איור 1F ': איור2G).

3. עוברי הרכבה לנתח את זרימת נוזל בKV

  1. כדי לנתח את זרימת נוזל סימטרית בKV העולמי MO, DFC הממוקד MO או חלמון במיקוד MO עוברים מוזרקים, בזהירות dechorionate ~ 20 עוברים בין 4-6 שלבי somite (~ 11-12 hpf) עם מלקחיים חדים.
  2. הכן 50 מ"ל של 1% agarose נקודת התכה נמוכה וaliquot לתוך 5 מיליליטר צינורות להישמר כנוזל באמבט יבש על 42 ° C.
  3. העברה עוברת אחד לשקופית זכוכית דיכאון (ציוד מדעי המאוחד, Inc) ולהסיר כמה שיותר המים ככל האפשר. לשתק את העובר על ידי ההוספה מספיק חם 1% agarose נקודת התכה נמוכה, רק כדי לכסות את העובר (יותר מדי agarose יכול להפריע להדמיה שלאחר מכן). כagarose מתמצק, להשתמש במלקחיים כדי למקם את העובר באופן שKV פונה כלפי מעלה (תצוגה הגבתה) (איור 1H). הר 10 עוברים עם עובר אחד לכל שקופית. לעבוד במהירות כדי להבטיח את כל הזריקות בשלב הבא הן Completed ידי שלב 10 somite (14 hpf).

4. הזרקה של microbeads פלורסנט לתוך KV

  1. דלל Fluoresbrite Multifuorescent 0.5 מיקרון הקוטר microspheres (Polysciences, Inc) ל1:50 במים סטריליים בצינור 1.5 מ"ל אפנדורף.
  2. מערבב 1:50 דילול microbeads ביסודיות על ידי קשה על הצינור ולטעון 3 μl למחט נימים. שימוש באותה microinjector משמש לMO זריקות (למשל הרווארד Apparatus PLI-90 פיקו מזרק), לשבור את קצה המחט עם מלקחיים ולהתאים את הגדרות ההזרקה לייצר הקטנה ביותר האפשרית (<0.5 NL) טיפת הזרקה.
  3. תחת מיקרוסקופ לנתח, ליישר את המחט עם לום KV של העובר המורכב הראשון. הכנס את המחט לתוך הלום ולהזריק נפח קטן (<0.5 NL) של חרוזים (האיור 1G). קצה מחט קטן ונפח הזרקה קטן הם קריטיים כדי למנוע KV המזיק.
  4. הזרק את כל העוברים רכובים. ברגע שעובר כבר injecteד, ירידה של מים סטריליים ניתן להוסיף על גבי agarose כדי למנוע ממנו להתייבש. במהלך הזריקות, החרוזים לעתים קרובות לחסום את פתיחת המחט. זה דורש שובר-קצה המחט והתאמת עוצמת קול ההזרקה על ידי ויסות לחץ או הגדרת זמן של מנגנון microinjection. החלף את המחט, אם זה הופך בוטה מספיק כדי לגרום לניזק משמעותי בעת ההזרקה.
  5. מסך העוברים המוזרקים למסירה מוצלחת של חרוזים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתחם זקוף (למשל Zeiss AxioImager M1) באמצעות 20X אובייקטיבי. ראשית, לקבוע אם מבנה KV הוא ללא פגע באמצעות brightfield תאורה (איור 1J), ולאחר מכן להשתמש פלואורסצנטי כדי לבחון את החרוזים. בחר עוברים בי חרוזים נמצאים ונע בתוך חלל KV. השלך עוברים עם ניזק KV או אין חרוזים צפים בKV. זה קל לפספס KV ולספק חרוזים לרקמות סמוכות או חלמון הבסיסי. גם אם ייכשל, ההר anoTher 10 עוברים וחזרו על תהליך ההזרקה.

