Summary
يوصف بروتوكول للتحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA) والإنتاجية العالية التدفق الخلوي لتقييم البوليمرية النانوية لتوصيل الجينات. ويستخدم لوصف NTA حجم الجسيمات جسيمات متناهية الصغر وتوزيع البلازميد توزيع الجسيمات في. الإنتاجية العالية التدفق الخلوي تمكن الكمي تقييم فعالية ترنسفكأيشن للمكتبة من المواد الحيوية لتوصيل الجينات.
Abstract
وقد برزت غير الفيروسية توصيل الجينات باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية كنهج جاذبية للعلاج بالجينات لعلاج الأمراض الوراثية (1) وبوصفها تكنولوجيا للطب التجديدي 2. على عكس الفيروسات، والتي لها قضايا السلامة كبيرة، ويمكن تصميم النانوية البوليمرية أن تكون غير سامة، غير مناعة، غير مطفرة وأسهل لتجميع، وتنوعا كيميائيا، قادرة على حمل أكبر البضائع القابلة للتحلل الحمض النووي وو / أو استجابة للبيئة. البوليمرات الموجبة الشحنة السالبة مع DNA عن طريق التفاعل الكهربائي لتشكيل مجمعات بناء على أمر من 100 نانومتر التي تسمى عادة النانوية البوليمرية النفس التجمع. أمثلة على المواد الحيوية المستخدمة لتشكيل البنى النانوية لتوصيل الجينات polycationic تشمل متعدد الليزين، polyphosphoesters، وبولي (amidoamines) ق وpolyethylenimine (PEI)، وهو غير القابلة للتحلل قبالة الجاهزة للاستخدام البوليمر الموجبة تستخدم عادة لتسليم الحمض النووي 1،3. بولي (بيتا الأمينيةاستر) ق (PBAEs) هي أحدث فئة من البوليمرات الموجبة 4 أن للتفكك وهيدروليكيا 5،6 وقد ثبت أن تكون فعالة في إيصال الجينات إلى أنواع الخلايا التي يصعب بالنقل مثل خلايا الشبكية البطانية الإنسان (HRECs) 7، الماوس الخلايا الظهارية الثديية 8، خلايا سرطان الدماغ 9 و الأوعية الكبيرة (الإنسان الوريد السري، HUVECs) الخلايا البطانية 10.
ووصف بروتوكول جديد لتوصيف جزيئات البوليمر باستخدام تحليل جسيمات متناهية الصغر تتبع (NTA). في هذا النهج، ويتم الحصول على كل حجم الجسيمات توزيع وتوزيع عدد من الجسيمات في البلازميدات 11. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم الإنتاجية العالية ترنسفكأيشن 96-وحة جيدا الفحص للكشف السريع للفعالية ترنسفكأيشن من الجسيمات النانوية البوليمرية. وتستخدم في هذا البروتوكول، وتستخدم بولي (بيتا الأمينية استر) ق (PBAEs) والبوليمرات ونموذج الإنسان الخلايا البطانية الشبكية (HRECs) كما موديل الخلايا البشرية. يمكن هذا البروتوكول تكيف بسهولة مع أي جسيمات متناهية الصغر البوليمرية تقييم وأي نوع من الخلايا في المصالح في شكل لوحة متعددة أيضا.
