Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Summary

Die mechanischen Eigenschaften von Endothelzellen Glykokalyx wurden durch Einrückung mit Mikrometer große Kugeln auf AFM Cantilever gemessen. Endothelzellen wurden in einem benutzerdefinierten Kammer unter physiologischen Bedingungen kultiviert, um die Strömung Glykocalix Expression zu induzieren. Daten wurden unter Verwendung eines Dünnfilm-Modell, um die Dicke und Elastizitätsmodul Glykocalix bestimmen.

Abstract

Unser Verständnis der Wechselwirkung von Leukozyten und der Gefäßwand während Leukozyten-Abscheidung wird durch eine unvollständige Verständnis der mechanischen Eigenschaften des endothelialen Oberflächenschicht begrenzt. Es ist bekannt, dass Adhäsionsmolekülen auf Leukozyten ungleichmäßig relativ Oberflächentopographie ³ verteilt, begrenzt, dass Topographie Klebeverbindung Formation mit anderen Oberflächen ^9, und dass physiologische Anpresskräfte (≈ 5,0 bis 10,0 pN pro Mikrovillus) können die Mikrovilli als komprimieren weniger als ein Drittel ihrer Ruhelänge, Erhöhung der Zugänglichkeit von Molekülen an die Gegenfläche ^{3, 7.} Wir betrachten das Endothel als Zwei-Schichtstruktur, der relativ starren Zellkörper, plus der Glykocalix, eine weiche Schutzschicht Zuckerdragierung auf der luminalen Oberfläche ^6. Es hat sich gezeigt, dass die Glykocalix kann als eine Barriere, um die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel Oberfläche ⁴ zu reduzieren handeln.In diesem Bericht werden wir damit beginnen, die Verformbarkeit der endothelialen Oberflächen behandeln zu verstehen, wie die endotheliale mechanische Steifigkeit könnte Bindung beeinflussen. Endothelzellen in statischer Kultur gezüchtet nicht Ausdruck eines robusten Glykokalyx, aber Zellen unter physiologischen Strömungsverhältnisse gewachsen beginnen ungefähre dem Glykokalyx in vivo ² beobachtet. Der Modul der Endothelzelle Körpers gemessen wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf etwa 5 bis 20 kPa ⁵ sein. Die Dicke und Struktur der Glykocalix wurden mittels Elektronenmikroskopie untersucht ^8, und der Modulus der Glykocalix wurde approximiert durch indirekte Methoden, aber nach unserem Wissen gibt es keine veröffentlichten Berichten einer direkten Messung der Glykocalix Modulus in lebenden Zellen . In dieser Studie zeigen wir Experimente Einbuchtung mit einem neuartigen AFM-Sonde auf Zellen, die unter Bedingungen kultiviert wurden, um ihre Expression zu ma Glycocalyx zu maximierenke direkte Messungen der Elastizitätsmodul und die Dicke des endothelialen Glykocalix.

Protocol

Ein. Methoden

1,1 Zelle Flusskammer

Ein Strömungskammer, in Abbildung 1 dargestellt, wurde so konstruiert, dass Zellen unter einer Scherung von 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ angebaut werden könnten und dann direkt mit einer Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA) transferiert.

1. Für 15 min und dann Waschen mit destilliertem Wasser: Die Strömungskammer wurde für den Versuch durch erste Reinigung der Glasträger in Piranhalösung (H ₂ O ₂ 03.01 H ₂ SO ₄₎ hergestellt. Sie wurden dann zu backenden trockenen und beschichtet mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in einem Vakuum-Abscheidungskammer.
2. Eine Silikondichtung geschnitten wurde mit einer Silhouette SD Schneidwerkzeug. Dies erlaubte uns, fein steuern die Strömungskammer Dimensionen zur Steuerung der Durchflussmenge und Scherbeanspruchung während des Zellwachstums. Typischerweise wurde eine 6,4 mm breite Kanal von 19 mm Länge aus einem Blech von 0,4 mm geschnitten Silikon. Der Durchfluss erforderlich Gattungente eine Schubspannung von 1,0 Pa (10 dyn / cm ²⁾ wird unter der Annahme berechnet laminare Strömung in einem rechteckigen Kanal mit der Gleichung:

wobei Q die Strömungsrate ist, τ die Scherspannung, μ die Viskosität des Mediums, hier angenommenen bis 1,0 mPa (0,01 dyn * sec / cm ²⁾ ist, h die Höhe und w die Breite der Strömungskammer .

