Cellulær levedygtighed afhænger af rettidig og effektiv forvaltning af protein misfoldning. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at visualisere de forskellige potentielle skæbner en fejlfoldede protein: refoldning, nedbrydning eller binding i inklusioner. Vi demonstrerer brugen af en foldning sensor, Ubc9<sup> Ts</sup>, Til overvågning proteostasis og aggregering kvalitetskontrol i levende celler ved anvendelse af 4D-mikroskopi.
Et af de vigtigste opgaver for enhver levende celle er at opretholde korrekt foldning af nysyntetiserede proteiner i lyset af stadigt skiftende miljøforhold og et intracellulært miljø, der er tætpakkede, klæbrig, og farlige til protein stabilitet 1. Evnen til dynamisk balance proteinproduktion, foldning og nedbrydning kræver højt specialiseret kvalitetskontrol maskiner, hvis absolutte nødvendighed observeres bedst, når den ikke fungerer. Sygdomme som ALS, Alzheimers, Parkinsons, og visse former for cystisk fibrose har et direkte link til proteinfoldning kvalitetskontrol komponenter 2, og således at en fremtidig terapeutisk udvikling kræver en grundlæggende forståelse af de underliggende processer. Vores eksperimentelle udfordring er at forstå, hvordan celler integrerer skader signaler og montere reaktioner, der er skræddersyet til forskellige forhold.
Den primære grund til, at protein misfoldning repræsenterer en eksistentiel threved til cellen, er tilbøjelighed forkert foldede proteiner til aggregat, og dermed forårsager en global forstyrrelse af overfyldte og delikate intracellulær folde miljøet 1. Den sammenklappelige helbred, eller "proteostasis", af den cellulære proteom opretholdes, selv under tvang af befolkningens aldring, stress og oxidative skader, ved en koordineret indsats af forskellige mekanistiske enheder i et omfattende kvalitetskontrolsystem 3,4. En specialiseret maskineri af molekylære chaperoner kan binde non-native polypeptider og fremme deres folde ind i den native tilstand 1, målrette dem til nedbrydning af ubiquitin-proteasom system 5, eller henvise dem til beskyttende aggregering indeslutninger 6-9.
I eukaryoter, er den cytosoliske aggregation kvalitetskontrol belastning delt mellem to rum 8-10: den juxtanuclear kvalitetskontrol rum (JUNQ) og det uopløselige protein deponering (iPod) (fig. 1 – model).Proteiner, der ubiquitinerede af proteinfoldning kvalitetskontrol maskineri leveres til JUNQ, hvor de forarbejdes til nedbrydning af proteasomet. Fejlfoldede proteiner, der ikke ubiquitinerede er blevet omdirigeret til IPOD, hvor de aktivt aggregeres i et beskyttende rum.
Indtil dette punkt har den metodologiske paradigme af live-cell fluorescensmikroskopi stort set været at mærke proteiner og spore deres placeringer i cellen på særlige tidspunkter med og som regel i to dimensioner. Efterhånden som nye teknologier er begyndt at give eksperimentatorer hidtil uset adgang til submicron skala i levende celler, har den dynamiske arkitektur cytosolen kommer til syne som et nyt og udfordrende grænse for eksperimentel karakterisering. Vi præsenterer en fremgangsmåde til hurtig overvågning af 3D rumlige fordelinger af flere fluorescensmærkede proteiner i gæren cytosolen over tid. 3D timelapse (4D billeddannelse) er ikke blot en teknisk udfordring; rottehende, det fremmer også et dramatisk skift i den konceptuelle rammer, der anvendes til at analysere cellestruktur.
Vi benytter et cytosolisk foldning sensor protein i levende gær til at visualisere forskellige skæbner for fejlfoldede proteiner i cellulær aggregation kvalitetskontrol, ved hjælp af hurtig 4D fluorescerende billeddannelse. The temperaturfølsom mutant af Ubc9 protein 10-12 (Ubc9 ts) er yderst effektivt både som en sensor af cellulær proteostasis, og en fysiologisk model for sporing aggregation kvalitetskontrol. Som med de fleste ts-proteiner, er Ubc9 ts fuldt foldet og funktionelt ved permissive temperaturer som følge af aktive cellulære chaperoner. Over 30 ° C, eller når cellen vender misfoldning stress, Ubc9 ts misfolds og følger skæbnen for et nativt globulært protein, som er blevet fejlfoldede på grund af mutation, varmedenaturering, eller oxidativ skade. Ved at fusionere det til GFP eller andre fluoroforer, kan det spores i 3D, som den danner Stress Foci, eller er direttet op på JUNQ eller iPod.
Vores intuition om biokemiske processer stammer fra bordpladen forsøg, hvor et velblandet opløsning af reaktanter og produkter får lov til at nå ligevægt i et bæger. I en sådan indstilling, kan koncentrationen af en given kemisk stof udtrykkes som et enkelt tal, som er forholdet mellem en molær kvantitet af molekyler til en makroskopisk volumen. Meget af hvad vi ved om proteiners struktur og funktion stammer fra brug af metoder, der afspejler den klassiske, bulk reaktion billede: western blots, centrifugeringer og spektrofotometriske måling, der gennemføres på ekstrakter fra homogenater af hele populationer af celler.