Introduction
تحديد عدد البلازميدات المعقد في جسيمات متناهية الصغر من المهم أن التصميم الفعال القائم على جسيمات متناهية الصغر لتوصيل الجينات الاستراتيجيات، وخاصة للتسليم المشترك من البلازميدات متعددة إلى نفس الخلية المستهدفة، كما هو مطلوب في كثير من الأحيان الخلايا الجذعية إعادة برمجة الدراسات 12. وقد وصفت بعض النهج لحساب عدد من البلازميدات المرتبطة جسيمات متناهية الصغر واحدة، ولكل النهج عيوب في التقنيات المستخدمة لتقدير 13-16. وقد استخدم الكم نقطة (QD) جنبا إلى جنب مع وضع العلامات TEM لتقدير البلازميدات في الجسيمات في الشيتوزان القائمة على الجسيمات النانوية. معقد تقدير مع هذه التقنية QD بسبب الحاجة لتسمية DNA، والتي قد تغير في خصائص التجميع الذاتي، واحتمال أن لا يتم الكشف عن الحمض النووي غير المسماة مغلفة مباشرة؛ البلازميدات يحتمل أن تكون متداخلة وQDs في الصور TEM 2D من الجسيمات، و الافتراضات الأخرى تبسيط 13. نهج بديل هو أنpplicable عندما microdomains أمر موجود في جزيئات وقد استخدمت لدراسة الحمض النووي المجمعات Lipopolyamine عبر المجهر الإلكتروني انتقال البرد (البرد TEM)، وتشتت الأشعة السينية، وديناميكية تشتت الضوء (DLS) 14،15. للأسف، مثل المواد النانوية البوليمرية التحقيق هنا لا تنطبق مع هذا الأسلوب. وفي دراسة أخرى، وتستخدم كولينز وآخرون تدفق الجسيمات صورة تقنية التحليل لدراسة (ليز) التي تحتوي على الببتيد 16 / DNA المجمعات، إلا أنه يمكن تقييم طريقتهم فقط أكبر، ميكرون الحجم الجسيمات 16. وهكذا، فإننا وضعت مؤخرا فحص الرواية ومرنة لتحديد عدد من جسيمات متناهية الصغر في البلازميدات 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية البذر
- لا تسمح الخلايا لتنمو لoverconfluency. استخدام الخلايا مرور وقت مبكر عندما بنقل العدوى إلى خلايا الأولية.
- أربع وعشرين ساعة قبل ترنسفكأيشن، يعرض للتريبسين الخلايا، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، ويخفف من التعليق الخلية مع وسائل الإعلام لتحقيق كثافة الخلية المطلوبة (خلية / حجم). الخلايا في الأنسجة واضحة البذور المعاملة ثقافة مسطحة القاع 96-وحات جيدة باستخدام خزان وماصات متعددة القنوات. يجب اختيار كثافة تعطي 70-80٪ confluency يوم ترنسفكأيشن. على سبيل المثال، كما هو معروض في الجدول 1، وتضعف الخلايا 25 إلى 50 خلية / ميكرولتر ترنسفكأيشن للبيانات هو موضح هنا.
2. خلية ترنسفكأيشن
- التخفيف من البوليمر والأرصدة DNA. ذوبان الجليد البوليمر والحلول الأسهم DNA في درجة حرارة الغرفة (RT). تمييع الحل البوليمر الأسهم والأوراق المالية DNA الحل، بشكل منفصل في لوحات واضحة بشكل جيد 96-باستخدام ماصة اثني عشر قناة، مع المذيبات المناسبة لالتركيزات المطلوبة للحصول على الوزن المطلوب البوليمر إلى نسب الوزن DNA (WT / WT). في هذه الحالة، المذيب المختار هو 25 ملي خلات الصوديوم العازلة (الرقم الهيدروجيني = 5.2).
- DNA التخفيف. عادة، يتم تخفيف الحمض النووي المخزنة في 1 ملغ / مل في المخزن المؤقت لخلات الصوديوم بتركيز 0،03 حتي 0،06 ملغ / مل في لوحة واضحة بشكل جيد 96-غير زراعة الأنسجة المعاملة (واحد بشكل جيد لصياغة واحدة). ويبين الجدول 2 التخفيف DNA نموذجية بروتوكول لصياغة واحدة تستخدم لبالنقل أربع آبار في تكرار لوحة المصنف 96-جيدا مع خلايا من الخطوة 1.
- البوليمر التخفيف. وتضعف 100 ملغ / مل البوليمر / DMSO في حل العازلة خلات الصوديوم وفقا للتركيز المطلوب للحصول على البوليمر المطلوب إلى نسبة وزن / وزن DNA. مجموعة من وزن / وزن النسب المستخدمة عادة لتوصيل الجينات مع بولي (بيتا الأمينية استر) ق (PBAEs) هو 20 إلى 100. مخففة 1 إلى 10 البوليمرات PBAE ملغ / مل، تليها ع التخفيفrotocol كما هو مبين في الجدول 3. لا يمكن أن يؤديها في التخفيفات البوليمر في لوحة واضحة بشكل جيد 96-غير زراعة الأنسجة المعاملة التي تطابق عينة من التوجه DNA لوحة التخفيف.
- جسيمات متناهية الصغر تشكيل. إضافة الحل PBAE إلى حجم مساو من الحل DNA البلازميد باستخدام ماصة اثني عشر قناة وتخلط بقوة. السماح للخليط في احتضان RT لمدة 10 دقيقة للسماح التجميع الذاتي.
- جسيمات متناهية الصغر ترنسفكأيشن. بعد التجميع الذاتي، وإضافة 20 ميكرولتر لكل بئر النانوية لثقافة البطيئه المتوسطة باستخدام ماصة اثني عشر قناة. يتم ترك الآبار غير المعالجة أو تكرار وtransfected مع الكواشف المتاحة تجاريا باسم الضوابط. يتم تحضين الخلايا بالنقل عند 37 درجة مئوية لمدة يتم استبدال ساعتين إلى أربع ساعات ثم آبار جديدة مع وسائل الإعلام (100 ميكرولتر / جيد). واختيار الوقت الحضانة تعتمد على خط الخلية، والظروف والثقافة، ونظام ترنسفكأيشن. الفرق في ترنسفكأيشنسيتم كميا الكفاءة وسمية الخلايا نتيجة لاختلاف فترة الحضانة من قبل بروتوكول تحليل موضح في الخطوة 3.
3. تحليل كفاءة ترنسفكأيشن وسمية الخلايا
ويتم تحليل كفاءة ترنسفكأيشن بصريا باستخدام المجهر مضان وكميا باستخدام قياس التدفق الخلوي ثمان وأربعين ساعة بعد ترنسفكأيشن. ويتم تحليل الخلايا السمية بصريا باستخدام المجهر مضان وكميا باستخدام ال 96 CellTiter مائي واحد مقايسة أربع وعشرين ساعة بعد ترنسفكأيشن.
- مضان المجهري. تحليل بصريا آبار للتعبير عن هذا الجين مراسل بالنقل (على سبيل المثال، أو EGFP DsRed) باستخدام القناة المناسبة مضان. الحصول على صور لكل بئر، واختيار المجالات التي تمثل نظر بشكل مناسب كفاءة ترنسفكأيشن لتركيبات معينة (الشكل 1). تقديم مذكرة من أي سمية الخلايا لاحظ بصريا.
- تدفق الخلوي.
- استخدام ماصات متعددة لإعداد لوحة 96-جيدا لقياس التدفق الخلوي. يغسل مع PBS، مع 30 ميكرولتر يعرض للتريبسين / جيدا التربسين / EDTA، تحييد مع 170 ميكرولتر العازلة FACS (PBS + 2٪ FBS)، ماصة صعودا وهبوطا في كل بئر، بما في ذلك حول الحواف، ونقل كامل 200-ميكرولتر حجم كل بئر إلى بئر المقابلة في لوحة 96-جيدا ذهابا وأسفل أو من أسفل إلى V.
- لوحة أجهزة الطرد المركزي في 130 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة 170 ميكرولتر من وسائل الاعلام كل خلايا ماصة جيدا ول resuspend مع تجنب الفقاعات. لاستخدام صلاحية وصمة عار مثل يوديد propidium (PI)، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة + PI FACS (50:1 FACS العازلة: PI التخفيف؛ PI تركيز المخزون 1 ملغ / مل) إلى كل بئر. وضع على الفور على الجليد وتغطية من الضوء.
