La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Summary

Las características mecánicas de glicocálix endotelial se midieron por indentación usando esferas micrón en voladizo de AFM. Las células endoteliales se cultivaron en una cámara de costumbre bajo condiciones de flujo fisiológico para inducir la expresión glicocálix. Los datos se analizaron utilizando un modelo de película delgada para determinar el espesor y el módulo de glicocálix.

Abstract

Nuestro entendimiento de la interacción de los leucocitos y la pared del vaso durante la captura de leucocitos está limitado por una comprensión incompleta de las propiedades mecánicas de la capa de la superficie endotelial. Se sabe que las moléculas de adhesión en los leucocitos se distribuyen de manera no uniforme en relación con topografía de la superficie ^3, que limita la formación de topografía unión adhesiva con otras superficies ^9, y que las fuerzas de contacto fisiológicas (≈ 5,0 a 10,0 pN por microvellosidades) puede comprimir las microvellosidades como poco como un tercio de su longitud en reposo, el aumento de la accesibilidad de las moléculas a la superficie opuesta ^{3, 7.} Consideramos el endotelio como una estructura de dos capas, el cuerpo celular relativamente rígido, además de la glucocáliz, un recubrimiento de azúcar blando protectora en la superficie luminal ^6. Se ha demostrado que el glicocáliz puede actuar como una barrera para reducir la adhesión de los leucocitos a la superficie endotelial ^4.En este informe se empiezan a abordar la deformabilidad de las superficies endoteliales para entender cómo la rigidez mecánica del endotelio puede afectar la formación del enlace. Las células endoteliales cultivadas en cultivo estático no expresan un glicocalix robusta, pero las células cultivadas bajo condiciones de flujo fisiológico comienzan a aproximar el glucocáliz observado in vivo ^2. El módulo del cuerpo de células endoteliales ha sido medida mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) para ser aproximadamente de 5 a 20 kPa ^5. El espesor y la estructura del glicocálix se han estudiado utilizando microscopía electrónica de ^8, y el módulo de la glicocálix se ha aproximado mediante métodos indirectos, pero a nuestro conocimiento, no se han publicado informes de una medición directa del módulo glicocálix en células vivas . En este estudio, se presentan experimentos de indentación realizadas con una sonda AFM novela en células que han sido cultivadas en condiciones para maximizar su expresión glicocálix a make mediciones directas del módulo y el espesor de la glicocálix endotelial.

Protocol

1. Métodos

1,1 Celular Cámara de Flujo

Una cámara de flujo, que se muestra en la Figura 1, fue construido de manera que las células pueden ser cultivadas bajo un esfuerzo cortante de 1,0 Pa (10 dinas / cm ²⁾ y luego se transfiere directamente a un asilo MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. La cámara de flujo se preparó para el experimento por primera limpieza de los portaobjetos de vidrio en solución Piranha (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ durante 15 min y después de lavarlas con agua destilada. Ellos se cocieron luego a seco y recubierto con trietoxi aminopropil silano (APTES) en una cámara de deposición en vacío.
2. Una junta de silicona se cortan con una herramienta de corte Silhouette SD. Esto nos permitió controlar finamente las dimensiones de la cámara de flujo para el control de la velocidad de flujo y la tensión de cizallamiento durante el crecimiento celular. Típicamente, un canal se cortó 6,4 mm de ancho por 19 mm de largo a partir de una lámina de silicona 0,4 mm. El caudal necesario para géneroste una tensión de cizalladura de 1,0 Pa (10 dinas / cm ²⁾ se calcula suponiendo que el flujo laminar en un canal rectangular con la ecuación:

donde Q es el caudal, τ es el esfuerzo cortante, μ es la viscosidad del medio, que aquí suponen 1,0 mPa (0,01 dyn * s / cm ^2), h es la altura y w es la anchura de la cámara de flujo .