3. Das obere Stück der Strömungskammer wurde mit der Dichtung in der Zellkulturschale ausgerichtet und befestigt mit einem Magnetring. Die Anordnung wurde mit Isopropylalkohol (IPA) für die Sterilisation gefüllt.
4. Der vollständige Flow-System montiert wurde. Die Strömungsöffnungen in der Zellkulturschale wurden Dreiwegeventile verbunden. Die Ventile wurden mit 30 ml Spritze öffnens. IPA wurde durch das System, das dann mit 30 ml McCoy-Medium mit 4% fötales Kälberserum (FCS) gewaschen wurde gespült. Das System wurde dann mit 20 ml der Vec Technologies Zellwachstumsmedium gefüllt. Covers wurden auf den Gipfeln der Spritzen gesetzt. Der Auffangbehälter Spritzenkappe hatte eine Nadel im Ort bis mittlere zurück an den Vorratsraum. Sterile 0,2 um Filter wurden auf den Lufteinlässen in den Deckeln angebracht, um eine Kontamination des Systems zu verhindern. Die Flusskammer war dann bereit für die Zell-Aussaat.

1,2 Cell Culture

1. Menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC'S) und Wachstumsmedium wurden aus Vec Technologies gekauft (Rensselaer, NY) und bis zur Konfluenz in einer T25-Flasche.
2. Das Wachstumsmedium wurde aus dem Kolben und der Monoschicht der Zellen mit 2 ml 2,5% Trypsin entfernt freigesetzt. Sobald die Zellen in Lösung waren, wurde die Trypsinierung durch Zugabe von 10 ml Zellkulturmedium in den Kolben gequencht.
3. The Zellsuspension wurde 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden in 1 ml Zellkulturmedium (mit Serum) zur Injektion in die Strömungskammer resuspendiert.
4. Die Zellsuspension (0,5 ml, ~ 50.000 Zellen) wurde in eine Spritze gefüllt und in die Strömungskammer durch eine Drei-Wege-Ventil.
5. Die Zellen konnten sich absetzen und sich an dem Glassubstrat für 2 Stunden vor dem Flow wurde gestartet. Die Zellen wurden unter Strömungsbedingungen in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 bis 5 Tage bis zur Konfluenz.

1,3 Cantilever Vorbereitung und Cell Einzug

1. Spitzenlose AFM Kragarme (NanoWorld, Schweiz) wurden in Salpetersäure für 5 min gereinigt und funktionalisiert mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in einer Dampfabscheidungskammer.
2. Eine Lösung von 5 mg / ml NHS Gew.-Sulfo-LC-Biotin in gepufferte Salz Hanks-Lösung (HBSS) wurde hergestellt. Die Ausleger wurden in die Lösung für 15 min bis konjugierte untergetauchtenTor das Silan mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) Chemie.
3. Eine Lösung von Biotin freiem Medium wurde durch Inkubation 20 ml Vec Technologies Zellkulturmedium (einschließlich Serum) mit 200 ul Streptavadin Perlen für 12 Stunden hergestellt. Die Perlen wurden vom Medium mit einem Magnet entfernt und das Medium wurde durch einen 0,22 um Sterilfilter filtriert.
4. Die Strömungskammer wurde aus der Zellkulturschale entnommen und die Zellen wurden in 37 ° C Biotin-freien Medium gewaschen.
5. Eine Stammlösung von 1 ul 2,4 um Perlen mit Streptavidin in 1 ml Biotin Medium beschichtet war bereit, und 100 ul der Aktie wurde auf der Zellkulturschale aufgenommen.
6. Streptavidin-Beads wurden mit dem Ausleger von der Landung die Spitze auf der Glasoberfläche neben einer Sicke, Zurückziehen, Positionieren der Spitze des Auslegers über den Wulst und dann Drücken des Auslegers nach unten auf die Sicke und ruhenden für mehrere Sekunden aufgenommen.
7. Die Empfindlichkeit des Auslegers war Maßnahmed durch Einrücken auf einen Bereich aus blankem Glas und unter Verwendung der Steigung der Kurve, um die Auslenkung der Spitze als eine Funktion der Spannung eingestellt.
8. Die Federkonstante des freitragenden wurde dann aus einem thermischen Kalibrierung im MFP3D Software berechnet.
9. Der kalibrierte Cantilever wurde dann verwendet, um Gedankenstrich der Proben, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese 2,4 um Perlen bieten eine größere Kontaktfläche mit der Zelloberfläche so dass die mechanischen Eigenschaften der weichmagnetischen Schicht Glykocalix detektiert werden kann. Der Cantilever wurde über eine Zelle nahe dem Zellkern und einem weichen Ansatz der Spitze auf der Zelle wurde verwendet, um den Cantilever Höhe etwa 3 um oberhalb der Zelloberfläche gesetzt positioniert. Die Software wurde für 20 wiederholt Vertiefungen mit einer Rate von 1 um / sec auf eine maximale Kraft von 7 nN eingestellt. Ungefähr 6 Sekunden zwischen den aufeinanderfolgenden Kontakten vergangen. Es ist möglich, unterschiedliche Raten der Einbuchtung verwenden, um für zeitabhängigen Eigenschaften der Glykocalix testen, obwohl in diesen anfänglichen Versuche, lediglich eine einzige Einbuchtung Rate (1 um / sec) wurde verwendet.

2. Einrückung Theory

Einbuchtung in einen elastischen Halbraum mit einer Kugel mit dem Radius R kann unter Verwendung Hertz Theorie wo die Kraft der Einbuchtung, F, durch die Gleichung gegeben ist:

Wobei δ die Eindringtiefe und E * die reduzierte Modul des Materials unter Test (Abbildung 3). Im Falle einer unendlich steif Eindringkörper Aufprallen eines einheitlichen elastischen Halbraum wird E * nach folgender Formel berechnet:

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wobei E der Elastizitätsmodul und ν ist die Poisson-Verhältnis des Materials. Neuere Arbeiten mit Polymerfilmen wurde die Entwicklung einer zweischichtigen Modell zur Bestimmung des Moduls und der Dicke von dünnen Filmen ¹ angeregt. Wir wenden dieses Modell auf Zellbiologie durch Behandeln der Glykocalix als einheitliche dünne weiche Folie auf der Oberfläche der Zelle Körper. Mit diesem Modell wird der reduzierte Elastizitätsmodul des Systems:

Wobei E _GC der Modul des Glykokalyx ist, E _Zelle der Modul des Zellkörpers ist, P, Q und n Konstanten sind, der empirisch aus dem Polymer passt bestimmt, und z durch die folgende Gleichung gegeben:

Wobei t die Dicke der Schicht Glykocalix. Eine schematische Darstellung dieser Parameter wird in 3 gezeigt. Das Modell wurde gezeigt, dass eine genaue Methode zur Bestimmung des Moduls und der Dicke eines dünnen Films auf Substrat ¹ steifer sein. Diese Gleichung kann verwendet werden, um die Kurven aus Einbuchtung in Zellen erhalten passen, um den Modul und die Dicke des endothelialen Glycocalyx zu bestimmen, wie in Abbildung 4 dargestellt.

Representative Results

In einem typischen Experiment wurden 20 Kraft-gegen-Entfernungskurven aus einem gegebenen Bereich der Zelle erhalten wird, typischerweise in der perinukleären Region, in der Nähe, aber nicht auf, den Kern (innerhalb ~ 2 um). Die Kurven wurden zur Berücksichtigung eines Probe Drift über die Dauer der Messung ausgerichtet und dann gemittelt, um Geräusche zu entfernen Cantilever, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Kurven wurden analysiert und passen mit den zwei Schichten-Modell, das zur Bestimmung des Moduls und der Dicke von dünnen Polymerfolien ¹ entwickelt wurde. Aus Passungen der Kurven der 25 Zellen, haben wir festgestellt, dass das Modul von der luminalen Schicht 0,7 ± 0,5 kPa ist und die Dicke beträgt 380 ± 50 nm, wie in 5 gezeigt. Der Modul des Zellkörpers beträgt 16 ± 6 kPa. Diese Werte sind in guter Übereinstimmung mit vorherigen Messungen des Modulus der Zellkörper und der Dicke der Glykocalix ^{5, 8.}

Abbildung 1. Unsere Zellkulturvorrichtung. Durchfluss durch die Kammer wurde durch die Schwerkraft aus dem Behälter getrieben A bis C. Die Zellen wurden in der geschlossenen Kammer B, die mit Magneten auf der Oberfläche einer Schale mit geschlossenen Zellen für eine Asylum AFM (Asylum, Santa Barbara CA gehalten wurde ausplattiert ). Drei-Wege-Ventile B ermöglichte es uns, den Fluss zu stoppen. Eine Silikondichtung erstellt einen Strömungskanal 6,4 mm breit und 19 mm lang und 0,4 mm hoch. Die geschlossene Kammer B wurde leicht entfernt und die geschlossenen Zellen Gericht zog direkt in die AFM für Experimente. Der Höhenunterschied D wurde durch Pumpen von Fluid aus dem Reservoir C nach A mit einer peristaltischen Pumpe (nicht gezeigt) gehalten. Die gesamte Anordnung wurde in einem Inkubator für die Dauer der Zellkultur gegeben.

Abbildung 2 links:. Das Bild eines Auslegers mit einem 2,4um Wulst (Pfeil) durch eine Biotin-Streptavidin-Bindung befestigt ist. Rechts: Monolayer von HUVECs unter Fluss gewachsen.

Abbildung 3. Geometrie der Wechselwirkung des Wulstes mit dem Radius R Eindrückelement einen Abstand δ in die Zelle. Die Glykocalix, grün dargestellt, hat ein Elastizitätsmodul von E _GC und eine Dicke t. Die Zellkörper einen Modul E _Zelle. Die Kraftübertragung von der Sicke zu der Zelle, F, angewendet wird gemessen und die Kraft-Weg-Kurve, in 4 gezeigt, erhalten wird.

Abbildung 4. Das gemittelte Kraft-Weg-Kurve für eine Vertiefung in eine Zelle ist in rot dargestellt. Eine individuelle Vertiefung in der Bildleiste dargestellt. Gesondert im Bild sind die Kontaktstelle, wobei das erste freitragende berührt die Lumenoberfläche der luminalen Schicht, wobei die Steigung der Kurve, die durch die Steifigkeit der Glykocalix dominiert wird, und die Zelle Körper, wo die Steigung ist in erster Linie eine Funktion der Zelle Körper Modul. Die angepasste Kurve von der Zwei-Schicht-Einzug Theorie ist in blau dargestellt, und die Passform für die einfachere Hertz-Modell für eine elastische Halbraum ist durch die gestrichelte schwarze Linie dargestellt. Es gab vier freie Parameter in den Zwei-Schicht-passt. Die Werte für diese besondere fit ermittelt wurden: cell Modul = 15,9 kPa, luminale Schicht Modul = 0,33 kPa und luminalen Schichtdicke = 420 nm. Die vierte ausgestattete Parameter ist der Berührungspunkt mit dem Glykokalyx. Die Positionierung der x-Achse Ursprung relativ zur Zelloberfläche ist beliebig. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 5. Histogramme von den Eigenschaften der Zellen, die aus den 25 Kurvenanpassungen. Links: E _GC wurde bestimmt auf 0,7 ± 0,5 kPa betragen. Rechts: Die Dicke der Glykocalix wurde zu 380 ± 50 nm betragen.

Discussion

Wir verwendeten Werte aus dem Zwei-Schichten-Modells und Hertz Theorie, um die Wechselwirkung eines Leukozyten im Blut zirkulierenden Endothelzellen mit der Wand Modell berechnet. Wir haben errechnet, daß eine auf der Mikrovillus Leukozyten mit einem Durchmesser von 50 nm unter einer 10 pN Last würde Gedankenstrich etwa 150 nm in die Glykocalix, nur einen Bruchteil der Gesamtdicke. Dies zeigt an, dass der Glykocalix, mit Eigenschaften wie in diesem Experiment gemessen, eine erhebliche Barriere für Zell-Zell-Wechselwirkung und können eine große sterische Hinderung, die die Zellen während des Adhäsionskaskade während Leukozytenadhäsion überwinden muss.

In dem hier verwendeten Modell, approximieren wir die Glycocalyx als isotrope elastische Struktur. Während wir keine Kenntnis von mechanischen Messungen, um anzuzeigen sind, ist dies nicht der Fall, was über die molekulare Struktur des Glykokalyx bekannt darauf hin, dass dies wahrscheinlich eine zu starke Vereinfachung. In der Tat ist die Glycocalyx einen komplexen und unterschiedlichenStruktur auf der Oberfläche von Zellen. Er besteht aus orientiertem Molekülstrukturen, fehlt eine wohldefinierte Außenbegrenzung und wahrscheinlich wird dichter Nähe der Zelloberfläche. Während also die zweischichtige elastische hier verwendete Modell gibt einen Einblick in die relative Steifheit der Glycocalyx von zirkulierenden Zellen beobachtet könnten künftige Studien erforschen alternative mechanische Beschreibungen, die für seine möglichen Anisotropie und unterschiedlicher Dichte in Dickenrichtung ausmachen kann. Es ist auch möglich, dass die Glykocalix nicht einheitlich ist in verschiedenen Regionen der Zelloberfläche. Dies wäre nicht ergeben sich aus den vorliegenden Daten gesetzt, da alle hier präsentierten Daten in der zentralen Region der Zelle um den Kern entnommen wurden.

Die Glycocalyx kann auch zeigen viskoelastischen Eigenschaften, die in dieser Studie nicht untersucht. Es wurde beobachtet, dass unter statischen Bedingungen, rote Blutkörperchen in den Kapillaren kann vollständig komprimieren die Glykocalix, wheres zirkulierendenroten Blutkörperchen nicht ^10. Kräfte, die durch statische roten Zellen erzeugt sind wahrscheinlich extrem klein (~ 3-10 Pa). Dies zeigt die Glykokalyx kann sehr weich in Reaktion auf langsame Kompression, aber deutlich steifer während schnellere Kompression. Unsere Messungen wurden bei Einzug Raten von 1 &mgr; m / sec durchgeführt, um die Steifigkeit eine zirkulierende Zellen auftreten können simulieren, sondern weiter daran arbeiten, die zeitabhängigen Eigenschaften zu untersuchen ist im Gange.

AFM Einbuchtung wurde verwendet, um direkt die Modul und Dicke der endothelialen Glykocalix in lebenden Zellen. Die Messungen zeigen, dass die Glykokalyx können ein erhebliches Hindernis für Zell-Zell-Kontakt und Adhäsion und wahrscheinlich dient als ein wichtiger Faktor bei der Regulierung der Adhäsionskaskade während der Entzündung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank's Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652