Som den teknologi, vi bruger til at se på celler under forstørrelse forbedres med stormskridt, bliver det stadig tydeligere, at de betingelser, hvorunder de fleste biokemiske reaktioner finder sted in vivo kun bærer den mindste lighed med bestemmelserne i det klassiske bænk top scenario. Ikke alene er det indre af cella tætpakkede miljø, hvor fortrængning virkning markant påvirke aktiviteterne af forskellige reaktanter, er det også det modsatte omhyggeligt blandet. Dette forklarer den hyppige forskel mellem in vitro-og in vivo-effektiviteten af en lang række komplekse makromolekylære reaktioner.
Intetsteds er intuitioner stammer fra klassisk in vitro biokemiske eksperimenter mere tilbøjelige til at vildlede som i spørgsmål vedrørende den in vivo, forkert foldning, og aggregering af proteiner. Henviser til studier af proteinkemi, bulk reaktioner kan behandle spørgsmålet om foldning for et givet protein som en simpel ja eller nej spørgsmål, skal ethvert forsøg på at spore dynamikken i hele populationer af makromolekyler i en levende celle være følsomme over hele fordelingen af mulige konformationelle resultater tilgængelige for en polypeptidkæde, og især risikoen for misfoldning og aggregering. For eksempel kan vi undersøge en bulk celle lykompensere for et aggregerende protein ved western blotting, og bestemme, at proteinet er hovedsagelig uopløseligt eller ikke-ubiquitineret. Men i den levende celle en diskret subpopulation af proteinet, vanskelige at detektere, når gennemsnittet over mange celler, kan være opløselige og ubiquitineret i et bestemt segment, hvor den lokale koncentration af arterne er ekstremt høj. Sidstnævnte scenario kan have mere alvorlige konsekvenser for levedygtigheden af cellen end den større bulk-delpopulation. Endvidere henviser chaperoner vise en lang række pleiotrope adfærd og funktioner in vitro, bliver det mere tydeligt, at i cellen deres diskrete funktioner er rumligt og tidsmæssigt begrænset.
I trit med den nye paradigme for forståelsen biokemi, bliver koncentrationen et variabelt egenskab ved hver specifik nano-miljø i cellen, og de molekylære begivenheder, der ligger til grund biologiske processer skal analyseres, ikke blot i tid, men også i Space. 4D billeddannende fremgangsmåde præsenteres her muliggør følsom modellering af protein fejlfoldning i levende celler, selv om det kan anvendes til at undersøge en række andre biologiske processer, og hvordan de er reguleret i rum og tid, og efter ændringer i miljømæssige betingelser. I dette papir, vi bruger Ubc9 ts folde sensor, der effektivt demonstrerer de faser og muligheder for behandling med debut af proteinaggregering i cytosolen. Ud over at der illustrerer cellebiologien af aggregering kvalitetskontrol, kan denne fremgangsmåde anvendes som et effektivt værktøj til dechifrering virkningen af specifikke forstyrrelser eller genetiske mutationer på proteostasis (f.eks Ubc9 ts kan anvendes til at måle proteinfoldning stress som oxidation, ekspressionen af et toksisk aggregat, eller mutationer i kvalitetskontrol pathway).
4D billeddannelse er også afgørende for nøjagtigt at bestemme protein lokalisering eller colokalisering mellem to forskellige proteins, og til påvisning af fænomener, som måske være forbigående, men vigtige. For eksempel, især i en lille sfærisk organisme såsom gær kan det synes at være tilfældet, at en struktur eller aggregat har juxtanuclear lokalisering, mens 4D billeddannelse kan afsløre, at dette er blot en artefakt af vinklen for inspektion.
I eksemplet eksperiment vi her, viser vi anvendelse af en model misfoldet protein, Ubc9 ts, at følge aggregation kvalitetskontrol over tid og rum i cytosolen. Ved den permissive temperatur, er Ubc9 ts foldet og spredes i kernen og cytosol. Ved varmeinduceret misfoldning, i første omgang danner hurtigt spredende små samlede Stress Foci, der behandles for proteasomalaktivitet nedbrydning. Når proteasomet er delvis inhiberes, er disse Stress Foci omdannes til JUNQ og IPOD inklusioner i løbet af ca 2 timer. Hvis ubiquitinmedieret nedbrydning ikke er tilgængelig som en kvalitetskontrol option, UbC9 ts straks omdirigeret til iPod integration for beskyttende aggregering. Disse værktøjer tilbyder utrolige muligheder for at opdage nye genetiske faktorer involveret i aggregation kvalitetskontrol, og til at udforske deres rumlige og tidsmæssige regulering i cellen.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
MG132 | Mercury | mbs474790 | |
con A | Sigma | C2010 | |
Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |