Kvantifiering De mekaniska egenskaperna hos den endoteliala glykokalyx med atomkraftsmikroskopi

Summary

De mekaniska egenskaperna hos endotel glykokalyx mättes med indrag hjälp micron storlek sfärer på AFM utliggare. Endotelceller odlades i en anpassad kammare under fysiologiska flödesbetingelser att inducera uttryck glykokalyx. Data analyserades med användning av en tunn film modell för att bestämma den glykokalyxen tjocklek och modul.

Abstract

Vår förståelse av växelverkan mellan leukocyter och kärlväggen under leukocyt infångning begränsas av en ofullständig förståelse av de mekaniska egenskaperna hos den endoteliala ytskiktet. Det är känt att adhesionsmolekyler på leukocyter fördelas olikformigt i förhållande till yttopografi ^3, begränsar att topografin vidhäftande bindningsbildning med andra ytor ^9, och att fysiologiska kontaktkrafter (≈ 5,0 till 10,0 pN per microvillus) kan komprimera mikrovilli till som lite som en tredjedel av deras vilande längd, öka tillgängligheten av molekyler till den motstående ytan ^{3, 7.} Vi anser endotelet som en två-skiktad struktur, den relativt styva cellkroppen, plus glykocalyx, en mjuk skyddande sockerbeläggning på den luminala ytan ^6. Det har visats att glykocalyx kan verka som en barriär för att minska adhesionen av leukocyter till endotelytan ^4.I denna rapport har vi börjar ta itu med deformerbarheten av endotelceller ytor att förstå hur endotel mekaniska styvheten kan påverka bindningsbildning. Endotelceller odlade i statisk kultur uttrycker inte en robust glykokalyx, men celler som odlas under fysiologiska flödesbetingelser börjar approximera glykokalyx observerats in vivo ^2. Modulen av endotelcell organet har mätts med atomkraftsmikroskopi (AFM) för att vara ca 5 till 20 kPa ^5. Tjocklek och struktur glykocalyx har studerats med användning av elektronmikroskopi ^8, och modulen för glykocalyx har approximeras med indirekta metoder, men till vår kännedom, har inga publicerade rapporter om en direkt mätning av glykokalyx modulen i levande celler . I denna studie, presenterar vi indrag experiment gjorda med en ny sond AFM på celler som har odlats under förhållanden för att maximera deras glykocalyx uttryck att make direkta mätningar av modul och tjockleken av den endoteliala glykokalyx.

Protocol

1. Metoder

1,1 cellflödet kammare

En flödeskammare, som visas i figur 1, konstruerades så att celler kunde odlas under en skjuvning av 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ och överfördes sedan direkt till en asyl MFP3D AFM (Santa Barbara, CA).

1. Flödeskammaren har upprättats för experimentet genom att först rengöra glasskivor i piraya lösning (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ under 15 minuter och sedan tvätta dem med destillerat vatten. De gräddades därefter till torrt och överdragna med aminopropyltrietoxisilan (APTES) i en vakuumavsättning kammare.
2. En silikon packning skars med en Silhouette SD skärverktyg. Detta tillät oss att fint styra dimensionerna flödeskammare för styrning av flödeshastigheten och skjuvspänning under celltillväxt. Typiskt har en kanal skuren 6,4 mm bred med 19 mm lång från ett ark av 0,4 mm silikon. Flödet som krävs för att släktente en skjuvspänning av 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ beräknas under antagande laminärt flöde i en rektangulär kanal med ekvationen:

där Q är flödeshastigheten, är τ skjuvpåkänningen, är μ viskositeten hos mediet, antas här vara 1,0 mPa (0,01 dyn * sek / cm ^2), h är höjden och w är bredden av flödeskammaren .

