Summary
endothelial glycocalyx के यांत्रिक विशेषताओं AFM cantilevers पर माइक्रोन आकार क्षेत्रों का उपयोग खरोज द्वारा मापा गया. Endothelial कोशिकाओं शारीरिक प्रवाह की स्थिति के तहत एक कस्टम चैम्बर में सुसंस्कृत थे glycocalyx अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करना. डेटा एक पतली फिल्म मॉडल का उपयोग करने के लिए glycocalyx मोटाई और मापांक निर्धारित विश्लेषण किया गया.
Abstract
Leukocytes और ल्युकोसैट पकड़ने के दौरान पोत दीवार की बातचीत के बारे में हमारी समझ endothelial सतह परत के यांत्रिक गुणों की एक अधूरी समझ से सीमित है. यह ज्ञात है कि leukocytes आसंजन अणुओं गैर समान रूप से वितरित कर रहे हैं सतह 3 स्थलाकृति सापेक्ष कि स्थलाकृति अन्य 9 सतहों के साथ चिपकने वाला बंधन गठन की सीमा है, और है कि शारीरिक संपर्क बलों microvilli (≈ 5.0 microvillus प्रति 10.0 पी.एन.) के रूप में संक्षिप्त कर सकते हैं उनके आराम लंबाई का एक तिहाई, का विरोध सतह 3, 7 के अणुओं की पहुंच बढ़ रही है के रूप में छोटे. हम एक दो स्तरित संरचना, अपेक्षाकृत कठोर सेल शरीर, प्लस glycocalyx, एक नरम luminal 6 सतह पर सुरक्षात्मक चीनी कोटिंग के रूप में endothelium पर विचार करें. यह दिखाया गया है है कि glycocalyx endothelial सतह 4 leukocytes के आसंजन कम के लिए एक बाधा के रूप में कार्य कर सकते हैं.इस रिपोर्ट में हम endothelial सतहों की विरूपता को संबोधित करने के लिए शुरू समझने के लिए कैसे endothelial यांत्रिक कठोरता बंधन गठन को प्रभावित कर सकता है. Endothelial स्थिर संस्कृति में विकसित कोशिकाओं को एक मजबूत glycocalyx व्यक्त नहीं, लेकिन शारीरिक प्रवाह शर्तों के तहत विकसित कोशिकाओं लगभग 2 vivo में मनाया glycocalyx शुरू करने के लिए. endothelial सेल शरीर के मापांक परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) का उपयोग करने के लिए लगभग 5 से 20 5 kPa मापा गया है. मोटाई और glycocalyx की संरचना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग 8 का अध्ययन किया है, और glycocalyx के मापांक अप्रत्यक्ष तरीकों का उपयोग किया गया है approximated किया गया है, लेकिन हमारे ज्ञान करने के लिए, वहाँ glycocalyx मापांक का एक सीधा माप का कोई प्रकाशित रिपोर्ट जीवित कोशिकाओं में किया गया है . इस अध्ययन में, हम वर्तमान खरोज कोशिकाओं है कि परिस्थितियों में संवर्धित किया गया है माँ के लिए उनके glycocalyx अभिव्यक्ति को अधिकतम पर एक उपन्यास AFM जांच के साथ किए गए प्रयोगोंके और endothelial glycocalyx के मापांक मोटाई के प्रत्यक्ष माप.
Protocol
1. तरीके
1.1 सेल फ्लो चैंबर
एक प्रवाह कक्ष, 1 चित्र में दिखाया गया है, इतना है कि कोशिकाओं 1.0 पा (10 dyn / 2 सेमी) की एक कतरनी के तहत विकसित किया जा सकता है और फिर एक शरण MFP3D AFM (सांता बारबरा, CA) को सीधे हस्तांतरित का निर्माण किया गया था.
- 15 मिनट के लिए और फिर उन्हें आसुत पानी से धोने: प्रवाह चैम्बर पिरान्हा समाधान (एच 2 2 हे 03:01 एच 2 अतः 4) में 1 गिलास स्लाइड सफाई के द्वारा प्रयोग के लिए तैयार किया गया था. वे तो पके हुए थे सूखी और एक निर्वात चैम्बर में बयान aminopropyl silane triethoxy (APTES) के साथ लेपित.
