4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

Resumen

La viabilidad celular depende de una gestión oportuna y eficiente de mal plegamiento de proteínas. Aquí se describe un método para visualizar los diferentes destinos posibles de una proteína mal plegada: replegamiento, la degradación, o el secuestro de inclusiones. Se demuestra el uso de un sensor de plegado, Ubc9 ^Ts, Por proteostasis seguimiento y control de calidad en la agregación de células vivas mediante microscopía 4D.

Resumen

Una de las tareas fundamentales de toda célula viva es mantener el correcto plegamiento de las proteínas recién sintetizadas frente a las siempre cambiantes condiciones ambientales y un ambiente intracelular que está estrechamente empaquetados, pegajosa y peligrosas para la estabilidad de la proteína ^1. La capacidad de balancear dinámicamente la producción de proteínas, plegamiento y la degradación demanda altamente especializada maquinaria de control de calidad, cuya absoluta necesidad se observa mejor cuando funciona mal. Las enfermedades como la esclerosis lateral amiotrófica, Alzheimer, Parkinson, y ciertas formas de fibrosis quística tienen un vínculo directo con plegamiento de proteínas componentes de control de calidad ^2, y por lo tanto el desarrollo terapéutico futuro requiere un conocimiento básico de los procesos subyacentes. Nuestro desafío experimental es entender cómo las células integrar señales de daños y organizar respuestas que se adaptan a diversas circunstancias.

La razón principal por la cual mal plegamiento de proteínas representa un thre existencialen que la célula es la propensión de las proteínas incorrectamente plegadas a agregarse, lo que provoca una perturbación global de la gente y delicado ambiente intracelular plegable ^1. La salud de plegado, o "proteostasis", del proteoma celular se mantiene, incluso bajo la presión del envejecimiento, el estrés y el daño oxidativo, mediante la acción coordinada de las diferentes unidades mecánicas en un sistema de control de calidad elaborada ^3,4. Una maquinaria especializada de las chaperonas moleculares puede unir no nativos polipéptidos y promover su plegamiento en el estado nativo ^1, a orientar para la degradación por el sistema de la ubiquitina-proteasoma ^5, o directamente a inclusiones de agregación de protección ^6-9.

En eucariotas, la calidad citosólica agregación de control de carga se reparte entre dos compartimientos ^8-10: El compartimiento de control de calidad juxtanuclear (JUNQ) y el depósito de proteína insoluble (IPOD) (Figura 1 - Modelo).Las proteínas que están ubiquitinadas por la proteína de la maquinaria de plegamiento de control de calidad se entregan a la JUNQ, donde son procesados ​​para su degradación por el proteasoma. Proteínas mal plegadas que no se ubiquitinadas se desvían a la IPOD, donde se agregan activamente en un compartimiento protector.

Hasta este punto, el paradigma metodológico de células vivas microscopia de fluorescencia ha sido en gran medida a las proteínas de la etiqueta y el seguimiento de su ubicación en la celda específica en los puntos de tiempo y por lo general en dos dimensiones. Como las nuevas tecnologías han empezado a conceder experimentadores acceso sin precedentes a la escala submicrónica en las células vivas, la arquitectura dinámica del citosol ha llegado a la vista como una frontera desafiante nuevo para la caracterización experimental. Se presenta un método para el rápido seguimiento de las distribuciones espaciales en 3D de múltiples proteínas marcadas fluorescentemente en el citosol de levadura con el tiempo. Timelapse 3D (4D imagen) no es sólo un desafío técnico, rataella, sino que también facilita un cambio dramático en el marco conceptual utilizado para analizar la estructura celular.

Utilizamos una proteína citosólica sensor plegable en levaduras vivas para visualizar los destinos distintos de las proteínas mal plegadas en el control de calidad de la agregación celular, utilizando una rápida visualización en 4D fluorescente. El mutante sensible a la temperatura de la proteína Ubc9 ^10-12 (Ubc9 ^ts) es extremadamente eficaz tanto como un sensor de proteostasis celular, y un modelo fisiológico para el control de seguimiento de la calidad de agregación. Al igual que con la mayoría de las proteínas ts, ^ts Ubc9 es totalmente plegada y funcional a temperaturas permisivas por activos chaperonas celulares. Por encima de 30 ° C, o cuando la célula se enfrenta a estrés misfolding, Ubc9 misfolds ^ts y sigue el destino de una proteína globular nativa que ha sido plegadas incorrectamente debido a la mutación, la desnaturalización por calor, o el daño oxidativo. Por fusión a GFP o otros fluoróforos, que pueden ser rastreados en 3D como forma estrés Foci, o es dicorregida a JUNQ o IPOD.

Protocolo

1. Los preparativos de levadura

1. Transformar las cepas de levadura con un plásmido que lleva un casete de GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ^ts).
2. Crecer la levadura en medios sintéticos que contienen 2% de rafinosa durante 24 horas y de nuevo se diluyó a 2% de galactosa para medios que contienen 16 hr o O / N. Incubar las células a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
3. A la mañana siguiente, se diluye la cepa consulta a OD ₆₀₀ = 0,2. Agitar durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) hasta que el cultivo alcanza _una DO600 = 0,8-1,0.
4. Para reprimir la expresión (así como para supervisar sólo la piscina ya traducido y doblado de GFP-Ubc9 ^ts), los medios de cambio a medio sintético suplementado con 2% de glucosa (SD) 30 min antes de la imagen.
5. Tratamiento - choque térmico de las células durante 20 min a 37 ° C para inducir plegamiento incorrecto, o continuamente en microscopio incubadora a seguir la agregación de proteínas en condiciones de choque térmico. Nota - Si está utilizando el microscopio a cualquier temperatura por encima de RT, pre-calentar for aproximadamente 2 horas para equilibrar la temperatura a lo largo del cuerpo del microscopio y los objetivos (ver más abajo).

2. Plate \ portaobjetos

1. Elige placa apropiada. La principal consideración es la capacidad para mantener la atención durante la adquisición de imágenes. Los siguientes puntos son fundamentales para la formación de imágenes 4D y no por lapsos de tiempo de imagen en 2D o 3D.
   1. Multiple pocillos de placa de la parte inferior de los diferentes pozos puede no ser homogéneo (es decir, los pozos será a diferentes alturas con respecto al objetivo). Esto hará que sea difícil mantener el enfoque a través de puntos XY y puntos de tiempo, independientemente de la técnica de enfoque automático que se utiliza.
   2. Material de la transparencia: vidrio plástico vs. Portaobjetos de vidrio de fondo son más z-homogénea entre los pozos, pero son más caros.
   3. Espesor de la parte inferior de la placa: se suelen utilizar placas de fondo cubreobjetos índice de 1,5, pero el índice 1 es también aceptable, dependiendo del objetivo.
2. Cover parte inferior de la placa de \ diapositiva con ConA (0,25 mg / ml) durante 10 min. ConA se usa para adherir las células al portaobjetos, lo que permite después de una sola celda con el tiempo.
3. Retire ConA e incubar el portaobjetos en una campana química de modo que el exceso de ConA se evaporará.
4. Placa de 200 l de muestra de levadura (OD ₆₀₀ = 0,5) en el ConAed bien.
5. Incubar durante 15 min, para permitir que las células se adhieren a la superficie de la placa.
6. Extraer el medio, y se lavan tres veces con medio nuevo para obtener una capa de células. Nota: si un lapso de tiempo está previsto, sembrar las células escasamente de modo que los nuevos brotes no se llena y interrumpir la región de interés.

3. Preparados para microscopio

1. Nosotros usamos un microscopio confocal Nikon A1Rsi con algunas modificaciones no estándar. Para imágenes de levadura se utiliza hasta 4 láseres (405 nm, 50 mW láser CUBE; 457-514 nm, 65 mW láser de ion argón; 561 nm, 50 mW láser de zafiro, y 640 nm, 40 mW CUBE láser), y hasta 4 PMTs equipados confiltros. La mayor parte de nuestra imagen se realiza con un conjunto de filtro verde para EGFP y un juego de filtros rojo para mCherry y tdTomato. Con GFP y mCherry casi no hay bleedthrough, por lo tanto, que a menudo utilizan la comprobación simultánea. Sin embargo, de exploración lineal también se puede utilizar para prevenir bleedthrough cuando ocurre. Nuestra confocal también está equipado con una etapa PInano Piezo (MCL), que puede hacer que 3 mseg en z, permitiendo 2-3 z-pilas (30-50 secciones) por segundo. El sistema también tiene un detector espectral, enfoque perfecto (láser de desplazamiento), y dos escáneres - un escáner galvano y un escáner resonante.
2. Elige objetivo apropiado. Consideraciones principales:
   1. Agua / aceite / aire objetivo: la principal consideración es el índice de refracción del medio formador de imágenes vs el medio de la muestra.
      1. Ventajas del aceite de objetivos:
         1. Objetivos de petróleo pueden tener mayores aperturas numéricas (aceite ligero descansos más que el agua, y por lo tanto más fotones volver al objetivo). Objetivos del petróleo puede tener hastaa NA 1,49, en comparación con 1,27 para el agua. (Sin embargo, esto no es realmente una gran diferencia en la resolución).
         2. El índice de refracción del aceite coincida con el índice de refracción del vidrio, por lo tanto, no se pierden fotones pasando de la muestra, a través del cristal, para el objetivo. (Nota - eligió un aceite de inmersión que tiene un índice de refracción que es apropiado para su objetivo y su cubreobjetos).
         3. Petróleo permite sin problemas de tiempo largo lapsus, ya que no se evapora.
         Desventajas de aceite Objetivo:
         1. La mayor resolución habilitado por la NA más alta de los objetivos de aceite se degrada rápidamente si la luz tiene que viajar a través de un medio acuoso (tal como una célula).
         2. Imágenes suelen tener las aberraciones esféricas y más un "estirado" efecto en 3D.
         3. El petróleo es pegajoso, sucio, y un peligro para los objetivos.
      2. Ventajas objetivas de agua
         1. La propia célula es acuosa, por lo tanto hay menos distorsiones en Z, Aª de la resolución sigue siendo alta profundamente en una muestra acuosa.
         2. Limpie y fácil de usar. Agua desventajas objetivas: se evapora rápidamente, por lo tanto, no es adecuado para películas largas sin arreglos especiales realizados para bombear agua continuamente al objetivo.
      3. Aire ventajas objetivas: 1. Ningún material se pierde / se evapora durante la adquisición de múltiples puntos o una película larga. 2. Limpie y fácil de usar. Desventaja: baja resolución y sensibilidad de señal baja.
   2. La temperatura ambiente y la incubadora: temperatura cambiante afecta propiedades de la materia, y en sistemas delicados cambia el enfoque. La temperatura debe ser ajustado antes de la elección de puntos de adquisición. Cambio de la temperatura durante la adquisición de imágenes se interrumpen y se traducirá en la pérdida de concentración. Dejamos que nuestro sistema de microscopio equilibrar durante 2 horas a la temperatura deseada antes de formación de imágenes.
   3. Collares de corrección: Objetivos Muchos vienen con un anillo de corrección que permiteel objetivo que se ha ajustado para un determinado cubreobjetos espesor. Le recomendamos que ajuste el collar de corrección durante el uso de perlas fluorescentes para visualizar la función de dispersión de punto. Esto asegurará ajustes correctos para cada muestra.
   4. Titulares estables de ejemplo: nos encontramos con que la mayoría de los soportes de muestra disponibles en el mercado son la parte más débil del microscopio. Son a menudo inestable y no directamente. Esto es un desastre para la alta resolución, multi-punto de imagen 4D. Diseñamos nuestros propios soportes de muestra que son rectas y bien ajustados al escenario. También puede ser atornillada en caso necesario.
   5. Multipunto adquisición: nuestro sistema de imagen está equipada con la Nikon "enfoque perfecto" del sistema, que es básicamente una impresora láser de enfoque automático mecanismo. Sin embargo, el enfoque automático no es necesariamente necesario con imágenes de 4D, especialmente si el sistema no va a la deriva mucho.

4. Proyección de imagen

1. Encienda el sistema: láseres, estadio, controlador, cámara y computer software.
2. Coloque la placa de soporte de la platina, debidamente asegurada y estabilizada.
3. Utilizar el puerto ojo para determinar la ubicación y la orientación de la levadura.
4. Uso de campo claro, evaluar la salud y la viabilidad celular de acuerdo con la forma y textura.
5. Encienda la luz epifluorescente de acuerdo con el fluoróforo relevante (por ejemplo FITC filtro para GFP), y se centran en las células que presentan el fenotipo que es objeto de su investigación. Las células que son altamente fluorescente en más de una longitud de onda puede estar muerto y por lo tanto autofluorescente. Visualizamos el núcleo con un fluoróforo tdTomato fusionado a una señal de NLS SV40 (NLS-TFP). TFP es dos veces el tamaño de la GFP, y es por lo tanto por encima del límite de difusión del núcleo, por lo tanto, funciona muy bien como un marcador nuclear. También puede excitar la PTF con un verde (488 nm) láser simultáneamente como GFP, pero recoger las emisiones de verde y rojo en dos PMTs separadas para la resolución espectral.
6. Realice los siguientes ajustes para minimizar el ruidoy sobresaturación:
   1. Potencia del láser - photobleaching y fototoxicidad vs brillo de la imagen debe ser considerado.
   2. Ganancia: afecta sensibilidad de la cámara, así Relación señal a ruido.
   3. Diámetro del agujero de alfiler - debe ser ajustada de acuerdo con el láser con la longitud de onda más corta. El diámetro del agujero de alfiler determina el espesor (altura) de la sección óptica imágenes. Por lo tanto, la apertura del agujero de alfiler recogerá más luz (y mucho más fotones), pero disminuirá la resolución en z (menos confocalidad).
7. Consejos útiles:
   1. Si diferentes fluoróforos emiten longitud de onda congruentes, utilizar la función de detector espectral que permite la elección de los filtros virtuales. Tenga en cuenta que los detectores espectrales son menos sensibles que los PMT regulares.
   2. Si diferentes fluoróforos son excitadas por el mismo láser, utilice la función de escaneado de línea.
   3. Un escáner de Galvano permite más sensibilidad, pero tiene un mayor riesgo de fotoblanqueo. Un escáner de resonancia permite un rápidocquisition, reduciendo así el riesgo de fotoblanqueo, pero es menos sensible.
   4. Promedio de entre 2 y 16 imágenes, que mejora la relación señal-ruido, pero hace que la adquisición más lento y, por supuesto, implica una mayor exposición de la muestra al láser.
   5. Duración de la adquisición depende de la pregunta biológica (por ejemplo JUNQ y formación IPOD toma aproximadamente 2 horas). Hemos fotografiado la levadura con el escáner de resonancia para un máximo de 30 horas en 3D de lapso de tiempo.
   6. Lapso de tiempo-intervalos más pequeños intervalos va a crear una película más coherente, pero podría causar fotoblanqueado y por lo tanto la pérdida de señal.

Resultados

Figura 1. Modelo:. Compartimentación subcelular de las proteínas mal plegadas maquinaria de control de calidad dirige las proteínas mal plegadas en compartimentos distintos con funciones distintas: las proteínas solubles, destinada a la degradación, se someten a poli-ubiquitination y se envían al compartimiento xta Ju-N NUCLEAR control Q alidad (JUNQ ). Las proteínas insolubles que no se pueden ubiquitinadas son enviados para el secuestro de protección a la I nsoluble Pr Otein D eposit (IPOD), adyacente a la vacuola, donde son sometidos a la agregación activo.