3. Den övre delen av flödet kammaren i linje med packningen i cellen odlingsskål och fästs med en magnetisk ring. Aggregatet fylldes med isopropylalkohol (IPA) för sterilisering.
4. Det fullflödessystem monterades. Flödet hamnar i cellodling skålen var kopplade till trevägsventiler. Ventilerna var anslutna till öppna 30 ml sprutas.. IPA spolades genom systemet, som därefter tvättades med 30 ml McCoys medium med 4% fetalt kalvserum (FCS). Systemet fylldes sedan med 20 ml av Vec Technologies cellodlingsmedium. Omslag placerades på toppen av sprutorna. Fångsten reservoar spruta lock hade en nål på plats för att flytta medel tillbaka till fodret reservoaren. Sterila 0,2 pm filter fästes till luftinloppen i omslag för att förhindra kontaminering av systemet. Flödeskammaren var sedan färdig för cellsådd.

1,2 Cellodling

1. Humana umbilikala venendotelceller (HUVEC) och odlingsmediet köptes från Vec Technologies (Rensselaer, NY) och odlades till konfluens i en T25 kolv.
2. Odlingsmediet avlägsnades från kolven och monoskiktet av celler frigörs med 2 ml 2,5% trypsin. När cellerna var i lösning, var trypsinisering släcktes med tillsats av 10 ml av cellodlingsmedium till kolven.
3. The cellsuspensionen centrifugerades under 5 min och supernatanten avlägsnades. Cellerna återsuspenderades i 1 ml cellodlingsmedium (innehållande serum) för injektion in i flödeskammaren.
4. Cellsuspensionen (0,5 ml, ~ 50.000 celler) laddades i en spruta och sprutas in i flödeskammaren genom en trevägsventil.
5. Cellerna tilläts sedimentera och vidhäfta glassubstratet under 2 timmar innan flödet började. Cellerna odlades under flöde i en inkubator vid 37 ° C under 1 till 5 dagar tills sammanflytande.

1,3 Cantilever Förberedelser och Cell indrag

1. Tipless AFM konsoler (nanoworld, Schweiz) rengjordes i salpetersyra under 5 min och funktionaliserad med aminopropyltrietoxisilan (APTES) i en ångavsättning kammare.
2. En lösning av 5 mg / ml genom vikt NHS-sulfo-LC-biotin i Hanks buffrade saltlösning (HBSS) framställdes. De utliggare nedsänktes i lösningen under 15 min till conjugrind silanen med N-hydroxisuccinimid (NHS) kemi.
3. En lösning av biotin medium framställdes genom att inkubera 20 ml Vec Technologies cellodlingsmedium (inklusive serum) med 200 pl streptavadin pärlor för 12 timmar. Pärlorna avlägsnades från mediet med en magnet och mediet filtrerades genom ett 0,22 | im sterilt filter.
4. Flödeskammaren avlägsnades från cellodlingen skålen och cellerna tvättades i 37 ° C biotin-fritt medium.
5. En förrådslösning av 1 pl 2,4 um pärlor belagda med streptavidin i 1 ml av biotin medium bereddes, och 100 pl av beståndet sattes till cellodlingen skålen.
6. Streptavidinpärloma plockades upp med fribärande genom landa spetsen på glasytan bredvid en pärla, tillbakadragande, placera spetsen på fribärande över pärlan, och sedan trycka på fribärande ned på pärla och vila i flera sekunder.
7. Känsligheten hos den fribärande var åtgärdend genom indrag på en region av nakna glas och använda lutningen av kurvan för att ställa in spetsen böjningen som en funktion av spänning.
8. Fjäderkonstanten av konsolen beräknades sedan från en termisk kalibrering i MFP3D mjukvaran.
9. Den kalibrerade fribärande användes sedan för att stycket proverna, såsom visas i figur 2. Dessa 2,4 um pärlor ger en större kontaktyta med cellytan så att de mekaniska egenskaperna hos mjuka glykokalyx skiktet kan detekteras. Den fribärande placerades över en cell i närheten av cellkärnan och en mjuk inställning av spetsen på cellen användes för att ställa in den fribärande höjd approximativt 3 pm ovanför cellytan. Programvaran fastställdes till 20 upprepade intryckningar med en hastighet av 1 um / sek till en maximal kraft på 7 NN. Ca 6 sekunder förflutit mellan successiva kontakter. Det är möjligt att använda olika hastigheter för indrag att testa för tidsberoende egenskaper hos glykocalyx, även om dessa initialt experiment, endast en enda fördjupning hastighet (1 ^ m / sek) användes.