3. La pieza superior de la cámara de flujo se alinea con la junta en la placa de cultivo celular y se fija con un anillo magnético. El conjunto se llenó con alcohol isopropílico (IPA) para la esterilización.
4. El sistema de flujo total fue montado. Los puertos de flujo en la placa de cultivo celular se conecta a las válvulas de tres vías. Las válvulas se conectaron a abrir 30 ml jeringas. IPA se eliminan a través del sistema, que después se lavó con 30 ml de medio de McCoy con 4% de suero fetal de ternera (FCS). El sistema se llenó entonces con 20 ml del medio de Vec Tecnologías de crecimiento celular. Las cubiertas fueron colocados en la parte superior de las jeringas. El depósito de captura tapa de la jeringa tenía una aguja en su lugar para mover medio de vuelta al depósito de alimentación. Estéril de 0,2 micras filtros se fijaron a las entradas de aire en las cubiertas para evitar la contaminación del sistema. La cámara de flujo estaba entonces listo para la siembra de células.

1,2 Cultivo Celular

1. Humanos de las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y el medio de crecimiento se compraron Tecnologías de Vec (Rensselaer, NY) y se cultivaron hasta confluencia en un matraz T25.
2. El medio de crecimiento se retiró del matraz y la monocapa de células liberadas con 2 ml de tripsina al 2,5%. Una vez que las células estaban en solución, la tripsinización se detuvo con la adición de 10 ml de medio de cultivo celular al matraz.
3. Thsuspensión e celular se centrifugó durante 5 min y se eliminó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo celular (que contiene suero) para la inyección en la cámara de flujo.
4. La suspensión de células (0,5 ml, ~ 50.000 células) se cargó en una jeringa y se inyecta en la cámara de flujo a través de una válvula de tres vías.
5. Las células se dejaron sedimentar y se adhieren al sustrato de vidrio durante 2 horas antes de flujo se inició. Las células fueron cultivadas bajo flujo en una incubadora a 37 ° C durante 1 a 5 días hasta confluencia.

1,3 Cantilever Preparación y sangría Celular

1. Sin punta de AFM (voladizos nanomundo, Suiza) se limpiaron en ácido nítrico durante 5 min y se funcionaliza con trietoxi aminopropil silano (APTES) en una cámara de deposición de vapor.
2. Una solución de 5 mg / ml en peso NHS-sulfo-LC-biotina en solución salina tamponada de Hank (HBSS) se preparó. Los voladizos se sumergieron en la solución durante 15 min a conjula puerta del silano con N-hidroxisuccinimida (NHS) química.
3. Una solución de medio de biotina libre se realizó mediante la incubación de 20 ml de medio de cultivo Vec Cell Technologies (incluido el suero) con 200 l de perlas de estreptavidina durante 12 h. Las perlas se retiraron del medio con un imán y el medio se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 micras.
4. La cámara de flujo fue retirado de la placa de cultivo celular y las células se lavaron en 37 ° C biotina libre de soporte.
5. Una solución stock de 1 l de 2,4 micras perlas recubiertas con estreptavidina en 1 ml de medio libre de biotina fue preparado, y 100 l de la madre se añadió a la placa de cultivo celular.
6. Perlas de estreptavidina fueron recogidos con el voladizo por el aterrizaje de la punta en la superficie de vidrio junto a una retracción de bolas, posicionando el vértice de la viga en voladizo sobre el cordón, y después presionando el voladizo hacia abajo sobre los varios segundos de talón y de descanso para.
7. La sensibilidad de la medida era voladizod por el sangrado en una región de vidrio desnudo y utilizando la pendiente de la curva para ajustar la desviación de la punta como una función de la tensión.
8. La constante de resorte de la viga en voladizo se calculó a continuación a partir de una calibración térmica en el software MFP3D.
9. El voladizo calibrado se utilizó a continuación para sangrar las muestras, como se muestra en la Figura 2. Estas perlas de 2,4 micras ofrecer una mayor área de contacto con la superficie de la célula de modo que las propiedades mecánicas de la capa blanda glicocálix puede ser detectado. El voladizo se coloca sobre una celda cerca del núcleo de la célula y un enfoque suave de la punta en la celda se usa para ajustar la altura del voladizo aproximadamente 3 m por encima de la superficie de la célula. El software se fijó para 20 muescas repetidos a una velocidad de 1 m / seg a una fuerza máxima de 7 nN. Aproximadamente 6 segundos transcurrido entre los contactos sucesivos. Es posible utilizar diferentes tasas de sangría para la prueba de tiempo que dependen de las propiedades del glicocálix, aunque en estos inicial experimentos, sólo una tasa de indentación simple (1 m / seg) se utilizó.

2. Sangría Theory

Indentación en un semiespacio elástico con una esfera de radio R puede ser descrito usando la teoría de Hertz, donde se da la fuerza de indentación, F, por la ecuación:

Donde δ es la profundidad de penetración y * E es el módulo reducida del material bajo prueba (Figura 3). En el caso de un indentador infinitamente rígido uniforme que incide un semiespacio elástico, E * viene dada por la ecuación:

3/50163eq3.jpg "/>
donde E es el módulo de elasticidad y ν es el coeficiente de Poisson del material. El trabajo reciente con películas de polímero ha inspirado el desarrollo de un modelo de dos capas para la determinación del módulo de elasticidad y espesor de las películas delgadas ^1. Estamos aplicando este modelo a la biología celular mediante el tratamiento de la glicocálix como una película uniforme suave delgada sobre la superficie del cuerpo de la célula. Usando este modelo, el módulo reducida del sistema se convierte en:

Donde E es el módulo de _GC del glicocálix, _célula E es el módulo de la célula cuerpo, P, Q y n son constantes que han sido determinados empíricamente a partir del polímero se ajusta, y z viene dada por la ecuación:

Donde t es el espesor de la capa de glicocálix. Un esquema de estos parámetros se muestra en la Figura 3. El modelo ha demostrado ser una forma precisa de determinar el módulo y el espesor de una película delgada sobre el agravamiento de sustrato ^1. Esta ecuación se puede utilizar para adaptarse a las curvas obtenidas a partir de indentación en las células para determinar el módulo y el espesor de la glicocálix endotelial, como se muestra en la Figura 4.

Representative Results

En un experimento típico, 20 fuerza-distancia-vs curvas se obtuvieron a partir de una región determinada de la célula, típicamente en la región perinuclear, cerca, pero no en, el núcleo (a menos de ~ 2 micras). Las curvas se ajustaron para tener en cuenta cualquier deriva de la muestra durante toda la duración de la medición y se promediaron para eliminar el ruido en voladizo, como se muestra en la Figura 4. Las curvas se analizaron y encajar con el modelo de dos capas que fue desarrollado para la determinación del módulo de elasticidad y espesor de películas delgadas de polímero ^1. De accesos de las curvas de 25 células, hemos determinado que el módulo de la capa luminal es 0,7 ± 0,5 kPa y el espesor es de 380 ± 50 nm, como se muestra en la Figura 5. El módulo del cuerpo de la célula es de 16 ± 6 kPa. Estos valores están en buen acuerdo con las mediciones anteriores del módulo del cuerpo de la celda y el espesor de la glicocálix ^{5, 8.}

Figura 1. Nuestro dispositivo de cultivo de células. Flujo a través de la cámara fue impulsado por gravedad desde el depósito de A a C. Las células se sembraron en la cámara B cerrado que se llevó a cabo con imanes a la superficie de una placa de célula cerrada para una Asylum AFM (Asilo, Santa Barbara CA ). Válvulas de tres vías sobre el B nos permitió detener el flujo. Una junta de silicona creado un canal de flujo de 6,4 mm de ancho por 19 mm de largo por 0,4 mm de alto. La cámara cerrada B fue removido fácilmente y el plato de célula cerrada se trasladó directamente en el AFM para la experimentación. La diferencia de altura D se mantuvo mediante el bombeo de fluido desde el depósito de C a A con una bomba peristáltica (no se muestra). Todo el conjunto se coloca en una incubadora durante la duración del cultivo celular.

Figura 2 izquierda:. Imagen de un voladizo con un 2,4m talón (flecha) unido por un enlace biotina-estreptavidina. Derecha: monocapa de HUVEC cultivadas bajo flujo.

Figura 3. Geometría de la interacción de la perla de radio R indentar una distancia δ en la célula. El glucocáliz, que se muestra en verde, tiene un módulo de E _GC y un espesor t. El cuerpo de la celda tiene un módulo E _{de células.} La fuerza aplicada por el talón a la célula, F, y se mide la curva de fuerza frente a la distancia, que se muestra en la Figura 4, se obtiene.

Figura 4. La fuerza promedio versus la curva de distancia de una muesca en una célula se representa en rojo. Una indentación individual se muestra en el recuadro. Destacados en la imagen son el punto de contacto, donde el voladizo primero toca la superficie luminal, la capa luminal, donde está dominado la pendiente de la curva por la rigidez del glicocálix, y el cuerpo de la célula, donde la pendiente es principalmente una función de la célula módulo de carrocería. La curva ajustada a partir de la teoría de la indentación de dos capas se muestran en azul, y el ajuste del modelo Hertz más simple para un espacio de un medio elástico se muestra por la línea punteada negro. Había cuatro parámetros libres en el ajuste de dos capas. Los valores determinados para esta forma particular, fueron: módulo de celda = 15,9 kPa, la capa luminal de módulo = espesor de capa de 0,33 kPa, y luminal = 420 nm. El parámetro equipada cuarto es el punto de contacto con el glycocalyx. Posicionamiento de la relación origen del eje X a la superficie celular es arbitraria. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

5 "fo: content-width =" 5.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpg "/>
Figura 5. Los histogramas de las propiedades de las células 25 de los ajustes de curva izquierda:. E _GC se determinó que era 0,7 ± 0,5 kPa. Derecha: El espesor de la glicocálix se determinó que era 380 ± 50 nm.

Discussion

Se utilizaron los valores calculados a partir del modelo de dos capas y la teoría de Hertz para modelar la interacción de un leucocito circulante en la sangre con la pared endotelial. Hemos calculado que un microvellosidades en el recuento de leucocitos con un diámetro de 50 nm bajo una carga de 10 pN guión sería de aproximadamente 150 nm en el glucocáliz, sólo una fracción del espesor total. Esto indica que el glucocáliz, con propiedades como medidos en este experimento, es una barrera significativa para la interacción célula-célula y puede ser un impedimento estérico grande que las células deben superar durante la cascada de adhesión durante la adhesión de leucocitos.

En el modelo utilizado aquí, se aproxima la glicocálix como una estructura elástica isotrópica. A pesar de que no son conscientes de cualquier medición mecánicos para indicar este no es el caso, lo que se conoce acerca de la estructura molecular de la glicocálix sugiere que ésta es probablemente una simplificación excesiva. De hecho, el glicocáliz es un complejo y variadoestructura en la superficie de las células. Se compone de estructuras moleculares orientadas, carece de un límite exterior bien definido, y es probable que se vuelve más denso cerca de la superficie de la célula. Así, mientras que el modelo elástico de dos capas utilizado aquí proporciona una visión sobre la rigidez relativa de la glicocálix observado por las células circulantes, futuros estudios podrían explorar alternativas descripciones mecánicas que pueden explicar su anisotropía posible y densidad variable en la dirección del espesor. También es posible que el glicocáliz no es uniforme a través de las diferentes regiones de la superficie celular. Esto no habría sido evidente a partir de los datos actuales que figuran porque todos los datos que se presentan aquí fueron tomadas en la región central de la célula alrededor del núcleo.

El glicocálix también puede presentar propiedades viscoelásticas que no fueron investigados en este estudio. Se ha observado que, en condiciones estáticas, las células rojas de la sangre en los capilares puede comprimir completamente el glucocáliz, wheres circulantelas células rojas de la sangre no ^10. Fuerzas generadas por las células rojas son estáticos probable que sea extremadamente pequeño (~ 3-10 Pa). Esto indica que el glicocáliz puede ser muy suave en respuesta a la compresión lenta, pero significativamente más rígido durante una compresión más rápida. Nuestras mediciones se realizaron a las tasas de indentación de 1 m / seg para simular la rigidez de una célula circulante puede encontrar, pero un mayor trabajo para investigar las propiedades dependientes del tiempo en curso.

Indentación AFM ha sido utilizado para medir directamente el módulo de elasticidad y espesor de la glicocálix endotelial en células vivas. Las mediciones indican que el glicocáliz puede ser una barrera significativa para el contacto célula-célula y la adhesión y probablemente sirve como un factor clave en la regulación de la cascada de adhesión durante la inflamación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652