- بدء تدفق عداد الكريات Accuri C6، وكذلك HyperCyt 96-مرفق، والبرامج HyperView. استخدام علامات التبويب تصميم وHyperView بروتوكول لاختيار المناسب عنوع أواخر تخطيط لوحة، وإعدادات أخرى مثل اهتزاز / رشفة / شطف / يهز الوقت. لبروتوكول أعلاه، استخدمت المعلمات التالية، قبل وزراء لوحة لدقيقة واحدة، ويهز قبل 30 ثانية لوحة في 2400 دورة في الدقيقة. تم تعيين رشفة الوقت لمدة 15 ثانية في 15 دورة في الدقيقة، تحقيقا شطف جيدا لكل 2 ثانية، وبين كذلك يهز كل الآبار 12 ل12 ثانية في 2400 دورة في الدقيقة. يهز جيدا بين من المهم للحفاظ على خلايا متفرقة في وسائل الإعلام، وكذلك لتحسين القدرة على معالجة البيانات عن طريق تضمين فواصل بين مجموعات من توقيت الآبار (في هذه الحالة 12 ثانية).
- استخدام علامة التبويب تعريف HyperView حسنا لمعالجة البيانات ومنفصلة في البئر المناسب (الشكل 2). من أجل تحديد الآبار الفردية، يمكن أن يساعد استخدام مرشح ضوضاء البرنامج، وكذلك بما في ذلك قاعدة تصفية حتى في ظل الإعدادات المتقدمة.
- تحديد النسبة المئوية للخلايا الحية النابضة تقاس إيجابيا المناسبة لفصل البوب مختلفulations (الشكل 3). عرض لأول مرة على تدفق البيانات مؤامرة مبعثر FSC مقابل SSC لخلايا منفصلة من الحطام (الشكل 3A). إذا تم استخدام يوديد propidium (PI)، بوابة السكان الخلية الفردية وعرض تلك البيانات على قطعة أرض مقابل FSC FL3 من أجل فصل الخلايا الحية من الخلايا الميتة والخلايا الحية بوابة. من أجل تحديد عدد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، عرض السكان الخلية الحية على القنوات المناسبة، على سبيل المثال، يمكن أن ينظر إليه في GFP FL1. باستخدام السكان دون علاج، بوابة الخلايا غير المعالجة من أجل تحديد إشارة الخلفية (الشكل 3B). ويمكن بعد ذلك الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل بشكل إيجابي تكون معزولة باستخدام هذه البوابة و. عن طريق عرض السكان بالنقل باستخدام كل مبعثر والمخططات كفاف (الشكل 3C و 3D) قد تكون هناك سلسلة متصلة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إيجابي، كما سيتم تقاس خلايا مختلفة بدرجات مختلفة من مضان.
- CellTiter 96 مائي واحد مقايسة
- آخر لوحة بالنقل بالطريقة ذاتها تماما لقياسات سمية الخلايا.
- بريميكس 1 مل من محلول مائي 96 CellTiter فحص واحد مع وسائل الإعلام 10 مل الطازجة. إزالة وسائل الإعلام من الخلايا واستخدام ماصة الأقنية لإضافة 110 ميكرولتر من الحل خلط + وسائل الإعلام لكل بئر.
- قياس الامتصاصية ب 490 نانومتر كل فترة ساعة واحدة 1 حتي 4 ساعة حتى امتصاص من البئر مع حالة غير المعالجة هي في حدود خطية من الفحص. وتشمل الآبار الأربع مع تحكم وسائل الإعلام فقط + حل لخلفية القراءة الامتصاصية.
