Summary
وقد استخدمت الفئران المعدلة وراثيا أو ناقلات فيروسية لزيادة التعبير البروتين داخل الرئة. ومع ذلك، هذه التقنيات هي مضيعة للوقت، مما يشكل تحديا تقنيا ويكون لها آثار خارج الهدف التي يمكن أن نخلط النتائج. يستخدم لدينا بروتوكول ترنسفكأيشن البروتين الدهني مقرها كاشف ترنسفكأيشن وmicrosprayer متناهية الصغر لتقديم موحد البروتين النشط لخلايا الرئة.
Abstract
زيادة بروتين تعبير تمكن الباحثون لفهم أفضل لدور وظيفي من أن البروتين في تنظيم العمليات البيولوجية الرئيسية 1. في الرئة، وقد تحقق هذا عادة من خلال النهج الوراثية التي تستخدم الفئران المعدلة وراثيا 2،3 أو ناقلات فيروسية أو غير الفيروسية التي ترفع مستويات البروتين عن طريق زيادة التعبير الجيني 4. الفئران المعدلة وراثيا هي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا لتوليد والإدراج عشوائية من التحوير أو المزمنة التعبير الجيني يمكن أن يغير تطوير رئة طبيعية وبالتالي تحد من فائدة من طراز 5. في حين المعدلة وراثيا المشروطة تجنب المشاكل المرتبطة التعبير الجيني المزمن 6، والتي تسيطر عليها التتراسيكلين transactivator (rtTA) الفئران العكسي، والتي تستخدم لتوليد التعبير الشرطي، وتطوير عفوية الهواء توسيع مساحة 7. كما هو الحال مع البذور المعدلة وراثيا، واستخدام ناقلات فيروسية وغير فيروسية غير مكلفة 8 ويمكن أن تثير جرعة-Dالاستجابات الالتهابية ependent اربكت النتائج 9 وتعيق التعبير 10. وعلاوة على ذلك، فإن فعالية من الجرعات المتكررة تقتصر طريق تعزيز الاستجابات المناعية لمكافحة ناقلات 11،12. باحثون يطورون الغدة المرتبطة الفيروسي (AAV) النواقل التي تثير أقل التهاب ويكون التعبير أطول داخل الرئة 13.
باستخدام β-غالاكتوزيداز، فإننا نقدم وسيلة لزيادة بسرعة وفعالية التعبير البروتين داخل الرئة باستخدام تقنية ترنسفكأيشن البروتين مباشرة. هذا البروتوكول يمزج كمية محددة من البروتين النقي مع 20 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس (الموالية للJECT، بيرس بيو) للسماح للتغلغل في أنسجة الرئة نفسها. ثم يتم حقن خليط من البروتين الليبوسومال إلى الرئتين من الفئران عن طريق القصبة الهوائية باستخدام microsprayer (بنسلفانيا القرن، فيلادلفيا، PA). وmicrosprayer يولد سحابة غرامة من الهباء الجوي السائل في جميع أنحاء الرئتين. باستخدام تقنيةلقد أثبتنا ترسب موحدة من البروتين حقن في جميع أنحاء الشعب الهوائية والحويصلات الهوائية من الفئران 14. تقنية ترنسفكأيشن الدهون يسمح باستخدام كمية صغيرة من البروتين لتحقيق تأثير. وهذا يحد من الاستجابة الالتهابية التي لولاها أن استفزاز من قبل الإدارة نسبة عالية من البروتين. في الواقع، وذلك باستخدام هذه التقنية نشرنا أن كنا قادرين على زيادة كبيرة في النشاط PP2A في الرئة دون أن يؤثر الرئة الخلوية غسل 15. كان الرئة الخلوية غسل المتخذة 24 ساعة بعد التحدي مماثلة لعناصر التحكم (27 ± 4 التحكم مقابل 31 ± 5 الزلال transfected؛ N = 6 لكل مجموعة). وعلاوة على ذلك، لأنه يزيد مستويات البروتين دون إحداث تغييرات التنموية الرئة أو التغييرات المعمارية التي يمكن أن تحدث في النماذج المعدلة وراثيا. ومع ذلك، قد الحاجة إلى الإدارات المتكررة جعل هذه التقنية أقل مواتاة للدراسات فحص آثار زيادات طويلة الأجل في تعبير البروتين. وهذا سيكون خصوصا تروه للبروتينات مع قصيرة نصف حياة.
Protocol
1. إعداد البروتين كاشف ترنسفكأيشن
- حل الكاشف الموالية للJECT عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من الميثانول أو كلوروفورم إلى الأنبوب الذي يحتوي على الفيلم الجاف.
- دوامة لمدة 10-20 ثانية في سرعة قصوى.
- ماصة 20 ميكرولتر من كاشف الموالية للJECT في أنابيب microcentrifuge منفصلة.
- تتبخر المذيب عن طريق وضع أنابيب microcentrifuge تحتوي على الكاشف الموالية للJECT تحت غطاء تدفق الصفحي مدة لا تقل عن 6 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تكون جافة تماما. بدلا من ذلك، تجفيف كاشف الموالية للJECT باستخدام مجفف فراغ.
- تخزين الأنابيب في -20 درجة مئوية. فهي جيدة لمدة عام واحد في درجة الحرارة هذه.
2. إضافة البروتين إلى الكاشف الموالية للJECT
- ماصة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، تحتوي على 2.0 ميكروغرام من البروتين من الفائدة، في أنبوب يحتوي على 20 ميكرولتر من المجفف الموالية للJECT كاشف ترنسفكأيشن.
- بعد إضافة البروتين، مزيج الحل قبل vortexing في منخفضة و سرعةأو 3-5 ثانية يليه احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. إدارة داخل الرغامى من البروتين
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين / زيلازين (100 ملغ / كغ و 10 ملغم / كغم).
- بعد تحقيق التخدير، ويتم تعليق الفئران من القواطع العلوية باستخدام منصة مصممة خصيصا (الشكل 1).
- باستخدام ملقط وقصاصة ورق باعتبارها المنظار، يتم فتح البلعوم بحيث يمكن إدخال القسطرة (الشكل 2). الحبال الصوتية هي تصور عن طريق وضع مصدر الضوء ضد القصبة الهوائية من الفأرة.
- يتم حقن بروتين / مشروع خليط كاشف (50 ميكرولتر) من خلال القصبة الهوائية باستخدام بنسلفانيا القرن Microsprayer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للتدليل على فعالية تقنية لدينا استخدمنا microsprayer (بنسلفانيا القرن) لحقن القصبة الهوائية من الفئران مع 2 ميكروغرام من الماوس ألبومين (سيغما) الذائب في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي 20 ميكرولتر من المحترفين JECT كاشف ترنسفكأيشن. وتمت مقارنة الفئران التي عولجت الزلال مع الفئران التي عولجت بطريقة متطابقة مع 2 ميكروغرام من بروتين بيتا غالاكتوزيداز (بيرس BIO). بعد أربع وعشرين ساعة، والموت الرحيم الفئران وجرى تجهيز الرئتين للتحليل النسيجي. وقد أجريت المناعية للبيتا غالاكتوزيداز على الفورمالين أقسام أنسجة الرئة ثابت من الفئران التي عولجت الزلال وبيتا غالاكتوزيداز. حتى على مدار 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن البروتين، اكتشفنا تلطيخ مكثفة داخل الشعب الهوائية (الأسهم الكبيرة) من الفئران المعالجة بيتا غالاكتوزيداز ولكن ليس الفئران المعالجة الألبومين (الشكل 3A و3B).
_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
الشكل 1. لوضع الفئران للحقن داخل القصبة الهوائية، ومنصة خشبية شيدت يحتوي على المنحدر في زاوية 45 درجة من قاعدتها 16. يتم تعليق الفئران من القواطع عن طريق سلك المعدنية التي يتم تركيبها على اثنين من السنانير المعدن في الجزء العلوي من الطريق المنحدر. وأعادت اللسان بلطف مع ملقط ويتم استخدام مشبك الورق المنظار لفتح مجرى الهواء.
الشكل 2. بعد وضع مصدر الضوء على الرقبة، ويمكن الحنجرة يمكن تصور للحقن داخل القصبة الهوائية 16.
الشكل (3). أجريت immunostains β-غالاكتوزيداز على أقسام الرئة 4 ميكرون من حقن الفئران intratracheally مع 2 ميكروغرام منالزلال (A) أو β-غالاكتوزيداز (B). سهام تشير إلى تلطيخ β-غالاكتوزيداز داخل المجاري الهوائية. الصور هي في التكبير 40X. شريط النطاق = 100 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميزة هذه التقنية على الطرق الأخرى هو أنه ينتج زيادة في مستويات البروتين والنشاط داخل أنسجة الرئة نفسها. وعلاوة على ذلك، فإنه يخترق إلى أكثر المناطق البعيدة من الرئة في مقابل البقاء فقط داخل الشعب الهوائية. قمنا بقياس زيادة نشاط البروتين من injectate لدينا حتى بعد lavaging الشعب الهوائية مع المياه المالحة 15. تحليلات نشاط الأنسجة تشير إلى أن البروتين يدخل الخلايا ولا تبقى فقط في الفراغات الهوائية من الفأرة. وقد أكد هذا أيضا يدل المناعية تلطيخ منتشر لدينا بروتين حقن داخل الحويصلات الهوائية والشعب الهوائية من الفأرة (الشكل 3). الأهم من ذلك، هذا البروتوكول لا يثير التهاب الرئة أو التعبير البروتيني. وبالتالي، أي التغييرات التي تحدث بالفعل ويمكن أن يعزى لآثار من البروتين تديرها. عدم وجود استجابة التهابية يسمح لاستخدام الحقن المتكرر لدراسة الآثار على مدى ونجفترة R من الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (7R01HL098528-03) وجائزة FAMRI ومبتكر السريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