2. Indrag Teori

Fördjupning i en elastisk halv-utrymme med en sfär med radien R kan beskrivas med Hertz teori där kraft indrag, f, kan beräknas genom ekvationen:

Där δ är indraget djup och E * är den reducerade modulen av materialet under test (figur 3). I fallet med en oändligt styv inträngare träffar en enhetlig elastisk halv-rymden, är E * ges av ekvationen:

3/50163eq3.jpg "/>
där E ​​är elasticitetsmodulen och ν är Poissons tal av materialet. Färskt arbete med polymer film har inspirerat utvecklingen av en tvålagers modell för att bestämma modulen och tjockleken av tunna filmer ^1. Vi tillämpar denna modell till cellbiologi genom att behandla glykocalyx som en enhetlig tunn mjuk film på ytan av cellkroppen. Med användning av denna modell, blir den reducerade modulen i systemet:

Där E _GC är modulen för glykokalyx, är _E-cell modulen hos cellkroppen, P, Q och n är konstanter, som har empiriskt bestämts från polymeren passar, och z ges av ekvationen:

Där t är tjockleken av skiktet glykokalyx. En schematisk bild av dessa parametrar visas i figur 3. Modellen har visat sig vara ett korrekt sätt att bestämma modulen och tjockleken av en tunn film på styvare substratet ^1. Denna ekvation kan användas för att passa kurvorna erhållna från fördjupning i celler för att bestämma modulen och tjockleken av den endoteliala glykokalyx, såsom visas i figur 4.

Representative Results

I ett typiskt experiment, var 20 kraft-mot-avstånd kurvor erhållna från en viss region av cellen, typiskt i den perinukleära regionen, nära, men inte på, kärnan (inom ~ 2 um). Kurvorna anpassades med hänsyn till eventuellt prov avdrift under hela mätningen och sedan medelvärdet för avlägsnande fribärande brus, såsom visas i figur 4. Kurvorna analyserades och passar med två skikt modell som utvecklats för att bestämma modulen och tjockleken av den tunna polymerfilmer ^1. Från anfall av kurvorna i 25 celler, har vi fastställt att modulen för den luminala skiktet är 0,7 ± 0,5 kPa och tjockleken är 380 ± 50 nm, såsom visas i fig 5. Modulen hos cellkroppen är 16 ± 6 kPa. Dessa värden är i god överensstämmelse med tidigare mätningar av modul av cellkroppen och tjocklek glykokalyx ^{5, 8.}

Figur 1. Vår cellodlingsanordning. Flöde över kammaren drevs genom gravitation från behållaren A till C. Cellerna ströks ut i den slutna kammaren B som hölls med magneter till ytan av en slutna celler skålen för en asyl AFM (asyl, Santa Barbara CA ). Trevägsventiler på B möjligt för oss att stoppa flödet. En silikonpackning skapade en flödeskanal 6,4 mm bred 19 mm lång med 0,4 mm hög. Den slutna kammaren B var lätt bort och slutna celler skålen flyttade direkt i AFM för experiment. Höjdskillnaden D bibehölls genom pumpa fluidum från behållaren C till A med en peristaltisk pump (ej visad). Hela aggregatet placerades i en inkubator under hela cellkulturen.

Figur 2 Vänster:. Bild av en fribärande med en 2,4xm vulst (pil) fäst med en biotin-streptavidin-bindning. Höger: monolager av HUVEC odlade under flöde.

Figur 3. Geometri av samverkan av vulsten med radien R indrag en sträcka δ i cellen. De glykocalyx, visas i grönt, har en modul av E _GC och en tjocklek t. Cellkroppen har en E-modul _cell. Den kraft som appliceras av vulsten till cellen, F, mäts och kraft mot avstånd kurva, som visas i fig 4, erhålls.

Figur 4. Den genomsnittliga kraft mot kurvan för en fördjupning i en cell plottas i rött. En individuell fördjupning visas i insättningen. Markerad i bilden är kontaktpunkten, där fribärande 1:e vidrör den luminala ytan, den luminala skiktet, där lutningen av kurvan domineras av styvheten hos glykocalyx, och cellkroppen, där lutningen är primärt en funktion av cell kroppen modul. Den anpassade kurvan från två skikt indrag teori visas i blått, och passningen för den enklare Hertz modellen för en elastisk halv utrymme visas genom den prickade svarta linjen. Det fanns fyra fria parametrar i två skikt passar. Värden som fastställts för denna passform var: cell modul = 15,9 kPa, luminala lager modul = 0,33 kPa och luminala lager tjocklek = 420 nm. Den fjärde monteras parametern är kontaktpunkt med glykokalyx. Placering av x-axeln ursprung i förhållande till cellytan är godtyckligt. Klicka här för att se större bild .

5 "fo: content-width =" 5.5in "FO: src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpg "/>
Figur 5. Histogram av egenskaperna hos 25 celler från kurvan passar Vänster:. E _GC fastställdes vara 0,7 ± 0,5 kPa. Höger: tjocklek glykocalyx bestämdes till 380 ± 50 nm.

Discussion

Vi använde värden beräknade från två skikt modell och Hertz teori att modellera interaktionen av en leukocyt som cirkulerar i blodet med den endoteliala väggen. Vi har räknat ut att en microvillus på leukocyt med en diameter av 50 nm under en 10 pN belastning skulle strecksatsen ungefär 150 nm i glykocalyx, endast en bråkdel av den totala tjockleken. Detta tyder på att glykocalyx, med egenskaper som mäts i detta experiment, är ett betydande hinder för cell-cell-interaktion och kan vara en stor steriskt hinder som cellerna måste övervinna under vidhäftningen kaskad under leukocytadhesion.

I modellen används här, vi approximera glykokalyx som ett isotropt elastisk struktur. Även om vi är medvetna om några mekaniska mätningar för att indikera detta inte är fallet, vad som är känt om den molekylära strukturen i glykokalyx tyder på att detta är sannolikt en förenkling. I själva verket är glykocalyx en komplex och varieradstruktur på ytan av celler. Den består av orienterade molekylära strukturer, saknar en väldefinierad yttre gräns, och sannolikt blir tätare nära cellytan. Sålunda, medan den två-skiktade elastisk modell som används här ger en inblick i den relativa styvheten av glykocalyx observeras genom cirkulerande celler kan framtida studier undersöka alternativa mekaniska beskrivningar som kan stå för dess möjliga anisotropi och varierande densitet i tjockleksriktningen. Det är också möjligt att glykokalyx är inte enhetliga i olika regioner i cellytan. Detta skulle inte ha varit uppenbart från de uppsatta presentera data eftersom alla data som presenteras här togs i de centrala delarna av cellens runt kärnan.

Den glykocalyx kan också uppvisa viskoelastiska egenskaper som inte undersöktes i denna studie. Det har observerats att under statiska förhållanden, kan röda blodkroppar i kapillärerna helt komprimera glykokalyx, wheres cirkuleranderöda blodkroppar inte ^10. Krafter som genereras av statiska röda celler kommer sannolikt att vara mycket liten (~ 3-10 Pa). Detta indikerar glykokalyx kan vara mycket mjuk som svar på långsam kompression, men betydligt styvare under snabbare komprimering. Våra mätningar utfördes vid indrag andelen en um / s för att simulera styvheten en cirkulerande cell kan stöta, men ytterligare arbete för att undersöka de tidsberoende egenskaper pågår.

AFM fördjupning har använts för att direkt mäta modul och tjockleken av det endoteliala glykokalyx i levande celler. Mätningarna visar att glykokalyx kan vara ett betydande hinder för cell-cell kontakt och vidhäftning och sannolikt fungerar som en viktig faktor för att reglera vidhäftningen kaskad vid inflammation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652