- متوسط امتصاص القيم من الابار الاربعة في حالة تكرار وطرح الامتصاصية خلفية المتوسط من كل المتوسط. تطبيع متوسط تصحيح لكل حالة تعامل مع المعدل تصحيح للحالة غير المعالجة لتحديد بقاء الخلية في المئة.
- رئيس النظام fluidics من NS500 Nanosight عن طريق تشغيل مضخة مخفف قدما في أقصى سرعة حوالي 1/5th والمضخة عينة الوراء في ما يقرب من 1/10th سرعة القصوى. تستمر حتى يتم مسح نظام fluidics مع مخفف.
- إعداد النانوية لتحليلها. في حالة PBAEs، تخفيف حدة الحمض النووي البلازميد الأسهم (1 ملغ / مل) والأسهم PBAE (100 ملغ / مل) في المخزن المؤقت خلات الصوديوم (25 ملم، ودرجة الحموضة 5) في أنابيب إيبندورف.
- يخفف من تركيز الحمض النووي البلازميد إلى 0.06 ملغم / مل. البوليمر تركيز يمكن أن تختلف تبعا لنسبة الوزن الوزن المطلوب من البوليمر لDNA (على سبيل المثال، لجزيئات WT / WT 60، يتم تخفيف البوليمر إلى 3.6 ملغ / مل).
- إضافة الحل البوليمر إلى حجم مساو من الحل DNA البلازميد ومزيج بقوة. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة للسماح التجميع الذاتي.
- ديالعود الحل جسيمات متناهية الصغر 100-أضعاف في PBS من أجل تركيز جسيمات متناهية الصغر لتكون في حدود مناسبة لNTA وللحصول على الحجم النهائي من 500 ميكرولتر على الأقل.
- تحميل العينة في Nanosight عن طريق وضع أنبوب التحميل في عينة إيبندورف أنبوب (الشكل 4A). تأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء.
- في وضع الالتقاط، وزيادة مستوى الكاميرا حتى يمكن رؤية الجسيمات. ضبط التركيز بحيث تبدو الجزيئات على نحو سلس (الشكل 4A و 4B).
- بينما في الوضع العادي، ضبط مستوى الكاميرا بعد نقطة والتي يمكن مشاهدتها على الشاشة جميع الجزيئات. ثم ينخفض مستوى الكاميرا إلى أدنى مستوى بحيث لا يزال جميع الجزيئات يمكن ملاحظتها. إذا كانت هناك حاجة إلى مستوى الكاميرا المتوسطة، والذهاب إلى الوضع المتقدم وتعديل مصراع الكاميرا والحصول على مستويات مناسبة.
- تحقق بصريا للتأكد من وجود ما بين 20 حتي 100 ق الجسيمات علىcreen. عدد مثالية لتتبع جسيمات متناهية الصغر هو ما يقرب من 50 الجسيمات. إذا كان هناك العديد جدا أو قليلة جدا، وتدفق NS500، ضبط في التخفيف PBS، وإعادة تحميل العينة.
- ضبط مدة القبض وفقا للجدول الوضع العادي. عادة 30 حتي 60 ثانية هو طول التقاط المناسب (الشكل 4B).
- لتحميل عينة المقبل، تدفق النظام، ثم إعادة تحميل عينة جديدة.
- مرة واحدة يتم التقاطها أشرطة الفيديو، انتقل إلى مرحلة التجهيز من خلال فتح ملف الفيديو.
- هناك عدد من المعلمات التي يمكن ضبطها من أجل معالجة أفضل شريط فيديو (الشكل 4C). والهدف من ذلك هو تحديد المعايير التي التقاط أفضل كل الجسيمات التي تظهر على الشاشة، كما يتبين من علامة الصليب الأحمر على الشاشة على كل الجسيمات (الشكل 5).