5. הדמיה וניתוח של זרימת נוזל KV

  1. עבור כל עובר שנבחר עם חרוזים בתוך KV, להוסיף טיפה של מים סטריליים כדי לכסות agarose ולאחר מכן להתבונן KV תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם הזקוף באמצעות אובייקטיבי טבילת מי 63X (איור 1 ט). לחלופין, ניתן ליישם coverslip לשימוש עם מטרות שאינן מי טבילה ו / או מיקרוסקופים הפוכים.
  2. שימוש במצלמה במהירות גבוהה רכובה על המיקרוסקופ (למשל Zeiss AxioCamHSm) כדי להקליט סרט 10 שניות. להקליט שני החרוזים באמצעות ערוץ הניאון (כ 70 מסגרות / שני) ולום KV באמצעות brightfield או לעומת פער התערבות (DIC) ערוץ.
  3. כדי להמחיש את כל התנועות החרוזות לאורך זמן, לייבא את הסרט של חרוזי ניאון לImageJ תוכנה (להורדה בחינם בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/)nd ליצור הקרנה מרבית של כל אותות הניאון בסרט. כדי לבצע את ההקרנה המרבית בImageJ, לחץ על "תמונה → סטאקס → Z פרויקט." בחלון "Z הפרויקט", יקרין כל הפרוסות עם סוג ההקרנה של "מקס עצמה". תמונה זו יכולה להיות על גבי תמונת דסק KV שבחרוזים היו הדמיה (איורי 3A-B).
  4. התנועות של חרוזים בודדים ניתנות למעקב באמצעות ImageJ. תוסף ("מעקב ידני") ניתן להוריד בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html. פתח את סרט חרוזי הניאון בImageJ ולהפעיל את פונקציית המעקב הידנית. בחלון של מעקב ידני, לבדוק פרמטרים "מופע" ופרמטרי קלט ל" מרווחי זמן "ו" כיול X / Y ". בחר ידני חרוזים שנותרו במישור המוקד של הסרט ל≥ 50 מסגרות ולאחר מכן לעקוב אחר ≥ 5 חרוזים לעובר. הנתיב ואת המהירות של כל חרוז נוצר על ידי התוכנת דואר (איורים 3 תקליטורים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זריקות MO שלב ספציפיים לספק גישה שימושית לניתוח תפקוד גן בתאים מסוימים של העובר. איור 1 מציג תרשים זרימה של אסטרטגיות ההזרקה משמשות לבדיקת תפקוד גן בתאי DFC / KV ואיך להציג את חרוזי ניאון כדי להמחיש את זרימת נוזל בKV. חלוקת MO ניאון בעוברים מוצלחים שלב ספציפיים הזריקו מוצגת באופן סכמטי דמויות 1D-F ובעוברים חיים באיור 2. הזרקת MO לא מוצלחת, שבו נשאר MO מצטבר בתא החלמון, מוצג באיור 2 ד.

הוזרק בהצלחה בעוברים בנבחר על בסיס הלוקליזציה של ניאון MO-יכול להיות מותקנת ב4-6 שלבי somite למסירה של microbeads ניאון לKV הלום (תרשימי 1G-H) כדי לנתח את זרימת נוזל. Videomicroscopy משמש להקלטת תנועות חרוזות בKV (איורים 1 ט-J), אשר ניתן לנתח באופן איכותי (איורי 3A-B) או כמותית (איורי 3C-E) באמצעות תוכנת ImageJ. בעובר שליטה לזרימה תקינה, חרוזי מעקב נגד נתיבים שיכולים להיות דמיינו ידי הפיכת היטל מרבי של עמדות חרוזי ניאון לאורך הזמן (איור 3 א) או על ידי מעקב חרוזים בודדים לאורך זמן (האיור 3C). כדי להדגים אובדן התזרים מתואם, שהזרקנו עוברים עם MO למציאת Rho קינאז 2b (Rock2b), אשר יש לנו הראה בעבר משבש את הזרימה 18. בעוברים הזריקו Rock2b MO, חרוזים לנוע באופן אקראי בKV (איורים 3 ב, ד). ImageJ תוכנה שמשה לחשב את המהירות של רצועות חרוזות בודדות. המהירות הממוצעת של 5 חרוזים מעוברי Rock2b MO שליטה ומוצגת באיור 3E.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
איור 1. סקירה כללית של MO זריקות שלב ספציפיים והזרקת microbead לKV. () הזרקה של הניאון MO (אדום) לתוך החלמון בשלב 1-התא להפצה הגלובלית של MO לאורך העובר. (ב) DFC ממוקד הזרקת MO בשלב 512-התא כדי לטעון MO לתוך תאי DFC / KV. (ג) חלמון ממוקד הזרקת MO בשלב 30% epiboly להגביל MO לחלמון. (DF ') ייצוג סכמטי של התפלגות הניאון MO (אדום) בעוברים מוזרקים בהצלחה בשלב 75% epiboly (D, E, F) ובשלב somite 6 (ד', ה ', ו') השלב הבא, זריקות ספציפיות. MO מצטבר במשפחה של תאי DFC / KV כאשר הוא מוזרק בשלב 512-התא (חיצים בE, E '), אבל לא כאשר הוא מוזרק ב30% epiboly (חיצים בF, ו'). (G) הזרקה של microbeads ניאון (ירוק) לתוך לום KV. (H) אבזרעובר רכוב erly עם KV (חץ) פונה כלפי מעלה להזרקת microbead. (אני) תנועת הדמית חרוזים בKV באמצעות מיקרוסקופ זקוף. (J) גדלה גבוהה של לום KV שלם הזריק microbeads. שלבים עובריים וציורי עובר מבוססים על שופט. 28.

