Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии

Summary

Механические свойства эндотелиальных гликокаликса были измерены отступ использованием микронных размеров сферы на консоли АСМ. Эндотелиальные клетки культивировали в пользовательской камеры в физиологических условиях потока, чтобы вызвать гликокаликса выражение. Данные были проанализированы с помощью тонкой моделью фильм для определения толщины и гликокаликса модуля.

Abstract

Наше понимание взаимодействия лейкоцитов и стенки сосуда во время захвата лейкоцитов ограничен неполное понимание механических свойств эндотелия поверхностного слоя. Известно, что молекулы адгезии на лейкоцитах распределены неравномерно по отношению к топографии поверхности ^3, рельеф ограничивает клей формирование связей с другими поверхностями ^9, и что физиологические силы контакта (≈ 5,0 - 10,0 пН в микроворсинок) может сжимать микроворсинки как лишь треть их длины покоя, повышение доступности молекул на противоположной поверхности ^{3, 7.} Рассмотрим, как эндотелий двухслойной структурой, относительно жесткой тела клетки, а также гликокаликса, мягкий защитный слой сахара на просвет поверхность ^6. Было показано, что гликокаликса может выступать в качестве барьера для уменьшения адгезии лейкоцитов к эндотелиальной поверхности ^4.В этом докладе мы приступить к решению деформируемость поверхности эндотелиальных понять, как эндотелиальные механическая жесткость может повлиять на образовании связи. Эндотелиальных клеток, выращенных в культуре статического не выражают надежные гликокаликса, но клетки, выращенные в физиологических условиях потока начинают приближенных гликокаликса наблюдается в естественных условиях ^2. Модуль эндотелиальные клетки тела были измерены с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) составляет примерно от 5 до 20 кПа ^5. Толщина и структура гликокаликса были изучены с помощью электронного микроскопа ⁸ и модуль гликокаликса были аппроксимированы с использованием косвенных методов, но насколько нам известно, не было никаких опубликованных отчетов прямого измерения модуля гликокаликса в живых клетках . В этом исследовании мы представляем отступ эксперименты с новым АСМ зонда на клетки, которые культивировались в условиях максимизировать свои гликокаликса выражение маке прямые измерения модуля упругости и толщины эндотелиального гликокаликса.

Protocol

1. Методика

1,1 Проточная ячейка палата

Проточной камеры, как показано на рисунке 1, была построена так, что клетки могут быть выращены при сдвиге от 1,0 Па (10 дин / см ^2), а затем передаются непосредственно в убежище MFP3D AFM (Санта-Барбара, Калифорния).

1. Проточная камера была подготовлена ​​для проведения эксперимента по первому очистки стекла слайды в пираньи решение (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ в течение 15 минут, а затем вымойте их с дистиллированной водой. Затем они были запеченные в сухом и покрытые аминопропил триэтокси силана (APTES) в камере вакуумного напыления.
2. Прокладка силиконовая было сокращено использование режущего инструмента Silhouette SD. Это позволило нам точно управлять потоком размеры камеры для контроля расхода и напряжения сдвига в процессе клеточного роста. Как правило, канал был сокращен 6,4 мм шириной и длиной 19 мм из листа 0,4 мм силикон. Расход необходимо родовТе напряжения сдвига от 1,0 Па (10 дин / см ^2), рассчитаны исходя из ламинарного потока в прямоугольном канале с уравнением:

где Q является расходом, τ является напряжение сдвига, μ-вязкость среды, предполагается здесь, чтобы быть 1,0 МПа (0,01 дин * сек / см ^2), Н-высота и W-ширина потока камеры .

3. Верхняя часть потока камера была приведена в соответствие с прокладкой в ​​блюдо клеточной культуры и крепится с помощью магнитного кольца. Сборка была наполнена изопропилового спирта (IPA) для стерилизации.
4. Система полного потока была собрана. Поток портов в блюдо клеточной культуры были связаны с трехходовыми клапанами. Клапаны были связаны открыть 30 мл шприцас. IPA продувают через систему, которую затем промывают 30 мл среды Маккоя с 4% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Эта система была затем заполняют 20 мл ячейки Vec среднего роста технологий. Материалы были размещены на вершинах шприцы. Шприц вылов резервуара крышка была иглу в место для перемещения средних обратно в канал водохранилища. Стерильные фильтры 0,2 мкм были прикреплены к воздухозаборники в крышке для предотвращения загрязнения системы. Проточная камера была готова к клетке посева.

1,2 культуре клеток

1. Человека эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVEC) и рост средней были приобретены у Vec технологий (Rensselaer, Нью-Йорк) и выращивали до слияния в T25 Flask.
2. Рост среду удаляли из колбы и монослоя клеток выпущен с 2 мл 2,5% трипсина. Как только клетки в раствор, трипсинизации гасили добавлением 10 мл клеточной культуральной среде в колбу.
3. ThПодвеска электронной клетки центрифугировали в течение 5 мин и супернатант удаляли. Клетки суспендируют в 1 мл клеточной культуральной среде (содержащей сыворотки) для инъекций в проточной камеры.
4. Суспензию клеток (0,5 мл, ~ 50000 клеток) была загружена в шприц и вводят в поток камеру через трехходовой клапан.
5. Эти клетки дают отстояться и присоединиться к стеклянной подложке в течение 2 часов, прежде чем поток был запущен. Клетки, выращенные в поток в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение от 1 до 5 дней, пока не вырожденная.

1.3 Подготовка Консольные и сотовый отступов

1. Tipless AFM консолей (наномира, Швейцария) были убраны в азотной кислоте в течение 5 мин и функционализированных аминопропил триэтокси силана (APTES) в камере осаждения из паровой фазы.
2. Раствор 5 мг / мл по весу NHS-сульфо-LC-биотин в буферном солевом растворе Хэнка (HBSS) был подготовлен. Консолей были погружены в раствор на 15 минут, чтобы сопряженныхВорота силана с N-гидроксисукцинимида (NHS) химии.
3. Решение биотин среде, свободной была сделана путем инкубации 20 мл Век технологий клеточной культуры средой (в том числе сыворотки) с 200 мкл streptavadin бусины в течение 12 часов. Бусины были выведены из среды с магнитом и среднего фильтровали через 0,22 мкм стерильный фильтр.
4. Проточной камеры был снят с блюдом культуре клеток и клетки промывали в 37 ° C биотин-бесплатная среда.
5. Маточный раствор из 1 мкл 2,4 мкм шарики, покрытые стрептавидином в 1 мл среды биотин бесплатно был подготовлен, и 100 мкл фондовый был добавлен в блюдо клеточной культуры.
6. Стрептавидин бисером были подобраны с консольной при посадке кончик на поверхности стекла рядом с бисером, втягивания, позиционируя вершине консольные за борт, а затем нажать консоли вниз на борт и отдыха в течение нескольких секунд.
7. Чувствительность консольной была мераD с помощью отступов на область голом стекле и с помощью наклона кривой, чтобы установить наконечник отклонения в зависимости от напряжения.
8. Весной кантилевера Затем рассчитывается от теплового калибровки в MFP3D программного обеспечения.
9. Калиброванные консольные затем был использован для отступа образцов, как показано на рисунке 2. Эти бусины 2,4 мкм предлагают большую площадь контакта с поверхностью клетки таким образом, что механические свойства мягкого слоя гликокаликса могут быть обнаружены. Кантилевера была расположена над клеткой вблизи ядра клетки и мягкий подход кончика на ячейки используются для установки консольных высоте примерно 3 мкм над поверхностью клетки. Программное обеспечение было установлено на 20 повторяют углубления со скоростью 1 мкм / сек до максимальной силы из 7 нн. Около 6 секунд, прошедшее между последовательными контактами. Можно использовать различные темпы углубления для проверки зависящих от времени свойств гликокаликса, хотя в этих первоначальных Эксперименты, только единая ставка отступ (1 мкм / сек) была использована.

2. Отступы теории

Отступы в упругое полупространство с шар радиуса R может быть описана с помощью теории Герца, где сила отступы, F, определяется по формуле:

Там, где δ является глубина отступа и Е * приведенный модуль испытуемого материала (рис. 3). В случае бесконечно жесткой индентора падающих равномерное упругое полупространство, E * задается уравнением:

3/50163eq3.jpg "/>
где Е-модуль упругости и ν является коэффициент Пуассона материала. Недавние работы с полимерными пленками вдохновил развитие двухслойной модели для определения модуля упругости и толщины тонких пленок ^1. Мы применяем эту модель клеточной биологии, рассматривая гликокаликса как единый тонкой мягкой пленки на поверхности клетки тела. Используя эту модель, приведенного модуля системы становится:

Где E _{GC-модуль} гликокаликса, E _ячейки модуля тела клетки, P, Q и п-константы, которые были определены эмпирически из полимера подходит, и г задается уравнением:

Где Т-толщина слоя гликокаликса. Схема этих параметров показан на рисунке 3. Модель была показана, чтобы быть точным способом определения модуля и толщину тонкой пленки на жесткой подложке ^1. Это уравнение может быть использовано в соответствии с кривыми, полученными от отступа в клетки, чтобы определить модуль и толщина эндотелия гликокаликса, как показано на рисунке 4.

Representative Results

В типичном эксперименте, 20 силы против расстоянии кривые были получены от определенного региона клетки, как правило, в перинуклеарной области, рядом, но не на, ядра (в пределах ~ 2 мкм). Кривые были выровнены по счету за любой образец дрейф в течение периода измерения и затем усредняются, чтобы удалить консольные шума, как показано на рисунке 4. Кривые были проанализированы и согласуются с двухслойной модели, которая была разработана для определения модуля упругости и толщины тонких полимерных пленок ^1. От приступов кривые 25 клеток, мы определили, что модуль просвета слоя составляет 0,7 ± 0,5 кПа, а толщина составляет 380 ± 50 нм, как показано на рисунке 5. Модуль тела клетки составляет 16 ± 6 кПа. Эти значения находятся в хорошем согласии с предыдущими измерениями модуля тела клетки и толщина гликокаликса ^{5, 8.}

Рисунок 1. Наша культура клеток устройство. Потока через камеру был обусловлен тяжести с резервуаром для С. Клетки высевали в замкнутой камере, которая была проведена с магнитами на поверхности закрытой посуде ячейки для Asylum AFM (Asylum, Santa Barbara CA ). Трехходовые клапаны на B позволили нам остановить поток. Силиконовая прокладка создан поток канала 6,4 мм шириной и длиной 19 мм на 0,4 мм. В закрытой камере было легко снимается и закрытой посуде клетки переехал непосредственно в AFM для экспериментов. Перепад высот D поддерживается путем откачки жидкости из резервуара C, чтобы с использованием перистальтического насоса (не показан). Вся сборка была помещена в инкубатор на протяжении культуре клеток.

Рисунок 2. Слева: Изображение кантилевера с 2,4мкм шарик (стрелка) придает биотин-стрептавидин связи. Справа: монослой HUVECs, выращенных в потоке.

Рисунок 3. Геометрия взаимодействия шарика радиуса R отступом на расстояние δ в клетку. Гликокаликса, показаны зеленым цветом, имеет модуль E _GC и толщиной тонн. Тело клетки имеет модуль _ячейки E. Сила, приложенная на борт в клетку, F, измеряется и силы от расстояния кривой, изображенной на рисунке 4, получается.

Рисунок 4. Среднее усилие в зависимости от расстояния кривой для отступа в ячейке укладывается в красный цвет. Отдельные углубления показано на вставке. Выделенные в изображении точки контакта, где кантилевера впервые касается просвета поверхность, просвета слое, где наклон кривой доминирует жесткость гликокаликса, и клетки тела, где склон, прежде всего, функции клеточных тело модуля. Оборудованная кривой из двухслойного углубление теории показаны синим цветом, и подходит для простых Hertz модель для упругого полупространства показана пунктирной черной линией. Были четыре свободных параметров в два слоя припадки. Значения определены для данного подходит были: клетки модуль = 15,9 кПа, просвета слой модуля = 0,33 кПа, и просвета толщина слоя = 420 нм. Четвертый параметр оборудованная точка контакта с гликокаликса. Позиционирование оси х происхождения по отношению к клеточной поверхности является произвольным. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

5 "FO: содержание ширина =" 5.5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50163/50163fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Гистограммы свойства 25 клеток от кривой припадки. Слева: E _GC была определена в 0,7 ± 0,5 кПа. Справа: толщина гликокаликса была определена в 380 ± 50 нм.

Discussion

Мы использовали значения, вычисленные из двухслойной модели и теории Герца для моделирования взаимодействия лейкоцитов, циркулирующих в крови с эндотелиальной стенкой. Мы подсчитали, что микроворсинок на лейкоциты с диаметром 50 нм при нагрузке в 10 пН бы отступ около 150 нм в гликокаликса, только часть от общей толщины. Это означает, что гликокаликса, со свойствами, измеренная в этом эксперименте, является существенным барьером для межклеточных взаимодействий и может быть большим стерических препятствий котором клетки должны преодолеть в течение адгезии каскада во время адгезии лейкоцитов.

В модели используется здесь, мы приближаем гликокаликса как изотропной упругой структурой. В то время как мы не знаем никаких механических измерений показывают, что это не так, то, что известно о молекулярной структуре гликокаликса предполагает, что это, скорее всего, чрезмерным упрощением. В самом деле, гликокаликса является сложной и разнообразнойструктуры на поверхности клеток. Он состоит из ориентированных молекулярных структур, не хватает четкой внешней границе, и, вероятно, становится более плотной близко к поверхности клетки. Таким образом, в то время как двухслойная упругая модель, используемая здесь, дает представление о относительной жесткости гликокаликса наблюдается циркулирующих клеток, будущие исследования могут изучить альтернативные механических характеристик, что может быть причиной его возможной анизотропии и различной плотности в направлении толщины. Возможно также, что гликокаликса не является равномерным в различных регионах клеточной поверхности. Это не было бы видно из полученных данных установлено, потому что все данные, представленные здесь, были взяты в центральной области клетки вокруг ядра.

Гликокаликса также могут проявляться вязко-упругих свойств, которые не были исследованы в данном исследовании. Было отмечено, что в статических условиях, красные клетки крови в капиллярах может полностью сжать гликокаликса, Wheres циркулирующихкрасные кровяные клетки не ^10. Сил, возникающих при статическом эритроцитов, вероятно, будет чрезвычайно мала (~ 3-10 Па). Это указывает на гликокаликса может быть очень мягким в ответ на медленном сжатии, но значительно быстрее жестких во время сжатия. Наши измерения проводились на углубление темпов 1 мкм / сек для имитации жесткости циркулирующие клетки могут столкнуться, но дальнейшие работы по расследованию зависящих от времени свойств в процессе.

AFM отступы были использованы для непосредственного измерения модуля упругости и толщины эндотелиальных гликокаликса в живых клетках. Измерения показывают, что гликокаликса может быть серьезным препятствием для межклеточного контакта и сцепление и, вероятно, служит одним из ключевых факторов в регуляции адгезии каскада при воспалении.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652