- زيادة أرباح الشاشة لمشاهدة أفضل الجسيمات. تحت الوضع العادي أو متقدمة، حدد ضبط السيارات للمعلمات من قبل clickinز المربعات المناسبة. في حالة أن إعدادات السيارات لم تقم بتحديد كاف الجسيمات، unclick مربع ويدويا تعيين المعلمات (الشكل 4C).
- مرة واحدة واختار كل الجزيئات على الشاشة، انقر فوق الزر عملية من البرنامج لمعالجة ملف الفيديو (الشكل 4C). هذا يوفر توزيع حجم الجسيمات، المتوسطات الحجم، فضلا عن تركيز الجسيمات.
- من أجل التأكد من أن تركيز الجسيمات الدقيقة، تغيير التخفيف PBS، مثل التخفيف من خلال زيادة 2X، وكرر الإجراء أعلاه. التخفيفات قياس متعددة من نفس العينة ويوصى لضمان أن قياس تركيز العينة دقيقة. وهناك مجموعة جيدة لقياس هو 10 7 9 -10 الجسيمات / مل.
- تحقق من أن يتم دمج جميع البلازميدات إلى النانوية عن طريق تشغيل الكهربائي للهلام من الجسيمات النانوية وتقييم ما إذا كان أي DNA مجانا موجودا.إذا لم يتم تغليف جميع البلازميدات، استخدم التقنيات القياسية لقياس امتصاص الحمض النووي من أجل تحديد البلازميدات مغلفة الإجمالي.
- لحساب متوسط عدد الجسيمات في البلازميدات، تقسيم مجموع تركيز البلازميد مغلفة من الجسيمات NTA قياس تركيز. من أجل تقدير البلازميد عينة الجسيمات في التوزيع، أولا استخدام حجم الجسيمات NTA الرسم البياني لحساب نسبة حجم كل 1-بن نيوتن متر من الجسيمات. مضاعفة هذا التوزيع جزء من حجم المبلغ الكلي البلازميد للحصول على عدد من البلازميدات في كل حاوية. تقسيم هذه الأرقام من قبل عدد من الجسيمات في كل بن الحصول على عدد من البلازميدات الجسيمات لكل لكل حجم الجسيمات (الشكل 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويظهر الشكل 1 صورة من مضان المجهري مثال على نجاح HRECs ترنسفكأيشن مع البلازميد EGFP. الصورة brightfield مفيد لضمان الحفاظ على التشكل أن الخلايا المعتادة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام المقايسات بقاء الخلية، مثل MTS أو المقايسات مماثلة، لتقييم سمية جسيمات متناهية الصغر 7. التدفق الخلوي، كما هو موضح، ويمكن أن تستخدم لقياس كفاءة ترنسفكأيشن. عند استخدام لوحة HyperCyt المرفقات متعددة أيضا، فإن البيانات التي تحتاج إلى معالجتها بشكل مناسب من أجل تحديد بشكل صحيح الآبار. كما يمكن أن يرى في اللوحة اليمنى من الشكل 2، عندما تعداد خلايا جيدة (آلاف من الخلايا لكل بئر)، وتعمل بشكل صحيح fluidics، والآبار الفردية هي أسهل لاختيار يدويا وبواسطة برنامج. ومع ذلك، إذا تعداد خلايا منخفضة جدا أو وجود مشكلة مع fluidics، يصبح أكثر صعوبة لتحديد individيو ايه ال الآبار (اللوحة اليمنى من الشكل 2)، والتجربة تحتاج على الأرجح أن يتكرر. يمكن استبدال أنابيب للإصلاح في كثير من الأحيان مشاكل Hypercyt مع تدفق العينة. مرة واحدة يتم الحصول على البيانات الفردية كذلك، يمكن استخدام البرمجيات الأكثر شيوعا التدفق الخلوي لتحليل تصدير ملفات FCS. في الشكل 3، ويستخدم لFlowJo خلايا تقاس من خلال مقارنة بوابة إيجابيا إلى الآبار غير المعالجة.
النانوية PBAE وعادة ما تكون ما بين 100 - 200 نانومتر في الحجم ويقاس NTA Nanosight. عند تنفيذ NTA، من المهم أن عدد الجسيمات النانوية على الشاشة تكون ما بين 20 - 100 حتى أن البرنامج سوف تكون قادرة على تتبع بدقة الجسيمات 5A الشكل هو مثال على جزيئات كثيرة جدا، بينما يوضح الشكل 5B مثال عدد مناسب. وينبغي معالجة الفيديو التي تم التقاطها بحيث يتم ذلك يتم التقاطها الجزيئات التي تظهر على الشاشة لوحظ من قبل سوفتواري ه، ممثلة مع الشعر للصليب الأحمر. ويمكن رؤية مثال على عتبة عند التقاط جزيئات منخفضة جدا في الشكل 5C، في حين يعتبر مثالا لأفضل مستوى العتبة في الشكل 5D. لا يمكن أن يؤديها A التخفيف مختلفة من العينة للتأكد من أن العينة هي في حدود تركيز الصحيح. وينبغي تركيز الجسيمات الجديدة التي قدمها Nanosight مطابقة التخفيف جديدة. مرة واحدة يتم الحصول على حجم وتركيز الجسيمات، يمكن حساب متوسط البلازميد الجسيمات في والتوزيع. ويمكن رؤية النتائج سبيل المثال في الشكل 6. يظهر الجدول الزمني التجريبي في الشكل 7.
| الآبار / لوحة | حجم / حسنا (ميكرولتر) | خلية / حسنا |
| 96 | 100 | 2،500 و 5،000 |
| الآبار / لوحة | حجم / حسنا (ميكرولتر) | الحجم الجسيمات / حسنا (ميكرولتر) | DNA / حسنا (ميكروغرام) | DNA (ميكروغرام / ميكرولتر) | DNA 1 ميكروغرام / ميكرولتر الأسهم (ميكرولتر) | NAAC (ميكرولتر) |
| 96 | 100 | 20 | 0.6 | 0.06 | 3 | 47 |
الجدول 2. بروتوكول نموذجي لتخفيف الحمض النووي شكل لوحة 96-أيضا.
| البوليمر: DNA (WT / WT) | الحجم الجسيمات / حسنا (ميكرولتر) | # تكرار ويلز | DNA / حسنا(ميكروغرام) | البوليمر / حسنا (ميكروغرام) | البوليمر / 10 ميكروغرام / ميكرولتر الأسهم (ميكرولتر) | NAAC (ميكرولتر) |
| 20 | 20 | 4 | 0.6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0.6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0.6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0.6 | 60 | 30 | 20 |
الجدول 3. بروتوكول نموذجي لتخفيف البوليمر شكل لوحة 96-أيضا.
الرقم1. واحد التصوير مضان من قناة لون HRECs transfected مع PBAE (يسار) GFP مضان، اللون الأخضر؛ الصورة Brightfield (الشرق)، (يمين) صورة مركبة.
الشكل 2. Hypercyt خطوة البرمجيات جيدا بعد تحديد البيانات التي تم جمعها (اليسار) مثال من البيانات إشكالية بسبب تهم منخفضة أو المسألة مع fluidics؛ (يمين) مثال لبيانات نظيفة، مع آبار التعرف عليها بسهولة اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. FlowJo النابضة لخلايا transfected مع EGFP بلازميد (A) FSC مقابل SSC للخلايا غير المعالجة؛ (B) FL1 مقابل FL3 لأجلك ..الخلايا ntreated؛ (C، D) FL1 مقابل FL3 للخلايا transfected مع PBAE. كل الزائفة اللون الكثافة (C) والمخططات الكنتورية (D) هي مفيدة لتحديد موقع لرسم البوابات.
الشكل 4. لقطة شاشة لأجزاء من البرنامج جسيمات متناهية الصغر Nanosight تحليل تتبع، الإصدار 2.2 (A) والتحكم fluidics؛ (B) وضع الالتقاط، وتستخدم لالتقاط الفيديو من الجسيمات النانوية، (C) وضع معالجة متوفرة بعد فتح الفيديو التي تم التقاطها من قبل. وظائف الحمراء تسليط الضوء على صناديق مناقشتها في البروتوكول. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 5. . مثال على التقاط الفيديو Nanosight وتحليل عينة من لقطات قبل التقاط الفيديو العينة التي لم يتم تخفيفه بما فيه الكفاية (A)، ومع التخفيف المناسبة (B)؛ قطات من وضع تحليل عتبة الكشف الجسيمات مع تعيين منخفضة جدا (C) وتعيين بشكل مناسب (D)، مع الشعر الصليب الأحمر تحديد جميع الجزيئات بشكل مناسب. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 6. توزيع حجم الجسيمات وتوزيع البلازميد في بيانات PBAE (B5S3E7، 60:1 البوليمر لوزن DNA / WT) القائمة على الجسيمات النانوية تحليلها باستخدام تقنية تتبع nanosight تحليل. نقلا عن [14] الصغيرة، 8، Bhise، NS، شموئيلي، RB، جونزاليس ،J.، والأخضر، JJ A مقايسة جديدة لتحديد عدد البلازميدات مغلفة من الجسيمات النانوية البوليمر، 367-373، جميع الحقوق محفوظة 2012، بإذن من ايلي VCH. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 7. التجريبية زمني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكولات أعلاه تصف أساليب تقييم فعالية ترنسفكأيشن من الصيغ جسيمات متناهية الصغر، وكذلك وسيلة لتوصيف حجم الجسيمات والتحميل DNA من الجسيمات النانوية. عدد البلازميدات في الجسيمات هي العوامل الهامة التي يمكن أن تساعد في التنبؤ فعالية من الجسيمات ويمكن أن تستخدم أيضا لتحديد الجرعة. لا يمكن أن يؤديها جسيمات متناهية الصغر تحليل تتبع في مجموعة من المحاليل المائية المختلفة، مثل تلك اختلاف في تركيز الملح. غالبا ما يتم تنفيذ هذا الوصف في برنامج تلفزيوني، لتقليد المالحة الفسيولوجية. بينما التحجيم في برنامج تلفزيوني يمكن أن تعطي تقدير جيد من حجم الجسيمات النانوية في وسائل الإعلام أو المالحة الفسيولوجية، يمكن للكمية الحالية المصل تؤثر على حجم الجسيمات النانوية والاستقرار 17. ولذلك، يمكن توصيف الجسيمات في تركيزات مختلفة من المصل تكون مهمة لبعض التطبيقات أيضا. من أجل تميز الجسيمات في مصل الدم، وadditioويوصى خطوة نال نظرا لتشتت الخلفية عالية من البروتينات في الدم. في هذه الحالة، ينبغي الجزيئات الموسومة fluorescently، بحيث من خلال استخدام عامل التصفية مضان، يمكن تعقب جزيئات البروتينات تحديدا واضحا عن المصل.
البلازميد الكمي في الجسيمات هو عام بما يكفي لاستخدامه مع تركيبات مختلفة جسيمات متناهية الصغر، بما في ذلك النظم الأخرى أو الجسيمات البوليمرية غير العضوية. قد يرجع ذلك إلى السلوك ضوء نثر مختلفة من المواد المختلفة، والتقاط الفيديو والمعلمات تجهيز تحتاج إلى تعديل. بالإضافة إلى ذلك، قد لحساسية NTA تغيير اعتمادا على المواد. البلازميد بروتوكول الجسيمات المذكورة أعلاه في طريقة سريعة ومفيدة لوصف الجسيمات النانوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
واضعي التقرير أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أشكر MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) وNIH R21CA152473 حصول على الدعم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