איור 2
איור 2. בחירה עוברת בעקבות זריקות MO שלב ספציפיות. (AC) דוגמאות לעוברים נבחרים ב75% שלב epiboly (8 hpf) שבניאון MO (אדום) שלב גם בכל התאים העובריים לאחר הזרקת MO העולמית (), שמתפוגגים בחלמון וDFCs (חץ) בעקבות DFC הזרקה ממוקדת MO (B) או נשארה בחלמון בעקבות MO זריקת חלמון ממוקדת (C). (ד) דוגמה לעובר נכלל בי Fluorescent MO מצטבר באזור ההזרקה. (לדוגמה) דוגמאות להפצת ניאון MO (אדום) בעוברים שנבחרו בשלב 4-somite (11.5 hpf). תמונות DIC לזהות KV לומן (חץ) במהונדס Tg (Dusp6: d2EGFP) עוברים שמביעים GFP בתאי KV 27. בעובר המוזרק הגלובלי MO, MO נצפה בKV וכל התאים הסמוכים (E). בעובר DFC הממוקד MO המוזרק, מיזורי שיתוף מקומי-עם GFP ברוב תאי KV והייתה נוכחת גם בבסיס גרעיני חלמון (F). בעובר חלמון הממוקד, מיזורי נמצאה באופן בלעדי בגרעיני חלמון (G).

איור 3
איור 3. ניתוחים כמותיים ואיכותיים של זרימת נוזל בKV. (AB) לניתוח איכותי של זרימה, הקרנה מרבית של תנועת 10 שניות סרט מראה כל fluorescmicrobeads ent הוזרק לתוך KV כבר על גבי תמונת דסק KV הלום בשליטת MO העולמי () או Rock2b MO (ב) העובר מוזרק. (ספירה) כדי לכמת את הזרימה, תנועה של microbeads הבודד (n = 5) הייתה תחת מעקב של עובר שליטה (C) ועובר מוזרק MO Rock2b (ד ') ומשמש לחישוב מהירות ממוצעת חרוז (E). חוגים (CD) מקורבי גבולות KV לומן. ברי שגיאה (E) מייצגים סטיית תקן אחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שימוש בזריקות שלב ספציפיים כדי למקד MO למשפחה של תאי DFC / KV הוא גישה שימושית ללמוד תא האוטונומיה של תפקוד גן ולהימנע פנוטיפים pleiotropic נגרמים על ידי מציאת גנים העולמית. עם זאת, הזריקות האלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית. הזרקה של MO בין שלבי 256-תא והתא 1000 עלולה לגרום לשלוש תוצאות אפשריות: 1) MO נשאר מצטבר באזור הזריקה, 2) עובר דיפוזיה MO ברחבי החלמון ונכנס לתאים DFC / KV או 3) MO מתפשט בכל החלמון ונכנס לתאים DFC / KV ותאים עובריים אחרים. לכן, בחירה בעוברים שMO עבר בלעדי לתאי DFC / KV היא צעד מפתח בניסוי זה. חשוב לציין כי MO יכול לטעון אל כל תאי DFC / KV אבל לעתים קרובות נכנס רק קבוצת משנה של תאים אלה 10. הסיבות שבבסיס פסיפס זה מיקוד עדיין אינן ברורות, אך עשוי לשקף השתנות באופן יעיל את מהלכי MO באמצעות חלמון ו / או העיתוי של סגירת indגשרי ividual בין אבות DFC החלמון ו. לא נמצאו לנו תנאים שגידול מיקוד יעיל, אלא הסתמך על בחירת עוברים שברוב תאי KV לקחו את MO. שיעור ההצלחה ליצירת עוברים עם MO ברוב תאי DFC / KV הוא בדרך כלל 20-30% ~, אבל זה יכול להיות די משתנה מיום ליום. מסיבה זו, אנו ממליצים הזרקה כעוברים רבים ככל האפשר (≥ 100), ולאחר מכן בחירה בעוברים שההפצה המתאימה של הניאון morpholino בזהירות.

ניסויי בקרה חיוניים לפרש את התוצאות של זריקות DFC במיקוד. אי התאמה או שלילי MO MO שליטה הסטנדרטית (מתוך כלי ג'ין, LLC) צריך לשמש כדי לשלוט על תופעות שאינן ספציפיות. בנוסף, מאז זריקות DFC ממוקדים לספק MO לשניהם את החלמון והמשפחה של תאי DFC / KV (האיור 2F), חשוב לקבוע אם פנוטיפים בעוברים האלה הם תוצאה מאובדן כיף גןction בתאי DFC / KV או בתא החלמון. השוואה בין פנוטיפים בעוברים DFC ממוקדים עם עוברי חלמון במיקוד (איורי 2F-G) תזהה DFC / KV תא ספציפי משפיעה. כמובן, חלק מהגנים יכולים לתפקד בשני תאי DFC / KV ואת החלמון 16. למרות שאנו מתמקדים בניתוח אובדן-of-פונקצית MO בתיווך כאן, ניתן להשתמש בטכניקת הזרקת DFC הממוקדת וניסויי שליטה הקשורים להערכת רווח-of-פונקציה על ידי הזרקת mRNA הסינטטי לביטוי יתר של חלבון מסוים בDFC / KV שושלת 17,22,24,29. adaption חכם אחד של גישה זו משמש DFC ממוקד זריקות mRNA להציל מציאת MO העולמית רק בתאי DFC / 30 KV. עם זאת, יש לציין כי לא כל mRNAs הזריק בתוצאת אופן זה בביטוי של החלבון המקודד בDFCs ותאי KV, ובקרות חשובות צריך להיות כלול כדי להעריך את רמת ביטוי חלבון וההפצה.

הפצה מוצלחת של microbeadשל ללום KV להעריך זרימה סימטרית תלוי בהזרקת החרוזים בשלבים אופטימליים במהלך ההתפתחות המהירה של איבר KV החולף. אנחנו מתחילים עוברי הרכבה בשלבי 4-6 somite (~ 12 hpf) ואז מזריקים לתוך microbeads KV עד שלב somite 10 (14 hpf). לפני 4 שלב somite, לומן הוא לעתים קרובות קטן מדי כדי להזריק, ובשלבים מאוחרים יותר (> 10 somites) הזריקה הופכת להיות קשה בשל KV לנוע עמוק יותר לתוך העובר. מגבלה אחת של שיטה זו היא שמחייבת לום KV להתרחב לגודל שניתן להזריק בהצלחה עם microbeads. במקרים בם MO מציאה של גן מסוים קשה משבשת ארגון KV ו / או מקטינה את גודל KV לומן (שנסקר בנ"צ. 31) זה יהיה קשה, אם לא בלתי אפשרי, לזרימת assay שימוש בגישה זו.

בעת ההכנה להזרקה של עוברי microbeads לKV, חשוב לעגן את העובר ישר לאורך הציר העוברי עם KV פונה כלפי מעלה (איור 1H), כעמדת עובר יכול להשפיע על הזווית שהמחט נכנסת KV והזווית של חרוזי הדמיה בKV. כמו כן, חשוב להשתמש במחט זריקה בקוטר קטן ונפח הזרקה קטן של microbeads להימנע KV המזיק. אנו ממליצים להתאמן לפתח שבץ הזרקה חלקה להכניס את המחט לתוך KV, לשחרר את החרוזים ולאחר מכן חוזר בי את המחט במהירות מהעובר. כאשר תנאים אופטימליים, אנו מסוגלים לספק בהצלחה microbeads ל ~ 50% (לדוגמא n = 5/10) של העוברים המוזרקים.

לסיכום, זריקות שלב ספציפיים MO חזותי של microbeads בKV מספקים הזדמנות לבחון את התפקוד של גני מועמדים בתאי ריסי LR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו מודים על תמיכת פיונה פולי מעבדה מצוינת וטיפול דג זברה. עבודה זו נתמכה על מלגת AHA predoctoral לGW (11PRE5730027) ומענקי NHLBI לHJY (R01HL66292) ורשות לפיתוח ירושלים (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 73 גנטיקה ביולוגיה תאית מדעי המוח ביולוגיה מולקולרית Bioengineering ביופיזיקה צילה דג זברה, טכניקות Gene מציאה שמאל ימין אסימטריה ריסים השלפוחית ​​של Kupffer מודל חיה
ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter