Summary
تم قياس الخصائص الميكانيكية للالكنان السكري من المسافة البادئة باستخدام البطانية المجالات ميكرون الحجم على الكابولي AFM. تم زراعة الخلايا البطانية في غرفة مخصصة في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية للحث على التعبير الكنان السكري. وقد تم تحليل البيانات باستخدام نموذج رقيقة لتحديد سمك الكنان السكري ومعامل.
Abstract
ويقتصر فهمنا للتفاعل الكريات البيض وجدار الوعاء الدموي أثناء التقاط الكريات البيض من فهم غير مكتمل الخصائص الميكانيكية للطبقة السطحية البطانية. من المعروف أن توزع جزيئات الالتصاق على الكريات البيض غير موحد بالنسبة لتضاريس سطح 3، أن يحد من تضاريس لاصقة تشكيل السندات مع غيرها من الأسطح 9، وأن القوات اتصال الفسيولوجية (≈ 5،0 حتي 10،0 في زغيبة PN) يمكن ضغط زغيبات على أنها اقل من ثلث طولها يستريح، وزيادة إمكانية الوصول إلى جزيئات على سطح معارضة 3 و 7. ونحن نعتبر أن البطانة كهيكل لمدة الطبقات، جسم الخلية جامدة نسبيا، بالإضافة إلى الكنان السكري، وطلاء لينة واقية السكر على سطح اللمعية 6. وقد تبين أن الكنان السكري يمكن أن تكون بمثابة حاجز للحد من التصاق الكريات البيض من السطح إلى 4 البطانية.في هذا التقرير أن نبدأ في معالجة التشوه من السطوح البطانية لفهم كيفية صلابة البطانية الميكانيكية قد تؤثر على تشكيل السندات. الخلايا البطانية التي تزرع في ثقافة ساكنة لا تعبر عن الكنان السكري قوية، ولكن الخلايا نمت في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية تبدأ في الكنان السكري التقريبي لوحظ في الجسم الحي 2. وقد تم قياس معامل للجسم الخلية البطانية باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM) ليكون يقرب من 5 إلى 20 كيلو باسكال 5. وقد تم دراسة سمك وهيكل الكنان السكري باستخدام المجهر الإلكتروني 8، وتم يقترب من معامل للالكنان السكري باستخدام أساليب غير مباشرة، ولكن على حد علمنا، لم تكن هناك أي تقارير منشورة من القياس المباشر للمعامل الكنان السكري في الخلايا الحية . في هذه الدراسة، نقدم تجارب المسافة البادئة التي مع التحقيق الذي تجريه AFM الرواية على الخلايا التي تم زرعها في ظروف لتحقيق أقصى قدر من التعبير عنها لأماه الكنان السكريقياسات كه المباشر للمعامل وسمك بطانة الكنان السكري.
Protocol
1. طرق
1،1 غرفة تدفق خلية
تم بناء غرفة تدفق A، كما هو موضح في الشكل رقم 1، بحيث يمكن أن تنمو الخلايا تحت القص من 1.0 باسكال (10 DYN / سم 2) ونقل بعد ذلك مباشرة إلى اللجوء MFP3D AFM (سانتا باربارا، CA).
- وقد أعدت غرفة تدفق للتجربة عن طريق تنظيف لأول مرة الشرائح الزجاجية في حل البيرانا (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2) لمدة 15 دقيقة ثم غسل ولهم الماء المقطر. وبعد ذلك إلى خبز جاف والمغلفة مع triethoxy أمينو سيلاني (APTES) في فراغ غرفة الترسيب.
- كما قطع طوقا سيليكون باستخدام أداة قطع SD صورة ظلية. هذا سمح لنا للسيطرة على أبعاد الغرفة ناعما تدفق للسيطرة على معدل التدفق وإجهاد القص خلال نمو الخلايا. عادة، وقطعت قناة 6.4 ملم 19 ملم واسعة من قبل فترة طويلة من ورقة من السيليكون ملم 0.4. معدل التدفق اللازمة لأجناسالشركة المصرية للاتصالات ليتم احتساب إجهاد القص من 1.0 باسكال (10 DYN / سم 2) على افتراض تدفق الصفحي في قناة مستطيلة مع المعادلة:
حيث Q هي معدل التدفق، τ هو إجهاد القص، μ هو لزوجة المتوسط، يفترض هنا هي 1.0 ميجا باسكال (0.01 * DYN ثانية / سم 2)، H ارتفاع وث هو العرض للغرفة تدفق .
- تم محاذاة قطعة الأعلى للغرفة مع تدفق حشية في الخلية طبق الثقافة وتأمين مع عصابة المغناطيسي. وقد شغل الجمعية مع ايزوبروبيل (IPA) لتعقيم.
- تم تجميعها في نظام التدفق الكامل. تم ربط المنافذ تدفق في الخلية طبق الثقافة لثلاثي الصمامات. تم توصيل الصمامات لفتح 30 حقنة ملق. تم مسح IPA من خلال النظام الذي كان يغسل بعد ذلك مع 30 مل من المتوسط مكوي مع 4٪ مصل العجل الجنين (FCS). وقد شغل ثم النظام مع 20 مل من المتوسط تكنولوجيز المزيد نمو الخلايا. وضعت أغطية على قمم من الحقن. كان غطاء خزان الحقنة الصيد إبرة في المكان لنقل متوسطة عودة إلى خزان تغذية. كانت تعلق العقيمة مرشحات ميكرون 0.2 إلى مداخل الهواء في أغطية لمنع تلوث النظام. كان غرفة جاهزة للتدفق ثم بذر الخلية.
1،2 خلية ثقافة
- تم شراء خلايا بطانة الأوعية الدموية الوريد السري (في HUVEC) والمتوسطة النمو من تقنيات المزيد (رينسيلار، NY) ونمت لالتقاء في قارورة T25.
- تمت إزالة المتوسطة النمو من القارورة وأحادي الطبقة من الخلايا التي تم إصدارها مع 2 مل من التربسين 2.5٪. مرة واحدة كانت الخلايا في الحل، وتطفئ trypsinization مع إضافة 10 مل من مستنبت الخلية إلى القارورة.
- التم طرد ه التعليق الخلية لمدة 5 دقائق وتمت إزالة طاف. ومعلق الخلايا في 1 مل من مستنبت الخلية (التي تحتوي على مصل) للحقن في غرفة التدفق.
- تم تحميل التعليق الخلية (0.5 مل، = 50،000 الخلايا) في حقنة وحقنها في غرفة تدفق من خلال صمام ثلاثي.
- سمح للخلايا لتسوية الالتزام والركيزة الزجاج لمدة 2 ساعة قبل بدأ التدفق. ونمت الخلايا تحت تدفق في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 5 أيام حتى متموجة.
1.3 إعداد الكابولي والمسافة البادئة الخليوي
- تم تنظيف Tipless الكابولي AFM (NanoWorld، سويسرا) في حامض النيتريك لمدة 5 دقائق و functionalized مع triethoxy أمينو سيلاني (APTES) في غرفة ترسيب البخار.
- A حل من 5 ملغ / مل وزنا NHS-LC-سلفو البيوتين في محلول ملح هانك التخزين المؤقت (HBSS) أعدت. وغمرت المياه في الكابولي في حل لمدة 15 دقيقة لconjuبوابة سيلاني مع الكيمياء (NHS) N-Hydroxysuccinimide.
- وقدم حل وسط البيوتين مجانا من احتضان 20 مل من تقنيات المزيد خلية ثقافة المتوسط (بما في ذلك المصل) مع 200 ميكرولتر من الخرز لمدة 12 ساعة streptavadin. تم إزالة حبات من المتوسطة مع المغناطيس وتصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.22 ميكرون العقيمة.
- تمت إزالة غرفة تدفق من الخلية طبق الثقافة وتم غسلها الخلايا في 37 ° C البيوتين خالية المتوسط.
- وتم إعداد محلول المخزون من 1 ميكرولتر من 2.4 ميكرومتر الخرز المغلفة مع streptavidin في 1 مل من المتوسط مجانا البيوتين، وإضافة 100 ميكرولتر من الأسهم إلى الخلية طبق الثقافة.
- كان قد تم اعتقالهم الخرز Streptavidin حتى مع ناتئ من الهبوط على سطح تلميح الزجاج بالقرب من التراجع، وحبة، وتحديد المواقع ذروة ناتئ على حبة، ومن ثم الضغط على أسفل ناتئ على عدة ثواني حبة ويستريح ل.
- كان لحساسية ناتئ التدبيرد من الطعج على منطقة من الزجاج عارية واستخدام المنحدر من منحنى لضبط انحراف الطرف بوصفها وظيفة من الجهد.
- ثم تم حساب ثابت الربيع للناتئ من المعايرة الحرارية في البرنامج MFP3D.
- واستخدمت بعد ذلك لمعايرة ناتئ مسافة بادئة للعينات، كما هو مبين في الشكل 2. هذه الخرز 2،4 ميكرومتر توفر مساحة أكبر اتصال مع سطح الخلية بحيث يمكن الكشف عن الخواص الميكانيكية للطبقة ناعمة الكنان السكري. وكان وضعه في ناتئ فوق خلية بالقرب من نواة الخلية ونهج الناعمة تم استخدام تلميح إلى الخلية لضبط ارتفاع حوالي 3 ميكرومتر ناتئ فوق سطح الخلية. تم تعيين البرنامج لمدة 20 الانبعاجات المتكررة بمعدل 1 ميكرومتر / ثانية إلى أقصى قوة من ن ن 7. ما يقرب من 6 ثوانى المنقضي بين اتصالات المتعاقبة. فمن الممكن استخدام معدلات مختلفة من المسافة البادئة لاختبار المعتمدة على الوقت خصائص الكنان السكري، على الرغم من هذه الأولية التجارب، فقط تم استخدام معدل المسافة البادئة واحد (1 ميكرومتر / ثانية).
2. المسافة البادئة نظرية
ويمكن وصف المسافة البادئة إلى مرونة نصف مساحة مع دائرة نصف قطرها R مجال استخدام نظرية هيرتز حيث يتم إعطاء قوة المسافة البادئة، F، عن طريق المعادلة:
حيث δ هو عمق المسافة البادئة و* E هو معامل تخفيض من المواد تحت الاختبار (الشكل 3). في حالة وجود إندينتر شديدة تؤثر بلا حدود موحدة مرنة نصف الفضاء، وتعطى من قبل E * المعادلة:
3/50163eq3.jpg "/>
حيث E هو معامل المرونة وν هي نسبة بواسون للمادة. وقد ألهم عمل مؤخرا مع الأفلام البلاستيكية ووضع نموذج الطبقة الثانية لتحديد معامل وسمك الأغشية الرقيقة 1. نحن نطبق هذا النموذج لبيولوجيا الخلية عن طريق معالجة الكنان السكري كفيلم موحدة لينة رقيقة على سطح خلايا الجسم. باستخدام هذا النموذج، وانخفاض معامل يصبح النظام:
حيث E هو معامل GC من الكنان السكري، E الخلية هي معامل جسم الخلية، P، Q و N هي الثوابت التي تم تحديدها تجريبيا من البوليمر تناسبها، وتعطى من قبل Z المعادلة:
-together.within صفحة = "دائما"> 
حيث t هو سمك طبقة الكنان السكري. ويرد التخطيطي من هذه المعلمات في الشكل 3. وقد تبين النموذج ليكون وسيلة دقيقة لتحديد معامل وسمك طبقة رقيقة على صلابة الركيزة 1. ويمكن استخدام هذه المعادلة لتناسب منحنيات تم الحصول عليها من المسافة البادئة في الخلايا لتحديد معامل وسمك بطانة الكنان السكري، كما هو موضح في الشكل 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تجربة نموذجية، تم الحصول على 20 القوة-VS-المسافة من منحنيات منطقة معينة من الخلية، وعادة في المنطقة محيط بالنواة، القريب، ولكن لم يكن في النواة (داخل ميكرومتر 2 ~). تم تنسيق منحنيات حساب أي انحراف العينة خلال مدة القياس ومن ثم بلغ متوسط الضجيج لإزالة ناتئ، كما هو موضح في الشكل 4. وقد تم تحليل منحنيات وتتناسب مع نموذج الطبقة الثانية التي وضعت لتحديد معامل وسمك الأفلام البلاستيكية ورقيقة 1. من نوبات من منحنيات من 25 زنزانة، فقد قررنا أن معامل طبقة اللمعية هو 0.7 ± 0.5 كيلو باسكال وسمك هو 380 ± 50 نانومتر، كما هو موضح في الشكل 5. معامل للجسم الخلية هو 16 ± 6 كيلو باسكال. هذه القيم هي في اتفاق جيد مع القياسات السابقة للمعامل خلايا الجسم وسمك الكنان السكري 5 و 8.
> 
الشكل 1. ويعزى الجهاز ثقافتنا الخلية. تدفق عبر الدائرة عن طريق الجاذبية من الخزان إلى خلايا A C. كانت مطلية في غرفة مغلقة B الذي عقد مع المغناطيس إلى سطح الخلية طبق مغلق لAFM اللجوء (اللجوء، CA سانتا باربارا ). تمكين ثلاثي الصمامات على B لنا لوقف التدفق. إنشاء طوقا سيليكون تدفق قناة 6.4 ملم واسعة بنسبة 19 مم بنسبة 0.4 ملم عالية. تمت إزالة بسهولة مغلق غرفة B وطبق خلية مغلقة انتقل مباشرة إلى AFM للتجريب. واستمر ارتفاع D الفرق من خلال ضخ السائل من خزان C إلى A مع مضخة تمعجية (لا يظهر). وضعت الجمعية كله في حاضنة لمدة خلية ثقافة.
الشكل 2 من الزمن: صورة ناتئ مع 2.4حبة ميكرومتر (السهم) التي توليها صلة البيوتين streptavidin-. الحق: أحادي الطبقة من HUVECs نمت تحت التدفق.
الشكل 3. هندسة التفاعل بين دائرة نصف قطرها R حبة من الطعج وδ المسافة في الخلية. والكنان السكري، كما هو موضح باللون الأخضر، لديها معامل GC E ور سمك. جسم الخلية يحتوي على الخلية E معامل. يتم قياس قوة تطبقها حبة إلى الخلية، F، ويتم الحصول على منحنى القوة مقابل المسافة، كما هو موضح في الشكل 4.
4 الشكل. كما تم رسم منحنى القوة مقابل متوسط المسافة البادئة لفي خلية باللون الأحمر. يظهر المسافة البادئة الفردية في أقحم. أبرزت في الصورة هي نقطة الاتصال، حيث ناتئ يمس السطح أولا لمعي، وطبقة لمعي، حيث يهيمن المنحدر من منحنى من قبل صلابة من الكنان السكري، وخلايا الجسم، حيث المنحدر هو في المقام الأول وظيفة من الخلية معامل الجسم. يظهر منحنى المجهزة من نظرية المسافة البادئة طبقتين باللون الأزرق، ويظهر مناسبا لنموذج أبسط هيرتز لمساحة 1/2 مرونة من خط منقط السوداء. كانت هناك أربع معلمات الحرة في نوبات طبقتين. كانت القيم التي تحدد لهذا مناسبا خاصة: معامل الخلية = 15،9 كيلو باسكال، طبقة اللمعية معامل = 0،33 كيلو باسكال سمك طبقة، واللمعية = 420 نانومتر. المعلمة الرابع المجهزة هي نقطة الاتصال مع الكنان السكري. المواقع من أصل النسبية محور س إلى سطح الخلية هو إجراء تعسفي. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
5 "FO: المحتوى العرض =" 5.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpg "/>
الشكل 5. تم تحديد E GC لتصبح 0.7 ± 0.5 كيلو باسكال: المدرج الاحصائي من الخصائص من 25 خلايا من نوبات منحنى الزمن. الحق: تم تحديد سمك الكنان السكري لتكون 380 ± 50 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدمنا القيم المحسوبة من النموذج طبقتين ونظرية هيرتز في تصميم نموذج التفاعل من الكريات البيض في الدم مع الجدار البطانية. وحسبنا أن زغيبة على الكريات البيض التي يبلغ قطرها 50 نانومتر تحت تحميل PN 10 ونحو 150 نانومتر البادئة في الكنان السكري، سوى جزء ضئيل من مجموع سمك. هذا يدل على أن الكنان السكري، مع خصائص وقياس في هذه التجربة، هو حاجزا كبيرا أمام خلية خلية التفاعل ويمكن أن يكون عائقا كبيرا الفراغية التي يجب التغلب الخلايا خلال تتالي التصاق الكريات البيض خلال الالتصاق.
في النموذج المستخدم هنا، ونحن تقريب الكنان السكري وبنية مرنة موحد الخواص. بينما نحن لا علم له بأي قياسات الميكانيكية للإشارة ليست هذه هي الحالة، ما هو معروف عن التركيب الجزيئي للالكنان السكري تشير إلى أن هذا هو المرجح لتبسيط أكثر. في الواقع، فإن الكنان السكري هو المعقدة والمتنوعةهيكل على سطح الخلايا. وتتكون من الهياكل الجزيئية المنحى، تفتقر إلى الحدود واضحة المعالم الخارجي، ويصبح أكثر كثافة من المرجح على مقربة من سطح الخلية. وهكذا، في حين أن نموذج ثنائي الطبقات المرنة المستخدمة هنا رؤية ثاقبة لصلابة النسبي للالكنان السكري وحظ من قبل خلايا تعميم، يمكن أن الدراسات المستقبلية استكشاف أوصاف الميكانيكية البديلة التي قد تكون مسؤولة عن تباين في وكثافة متفاوتة ممكن في الاتجاه سمك. ومن الممكن أيضا أن الكنان السكري ليست موحدة في جميع أنحاء مناطق مختلفة من سطح الخلية. هذا من شأنه أن لم يكن واضح من البيانات الحالية لأنه تم تعيين اتخاذ جميع البيانات المقدمة هنا في المنطقة الوسطى من الخلية حول النواة.
قد تظهر أيضا خصائص الكنان السكري اللزجة التي لم يتم التحقيق في هذه الدراسة. فقد لوحظ أنه في ظل الظروف ثابت، وخلايا الدم الحمراء في الشعيرات الدموية يمكن أن تضغط بشكل كامل الكنان السكري، تعميم هيريسخلايا الدم الحمراء لا 10. القوات التي تم إنشاؤها بواسطة خلايا الدم الحمراء ثابتة من المرجح أن تكون صغيرة للغاية (3-10 ~ باسكال). هذا يدل على الكنان السكري قد تكون لينة جدا في استجابة لضغط بطيئة، ولكن صلابة أسرع بشكل ملحوظ خلال الضغط. أجريت قياسات لدينا بأسعار المسافة البادئة من 1 ميكرون / ثانية لمحاكاة تصلب خلية تعميم قد تواجهها، ولكن المزيد من العمل لتحقيق خصائص المعتمدة على الزمن في التقدم.
وقد استخدم لقياس المسافة البادئة AFM مباشرة معامل وسمك بطانة الكنان السكري في الخلايا الحية. القياسات تشير إلى أن الكنان السكري يمكن أن تكون حاجزا كبيرا أمام خلية خلية الاتصال والالتصاق ويخدم المرجح كعامل رئيسي في تنظيم سلسلة التصاق خلال الالتهاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر ايلينا Lomakina، Bauserman ريتشارد، يانغمان مارغريت، فاكنين شاي، جيسيكا سنايدر، Striemer كريس، ناتاراج ناكول، هونغ تشونغ لى، Khire تيجاس، ولام اريك لمساعدتهم في هذا المشروع. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد الوطنية للصحة # 018208 PO1 HL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy's Medium | Gibco | 16600-082 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | SH30070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Vec Technologies | MCDB-131 | |
| Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Vec Technologies | PHUVEC/T-25 | |
| Sulfuric Acid | JT Baker | 9681-02 | |
| Hydrogen Peroxide | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Aldrich | 440140-100ML | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | BDH8999-4 | |
| Trypsin | Cellgro | 25-054-C1 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| Streptavadin beads | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP-3D AFM | Asylum Research | ||
| Tipless Cantilevers | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| Silhouette SD | Quickutz | Silhouette-SD | |
| Silicone Rubber | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ml Syringes | Benton Dickinson | 309650 | |
| 18 gauge needles | Benton Dickinson | 305196 | |
| Extension Sets | Hospira | 4429-48 | |
| 4 way valves | Teleflex | W21372 | |
| Male/Female Port Caps | Smith’s Medical | MX491B | |
| Peristaltic Pump | Watson-Marlow | 401U/D | |
| Peristaltic Tubing | Watson-Marlow | 903.0016.016 | |
| sterile filters | Pall Life Science | 4652 |
References
- Clifford, C., Seah, M. Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios. Nanotechnology. , (2009).
- Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).
- Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm. Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).
- Lipowski, H. H. The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases. Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).
- Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. Mechanical properties of actin stress fibers in living cells. Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P.
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).
- vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema. Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).
- Vink, H., Duling, B. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circulation Research. 79, 581-589 (1996).