- एक सिलिकॉन गैसकेट एक Silhouette एसडी काटने के उपकरण का उपयोग कर काट दिया गया. यह हमें पतले प्रवाह और सेल के विकास के दौरान कतरनी तनाव दर के नियंत्रण के लिए प्रवाह चैम्बर आयामों को नियंत्रित करने के लिए अनुमति दी. आमतौर पर, एक चैनल 0.4 मिमी सिलिकॉन के एक पत्रक से 19 मिमी लंबे से 6.4 मिमी चौड़े काट दिया गया. प्रवाह दर genera के लिए आवश्यक1.0 पा (10 dyn / 2 सेमी) के एक कतरनी तनाव समीकरण के साथ एक आयताकार चैनल में ते लामिना का प्रवाह संभालने गणना की है:
जहां क्यू प्रवाह की दर है, τ कतरनी तनाव है, μ माध्यम का चिपचिपापन है, यहाँ ग्रहण 1.0 Mpa (0.01 dyn * सेकंड / 2 सेमी), ज ऊंचाई है और w प्रवाह कक्ष की चौड़ाई है .
- प्रवाह चैम्बर के शीर्ष टुकड़ा सेल संस्कृति डिश में गैसकेट के साथ गठबंधन किया गया था और एक चुंबकीय अंगूठी के साथ सुरक्षित है. विधानसभा isopropyl शराब (आईपीए) के साथ नसबंदी के लिए भरा हुआ था.
- पूर्ण प्रवाह प्रणाली इकट्ठा किया गया था. सेल संस्कृति डिश में प्रवाह बंदरगाहों तीन तरह वाल्व से जुड़े थे. वाल्व को 30 मिलीलीटर सिरिंज खोलने के लिए जुड़े हुए थेहै. आइपीए प्रणाली है, जो फिर 4% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ किया गया था McCoy मध्यम के 30 मिलीलीटर के साथ धोया के माध्यम से प्लावित किया गया था. प्रणाली तो वीइसी प्रौद्योगिकी सेल के विकास के माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ भरा हुआ था. कवर सीरिंज के टॉप पर रखा गया है. पकड़ जलाशय सिरिंज टोपी जगह में एक सुई के लिए मध्यम फ़ीड जलाशय को वापस ले जाने के लिए किया था. बाँझ 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर कवर में हवा inlets से जुड़े थे प्रणाली के प्रदूषण को रोकने के लिए. प्रवाह चैम्बर तो सेल बोने के लिए तैयार था.
1.2 सेल संस्कृति
- मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVEC) और मध्यम विकास वीइसी टेक्नोलॉजीज (Rensselaer, एनवाई) से खरीदे गए थे और एक T25 फ्लास्क में संगम हो गई है.
- मध्यम विकास फ्लास्क और 2.5% trypsin के 2 मिलीलीटर के साथ जारी कक्षों की monolayer से हटा दिया गया था. एक बार कोशिकाओं समाधान में थे, trypsinization सेल संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर की कुप्पी के अलावा के साथ quenched किया गया था.
- गुई सेल निलंबन 5 मिनट के लिए centrifuged किया गया था और तैरनेवाला हटा दिया गया था. कोशिकाओं सेल प्रवाह चेंबर में इंजेक्शन के लिए संस्कृति के माध्यम (सीरम युक्त) के 1 मिलीलीटर में resuspended थे.
- सेल निलंबन (0.5 मिलीग्राम, ~ +५०००० कोशिकाओं) एक सिरिंज में लोड किया गया था और एक तीन तरह वाल्व के माध्यम से प्रवाह चेंबर में इंजेक्शन.
- कोशिकाओं को व्यवस्थित करने और ग्लास सब्सट्रेट का पालन करने से पहले 2 घंटे के लिए प्रवाह शुरू किया गया था की अनुमति दी गई. कोशिकाओं को एक मशीन में प्रवाह के तहत 37 में बड़े हो रहे थे मिला हुआ है जब तक 1 से 5 दिनों के लिए सी °.
1.3 ब्रैकट तैयारी और सेल इंडेंटेशन
- नाइट्रिक एसिड में Tipless AFM cantilevers (nanoworld, स्विट्जरलैंड) 5 मिनट के लिए साफ कर रहे थे और एक वाष्प जमाव कक्ष में aminopropyl silane triethoxy (APTES) functionalized साथ.
- 5 मिलीग्राम / एनएचएस - sulfo LC-बायोटिन वजन (HbSS) हांक Buffered नमक के घोल में तैयार किया गया था द्वारा मिलीलीटर की एक समाधान. cantilevers समाधान में conju करने के लिए 15 मिनट के लिए डूबे हुए थेफाटक N-Hydroxysuccinimide रसायन शास्त्र (एनएचएस) के साथ silane.
- बायोटिन मुक्त मध्यम के एक समाधान वीइसी प्रौद्योगिकी सेल संस्कृति मध्यम (सीरम सहित) के 12 घंटे के लिए streptavadin मोतियों की 200 μl के साथ 20 मिलीलीटर incubating द्वारा बनाया गया था. मोती माध्यम से एक चुंबक के साथ हटा दिया गया है और मध्यम एक 0.22 सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर्ड था.
- प्रवाह चैम्बर सेल संस्कृति डिश से हटा दिया गया था और कोशिकाओं 37 ° C बायोटिन मुक्त मध्यम में धोया गया.
- 2.4 सुक्ष्ममापी के साथ लेपित streptavidin बायोटिन माध्यम के 1 मिलीलीटर में मोतियों की 1 μl के एक शेयर समाधान के लिए तैयार किया गया था और स्टॉक की 100 μl सेल संस्कृति डिश के लिए जोड़ा गया है.
- Streptavidin मोती ब्रैकट के साथ कांच की सतह पर एक मनका retracting, अगले टिप लैंडिंग, मनका पर ब्रैकट के शीर्ष स्थिति, और फिर ब्रैकट मनका और के लिए आराम कर रही कई सेकंड पर नीचे दबाने के द्वारा उठाया गया था.
- ब्रैकट की संवेदनशीलता उपाय थाघ नंगे कांच के एक क्षेत्र पर indenting और वक्र के ढलान का उपयोग करने के लिए वोल्टेज के एक समारोह के रूप में टिप विक्षेपन सेट.
- ब्रैकट वसंत निरंतर तो MFP3D सॉफ्टवेयर में एक थर्मल अंशांकन से गणना की गई.
- calibrated ब्रैकट तो करने के लिए नमूनों को इंडेंट इस्तेमाल किया गया था, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. ये 2.4 सुक्ष्ममापी मोती एक बड़ा कोशिका की सतह के साथ संपर्क क्षेत्र इतना है कि नरम glycocalyx परत के यांत्रिक गुणों का पता लगाया जा सकता है प्रदान करते हैं. ब्रैकट सेल नाभिक और सेल पर टिप कोशिका की सतह से ऊपर लगभग 3 सुक्ष्ममापी ब्रैकट ऊंचाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था की एक नरम रुख के पास एक सेल में तैनात किया गया था. सॉफ्टवेयर 20 दोहराया indentations के लिए 1 सुक्ष्ममापी / सेकंड की दर पर एक 7 एनएन का एक अधिकतम शक्ति के लिए स्थापित किया गया था. लगभग 6 सेकंड लगातार संपर्कों के बीच गुजरे. यह संभव है इंडेंटेशन के अलग - अलग दरों का उपयोग glycocalyx के समय पर निर्भर संपत्तियों के लिए परीक्षण, हालांकि इन प्रारंभिक प्रयोगों, केवल एक खरोज दर (1 सुक्ष्ममापी / सेक) में इस्तेमाल किया गया था.
2. इंडेंटेशन थ्योरी
त्रिज्या आर के एक क्षेत्र के साथ एक लोचदार आधे अंतरिक्ष में इंडेंटेशन हर्ट्ज सिद्धांत जहां इंडेंटेशन के बल, एफ, समीकरण द्वारा दिया जाता है का उपयोग वर्णित किया जा सकता है:
कहाँ δ खरोज गहराई और ई * परीक्षण (चित्रा 3) के तहत सामग्री की कम मापांक है. एक असीम कड़ी एक वर्दी लोचदार आधा अंतरिक्ष impinging indenter के मामले में, ई * समीकरण द्वारा दिया जाता है:
/ 3/50163eq3.jpg ">
जहां ई लोचदार मापांक और ν पॉसों सामग्री का अनुपात है. बहुलक फिल्मों के साथ हाल ही में काम मापांक और पतली फिल्मों 1 मोटाई का निर्धारण करने के लिए एक दो परत मॉडल के विकास के लिए प्रेरित किया है. हम एक समान पतली नरम फिल्म के रूप में सेल शरीर की सतह पर glycocalyx इलाज द्वारा इस मॉडल कोशिका जीव विज्ञान के लिए आवेदन कर रहे हैं. इस मॉडल का उपयोग करना, प्रणाली के कम मापांक हो जाता है:
कहाँ ई जीसी glycocalyx के मापांक है, ई कोशिका सेल शरीर के मापांक, पी, क्यू, और n स्थिरांक जो empirically बहुलक फिट बैठता है से निर्धारित किया जाता है, और z समीकरण द्वारा दिया जाता है:
जहां टी glycocalyx परत की मोटाई है. इन मानकों में से एक योजनाबद्ध चित्रा 3 में दिखाया गया है. मॉडल stiffer 1 सब्सट्रेट पर मापांक और एक पतली फिल्म की मोटाई का निर्धारण करने का एक सही तरीका होना दिखाया गया है. इस समीकरण को कोशिकाओं में खरोज से प्राप्त घटता फिट करने के लिए और endothelial glycocalyx के मापांक मोटाई का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है.
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Representative Results
एक ठेठ प्रयोग में, 20 शक्ति बनाम दूरी घटता सेल के एक दिए गए क्षेत्र से प्राप्त किया गया है, perinuclear क्षेत्र में आम तौर पर निकट है, लेकिन नहीं, नाभिक (~ 2 सुक्ष्ममापी भीतर). घटता माप की अवधि के दौरान किसी भी नमूना बहाव के लिए खाते में गठबंधन किया गया और फिर ब्रैकट शोर को दूर करने के लिए औसत है, के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है. घटता विश्लेषण किया गया और दो परत मॉडल कि और पतली बहुलक फिल्मों के 1 मापांक मोटाई का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया था के साथ फिट है. 25 कोशिकाओं के घटता के दौरे से, हम निर्धारित किया है कि luminal परत के मापांक 0.7 ± 0.5 kPa है और मोटाई 380 ± 50 एनएम है, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है. सेल शरीर के मापांक 16 ± 6 kPa है. इन मूल्यों सेल शरीर और glycocalyx 5, 8 की मोटाई के मापांक के पिछले माप के साथ अच्छे समझौते में हैं.
चित्रा 1. हमारी संस्कृति सेल डिवाइस चैम्बर भर में प्रवाह जलाशय से गुरुत्वाकर्षण के द्वारा संचालित किया गया था एक बंद कक्ष बी जो मैग्नेट के साथ एक AFM शरण लिए एक बंद सेल डिश की सतह (शरण, सांता बारबरा सीए करने के लिए आयोजित की गई थी में सी. कोशिकाओं को चढ़ाया गया ). बी पर तीन तरह वाल्व हमें प्रवाह को रोकने के लिए सक्षम होना चाहिए. एक सिलिकॉन गैसकेट 0.4 मिमी उच्च द्वारा 19 मिमी लंबे द्वारा एक प्रवाह चैनल 6.4 मिमी चौड़े बनाया. बंद कक्ष बी आसानी से हटा दिया गया था और बंद सेल पकवान AFM में सीधे प्रयोग के लिए ले जाया गया. ऊंचाई अंतर डी जलाशय सी से एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (नहीं दिखाया गया है) के साथ तरल पदार्थ पम्पिंग द्वारा बनाए रखा गया था. पूरे विधानसभा सेल संस्कृति की अवधि के लिए एक मशीन में रखा गया था.
चित्रा 2 वाम: एक ब्रैकट 2.4 के साथ एक छविबायोटिन-streptavidin उठाना सुक्ष्ममापी मनका (तीर) संलग्न है. अधिकार: प्रवाह के तहत हो HUVECs की monolayer.
चित्रा 3. त्रिज्या सेल में एक दूरी δ indenting आर के मनका की बातचीत की ज्यामिति. Glycocalyx, हरे रंग में दिखाया गया है, ई जीसी के एक मापांक और मोटाई टी है. सेल शरीर एक मापांक ई सेल है. सेल, एफ, मनका द्वारा लागू बल मापा जाता है और बल बनाम दूरी वक्र, 4 चित्र में दिखाया गया है, प्राप्त की है.
चित्रा 4. एक सेल में एक खरोज के लिए दूरी वक्र बनाम औसत बल लाल रंग में साजिश रची है. एक व्यक्ति खरोज इनसेट में दिखाया गया है. हाइलाइटेड छवि में संपर्क बिंदु, जहां ब्रैकट 1 luminal सतह छू luminal परत है, जहां वक्र के ढलान glycocalyx की कठोरता का प्रभुत्व है, और सेल शरीर, जहां ढलान मुख्य रूप से सेल के एक समारोह है शरीर मापांक. खरोज दो परत सिद्धांत से सज्जित वक्र नीले रंग में दिखाया गया है, और एक लोचदार आधा अंतरिक्ष के लिए सरल हर्ट्ज मॉडल के लिए फिट डॉटेड काला लाइन के द्वारा दिखाया गया है. वहाँ दो परत फिट बैठता में चार स्वतंत्र पैरामीटर थे. यह विशेष रूप से फिट करने के लिए निर्धारित मूल्यों थे: सेल मापांक = 15.9 kPa, luminal परत मापांक = 0.33 kPa, और luminal परत मोटाई = 420 एनएम. 4 सज्जित पैरामीटर glycocalyx साथ संपर्क बिंदु है. मूल x-अक्ष कोशिका की सतह के लिए रिश्तेदार के पोजिशनिंग मनमाना है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 5. वक्र फिट बैठता से 25 कोशिकाओं के गुणों को वामपंथियों के Histograms: ई जीसी 0.7 ± 0.5 kPa होना निर्धारित किया गया था. अधिकार: glycocalyx की मोटाई 380 ± 50 एनएम होना निर्धारित किया गया था.
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Discussion
हम दो परत मॉडल और हर्ट्ज endothelial दीवार के साथ रक्त में परिसंचारी ल्युकोसैट की बातचीत मॉडल सिद्धांत से मूल्यों की गणना का इस्तेमाल किया. हम गणना की है कि 50 एनएम व्यास के साथ एक 10 पी.एन. लोड के तहत ल्युकोसैट पर एक microvillus glycocalyx में लगभग 150 एनएम इंडेंट, कुल मोटाई के केवल एक अंश. यह इंगित करता है कि गुण के रूप में इस प्रयोग में मापा के साथ glycocalyx, सेल सेल बातचीत के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा है और एक बड़े steric बाधा है जो कोशिकाओं ल्युकोसैट आसंजन दौरान आसंजन झरना के दौरान को दूर करना होगा हो सकता है.
मॉडल में यहां इस्तेमाल किया, हम एक isotropic लोचदार संरचना के रूप में glycocalyx अनुमानित है. हालांकि हम किसी भी यांत्रिक मापन के अनजान इंगित करने के लिए कर रहे हैं यह मामला नहीं है, glycocalyx की आणविक संरचना के बारे में जाना जाता है क्या पता चलता है कि यह संभावना एक से अधिक सरलीकरण है. वास्तव में, glycocalyx एक जटिल और विविध हैकोशिकाओं की सतह पर संरचना. यह उन्मुख आणविक संरचना के होते हैं, एक अच्छी तरह से परिभाषित बाहरी सीमा का अभाव है, और संभावना denser कोशिका की सतह के करीब हो जाता है. इस प्रकार, जबकि दो स्तरित लोचदार यहां इस्तेमाल किया मॉडल परिसंचारी कोशिकाओं द्वारा मनाया glycocalyx के रिश्तेदार कठोरता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, भविष्य के अध्ययन के वैकल्पिक यांत्रिक वर्णन है कि इसकी संभव anisotropy और मोटाई दिशा में अलग घनत्व के लिए खाते सकता का पता लगाने सकता है. यह भी संभव है कि glycocalyx कोशिका की सतह के विभिन्न क्षेत्रों में एक समान नहीं है. यह वर्तमान डेटा सेट से स्पष्ट नहीं किया गया है क्योंकि यहाँ प्रस्तुत सभी डेटा नाभिक के चारों ओर सेल के मध्य क्षेत्र में ले जाया गया होगा.
glycocalyx viscoelastic गुण भी प्रदर्शन कर सकते हैं कि इस अध्ययन में नहीं जांच की गई. यह देखा गया है कि, स्थिर शर्तों के तहत, capillaries में लाल रक्त कोशिकाओं को पूरी तरह से glycocalyx सेक कर सकते हैं wheres परिसंचारीलाल रक्त कोशिकाओं को 10 नहीं है. स्थैतिक लाल कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बलों अत्यंत छोटे हो (~ 3-10 पा) की संभावना हैं. यह इंगित करता है glycocalyx बहुत धीमी गति संपीड़न के जवाब में नरम है, लेकिन हो सकता है काफी तेजी से संपीड़न के दौरान stiffer. कठोरता एक परिसंचारी सेल का सामना कर सकते हैं अनुकरण के लिए 1 सुक्ष्ममापी / सेक के खरोज दरों पर माप का प्रदर्शन किया गया, लेकिन आगे काम के समय पर निर्भर गुणों की जांच करने के लिए कार्य प्रगति पर है.
AFM खरोज सीधे और जीवित कोशिकाओं में endothelial glycocalyx का मापांक मोटाई मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है. माप से संकेत मिलता है कि glycocalyx सेल सेल के संपर्क और आसंजन के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा हो सकता है और संभावना सूजन के दौरान आसंजन झरना को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में कार्य करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए इस परियोजना के साथ उनकी सहायता के लिए ऐलेना Lomakina, रिचर्ड Bauserman, मार्गरेट Youngman, शे Vaknin, जेसिका Snyder, क्रिस Striemer, नकुल नटराज, त्रिशंकु ली चुंग, तेजस Khire, और एरिक Lam धन्यवाद देना चाहूंगा. इस परियोजना # PO1 018208 HL NIH द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy's Medium | Gibco | 16600-082 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | SH30070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Vec Technologies | MCDB-131 | |
| Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Vec Technologies | PHUVEC/T-25 | |
| Sulfuric Acid | JT Baker | 9681-02 | |
| Hydrogen Peroxide | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Aldrich | 440140-100ML | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | BDH8999-4 | |
| Trypsin | Cellgro | 25-054-C1 | |
| Hank's Buffered Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| Streptavadin beads | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP-3D AFM | Asylum Research | ||
| Tipless Cantilevers | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| Silhouette SD | Quickutz | Silhouette-SD | |
| Silicone Rubber | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ml Syringes | Benton Dickinson | 309650 | |
| 18 gauge needles | Benton Dickinson | 305196 | |
| Extension Sets | Hospira | 4429-48 | |
| 4 way valves | Teleflex | W21372 | |
| Male/Female Port Caps | Smith’s Medical | MX491B | |
| Peristaltic Pump | Watson-Marlow | 401U/D | |
| Peristaltic Tubing | Watson-Marlow | 903.0016.016 | |
| sterile filters | Pall Life Science | 4652 |
References
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