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Figura 2. Modelado de mal plegamiento de proteínas con GFP-Ubc9 ^ts. En condiciones normales, GFP-Ubc9 ^ts (verde) está plegado de forma nativa, y se localiza de manera difusa en el núcleo y el citosol. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). Expresión de Ubc9 ^ts se apagó por la adición de 2% de glucosa antes de exponer en todos los experimentos. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

1. Tras el cambio de temperatura a 37 ° C, GFP-Ubc9 ^ts (verde) está mal plegada y forma Foci estrés citosólica. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo).
2. Tras la recuperación de choque térmico a 23 ° C, el térmicamente desnaturalizado GFP-Ubc9 ^ts se degrada, como se indica por la disminución del nivel de fluorescencia.
3. A cambio de la temperatura a 37 ° C y la inhibición del proteasoma con MG132 80 Mm, GFP-U FC9 ^ts está mal plegadas y se transforma en JUNQ e inclusiones iPOD. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo).
4. Tras el cambio de temperatura a 37 ° C y la inhibición de ubiquitinación, ^ts GFP-Ubc9 se misfolded y se procesan en la inclusión IPOD. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). La proteasa ubiquitina 4 (Ubp4) se sobreexpresa para bloquear ubiquitination Ubc9 ^ts.

Figura 3. Lapso de tiempo de JUNQ y formación IPOD. Tras el cambio de temperatura a 37 ° C y la inhibición del proteasoma MG132 con 80 Mm, GFP-Ubc9 Foci Estrés ^ts se procesan en JUNQ y inclusiones iPOD. El núcleo está marcado por NLS-TFP (rojo). Imágenes en 3D fueron adquiridos a intervalos de 4 min. (Ver también la película 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ampliar la figura.

Discusión

Nuestras intuiciones sobre los procesos bioquímicos se derivan de experimentos de mesa de laboratorio en los que se permite una solución bien mezclada de los reactivos y productos para alcanzar el equilibrio en un vaso de precipitados. En tal entorno, la concentración de una especie química dada se puede expresar como un número único, que es la relación de la cantidad molar de las moléculas a un volumen macroscópico. Mucho de lo que sabemos acerca de la estructura y función de proteínas se deriva del uso de métodos que reflejan la imagen clásica, la reacción a granel: transferencias Western, centrifugaciones y mediciones espectrofotométricas realizadas en los extractos de los homogeneizados de toda la población de células.

A medida que la tecnología que utilizamos para observar las células bajo magnificación aumenta a pasos agigantados, se hace cada vez más claro que las condiciones en las que las reacciones bioquímicas tienen lugar más en vivo soportar sólo el más mínimo parecido con las del escenario de sobremesa clásico. No sólo es el interior de la celLa densa medio ambiente, en el que los efectos apiñamiento sustancialmente alterar las actividades de diversos reactivos, también es todo lo contrario de bien mezclada. Esto explica la disparidad frecuente entre in vitro e in vivo de la eficiencia en una amplia gama de reacciones macromoleculares complejas.

En ninguna parte son intuiciones que surgen desde lo clásico en experimentos in vitro bioquímicos más propensos a engañar como en las cuestiones relacionadas con el plegado en vivo, mal plegamiento y la agregación de las proteínas. Considerando que los estudios de química de proteínas en las reacciones a granel puede tratar el problema de plegado para una proteína dada como un simple sí o no cuestión, cualquier intento de rastrear la dinámica de poblaciones enteras de macromoléculas en una célula viva debe ser sensible a la distribución total de posible resultados conformacionales disponibles para una cadena polipeptídica, y en particular con el riesgo de mal plegamiento y la agregación. Por ejemplo, podríamos examinar una célula Ly mayorEstado de agregación de una proteína por Western Blot, y determinar que la proteína es principalmente insoluble y no ubiquitinated. Sin embargo, en la célula viva una discreta sub-población de la proteína, difíciles de detectar cuando un promedio sobre muchas células, puede ser soluble y ubiquitinated en un compartimiento particular, cuando la concentración local de la especie es extremadamente alta. El último escenario puede tener consecuencias más importantes para la viabilidad de la célula que el bulto de mayor tamaño sub-población. Además, mientras que chaperones mostrar una variedad de comportamientos pleiotrópicos y funciones in vitro, se está haciendo evidente que en la célula de sus funciones discretas están espacial y temporalmente limitado.

En el paradigma emergente para la comprensión de la bioquímica, la concentración se convierte en una propiedad variable de cada específico nano-medio ambiente en la célula, y los eventos moleculares que subyacen a los procesos biológicos deben analizarse no sólo en el tiempo, sino también en space. El enfoque de las imágenes de 4D que aquí se presenta permite el modelado sensible de mal plegamiento de proteínas en células vivas, aunque puede ser utilizada para estudiar cualquier número de otros procesos biológicos y cómo se regulan en el espacio, el tiempo, y como consecuencia de variaciones en las condiciones ambientales. En este trabajo se utiliza el sensor Ubc9 ^ts plegado, lo que efectivamente demuestra las etapas y las opciones para hacer frente a la aparición de la agregación de proteínas en el citosol. Además de ilustrar la biología celular de control de calidad de agregación, este enfoque puede servir como una herramienta poderosa para descifrar el efecto de las perturbaciones específicas o mutaciones genéticas en proteostasis (por ejemplo Ubc9 ^ts se puede utilizar para medir la tensión de plegado de proteínas en respuesta a la oxidación, la expresión de un agregado tóxico, o mutaciones en la vía de control de calidad).

4D formación de imágenes es también esencial para determinar con precisión la localización de proteínas o colocalización entre dos proteínas diferentess, y para la detección de fenómenos que tal vez ser transitorios, pero importante. Por ejemplo, especialmente en un organismo esférico pequeño tal como una levadura, puede parecer ser el caso de que una estructura o agregado tiene localización yuxtanuclear, mientras que las imágenes de 4D puede revelar que este es simplemente un artefacto del ángulo de inspección.

En el experimento de ejemplo que presentamos aquí, se demuestra el uso de un modelo misfolded proteínas, Ubc9 ^ts, de seguir el control de agregación de calidad en el tiempo y el espacio en el citosol. A la temperatura permisiva, Ubc9 ^ts se dobla y se difunde en el núcleo y el citosol. Al calor inducido por mal plegamiento, inicialmente se forma rápidamente difunden pequeños focos de tensión agregados que son procesados ​​por la degradación proteasomal. Cuando el proteasoma se inhibe parcialmente, estos focos de tensión se convierte en JUNQ y inclusiones iPOD en el transcurso de aproximadamente 2 horas. Si la degradación mediada por ubiquitina no está disponible como una opción de control de calidad, Ubc9 ^ts es inmediatamente redirigido a la inclusión IPOD para la agregación de protección. Estas herramientas ofrecen increíbles oportunidades para descubrir nuevos factores genéticos que intervienen en el control de calidad de agregación y de explorar su regulación espacial y temporal en la célula.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Placas inferiores de vidrio	ibidi	ibd81158
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Las películas confocales en 3D se adquirieron utilizando un microscopio Nikon A1R-si equipado con una etapa piezoeléctrica PInano (MCL), utilizando un objetivo de agua 60x NA 1.27, cortes de 0.3 micras, 0,5% de potencia láser (de 65 mW láser 488 y 50 mW láser 561). z-stacks se adquirieron cada 5 minutos durante 90 minutos. Cada serie z se adquirió con un tamaño de paso de 0,5 micras y 30 pasos en total. El procesamiento de las imágenes se realizó con el software NIS-Elements.