Summary
En protokoll for nanopartikkel sporing analyse (NTA) og high-throughput flowcytometri å vurdere polymere genet levering nanopartikler er beskrevet. NTA utnyttes for å karakterisere nanopartikkel partikkelstørrelsesfordeling og plasmidet per partikkel fordeling. High-throughput flowcytometri gjør kvantitative transfeksjon effektevalueringen for et bibliotek av genet levering biomaterialer.
Abstract
Ikke-virale genet levering hjelp polymere nanopartikler har dukket opp som en attraktiv metode for genterapi for å behandle genetiske sykdommer 1 og som en teknologi for regenerativ medisin 2. Motsetning til virus, som har betydelige sikkerhetsaspekter, kan polymere nanopartikler utformes for å være ikke-giftig, ikke-immunogene, ikke-mutagent, enklere å syntetisere, kjemisk allsidig, stand til å bære større nukleinsyre last og biologisk nedbrytbare og / eller miljømessig responsive. Kationiske polymerer selv montere med negativt ladet DNA via elektrostatisk interaksjon for å danne komplekser på størrelsesorden 100 nm som ofte benevnes polymere nanopartikler. Eksempler biomaterialer brukes til å danne nanoskala polykationiske genet levering nanopartikler omfatter polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoamines) s og polyetylenimin (PEI), som er en ikke-nedbrytbar off-the-sokkel kationisk polymer som vanligvis brukes for nukleinsyre produksjonstid 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) er en nyere klasse av kationiske polymerer 4 som er hydrolytisk nedbrytbare 5,6 og har vist seg å være effektive på genet levering til vanskelig å transfektere celletyper som humane retinale endotelceller (HRECs) 7, mus mammary epitelceller 8, menneskelige hjerne kreftceller 9 og makrovaskulære (human umbilical vein, HUVECs) endotelceller 10.
En ny-protokollen for å karakterisere polymere nanopartikler utnytte nanopartikkel sporing analyse (NTA), er beskrevet. I denne tilnærmingen blir både partikkelstørrelsesfordelingen og fordelingen av antall plasmider per partikkel innhentet 11. I tillegg er en high-throughput 96-brønns plate transfeksjon analysen for rask screening av transfeksjon effekten av polymere nanopartikler presentert. I denne protokollen, er poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) brukt som modell polymerer og humane retinal endotelceller (HRECs) brukes som model menneskeceller. Denne protokollen kan lett tilpasses for å evaluere eventuelle polymert nanopartikkel og enhver celletype av interesse i en multi-brønn plate-format.
Introduction
Bestemmelsen av antall plasmider kompleksbundet per nanopartikkel er viktig å utforme effektive nanopartikkel-baserte genet levering strategier, spesielt for co-levering av flere plasmider til samme celle målet, som ofte er nødvendig i stamcelleforskningen omprogrammering studier 12. Noen tilnærminger for å beregne antall plasmider forbundet med en enkelt nanopartikkel er beskrevet, og hver tilnærming har ulemper i de teknikkene som brukes for estimering 13-16. Kvante prikk (QD) merking kombinert med TEM har blitt brukt til å beregne plasmider per partikkel i kitosan-baserte nanopartikler. Estimering med dette QD teknikken er komplisert på grunn av behovet for å merke DNA, som kan endre sin selv-montering egenskaper, muligheten for at innkapslet umerket DNA ikke er direkte detektert; potensielt overlappende plasmider og QDs i 2D TEM bilder av partikler, og andre forenklende forutsetninger 13. En alternativ tilnærming som er enpplicable når bestilt microdomains finnes i partiklene har blitt brukt til å studere Lipopolyamine-DNA komplekser via Cryo-transmisjonselektronmikroskopi (Cryo-TEM), X-ray spredning, og dynamisk lysspredning (DLS) 14,15. Dessverre, materialer som de polymere nanopartikler undersøkt her er ikke aktuelt med denne metoden. I en annen studie, brukte Collins et al en flyt partikkel bildeanalyse teknikk for å studere (Lys) 16-inneholdende peptid / DNA komplekser,. Kan imidlertid deres metode bare vurdere større, mikron-størrelse partikler 16. Således vi nylig utviklet en ny og fleksibel assay å kvantifisere antallet plasmider pr nanopartikkel 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Seeding
- Ikke la cellene til å vokse til overconfluency. Bruk tidlig passasje cellene når transfecting primærceller.
- Tjuefire timer før transfeksjon, trypsinize cellene, telle cellene ved hjelp av en hemocytometer, og fortynn cellesuspensjonen med media for å oppnå den ønskede celletetthet (celler / volum). Seed celler til klar vevskultur-behandlet flatbunnede 96-brønners plater ved bruk av en reservoar-og flerkanals pipetter. Den valgte tetthet bør gi 70-80% sammenflyting den dagen transfeksjon. For eksempel, som vist i tabell 1, ble cellene fortynnet i 25 til 50 celler / pl for transfeksjon data vist her.
2. Cell Transfeksjon
- Fortynning av polymer og DNA aksjer. Tine polymer og DNA lager løsninger ved romtemperatur (RT). Fortynn polymer stamoppløsning og DNA stamløsning, separat i klare 96-brønners plater ved bruk av en tolv-kanals pipette, Med det passende oppløsningsmiddel til konsentrasjoner som kreves for å oppnå den ønskede polymer vekt DNA vektforhold (vekt / vekt). I dette tilfellet, er den utvalgte løsningsmiddel 25 mM natriumacetat-buffer (pH = 5.2).
- DNA fortynning. Vanligvis, er DNA lagret ved 1 mg / ml fortynnet i natriumacetat-buffer til en konsentrasjon på 0,03 til 0,06 mg / ml i en klar ikke-vevskultur-behandlet 96-brønns plate (en brønn for en enkelt formulering). Tabell 2 viser typisk DNA fortynning protokoll for en enkelt formulering anvendt for å transfektere fire replikatmålinger brønner i en 96-brønns plate podet med celler fra trinn 1.
- Polymer fortynning. På 100 mg / ml polymer / DMSO fortynnes i natriumacetatbuffer i henhold til konsentrasjonen som kreves for å oppnå den ønskede polymeren til DNA vekt / vekt-forhold. Utvalget av vekt / vekt forhold som vanligvis brukes for genet produksjonstid med poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) er 20 til 100. PBAE polymerer første fortynnes til 10 mg / ml, etterfulgt av fortynning protocol som vist i tabell 3. Den polymer fortynninger kan utføres i en klar ikke-vevskultur-behandlet 96-brønns plate som matcher prøve orientering av DNA fortynning plate.
- Nanopartikkel formasjonen. Tilsett PBAE løsningen til et likt volum av plasmidet DNA-løsningen ved hjelp av en tolv-kanals pipette og bland kraftig. La blandingen inkuber ved RT i 10 min for å tillate selvkonfeksjonering.
- Nanopartikkel transfeksjon. Etter selvbygging, blir 20 ul nanopartikler lagt per brønn til kulturmediet dråpevis med tolv-kanal pipette. Repliker brønner blir stående ubehandlet eller transfektert med kommersielt tilgjengelige reagenser som kontroller. De transfekterte celler blir inkubert ved 37 ° C i 2-4 timer og deretter Brønnene erstattet med friske medier (100 ul / brønn). Valg av inkubasjonstid vil avhenge cellelinje dyrkningsbetingelser, og transfeksjon system. Forskjellen i transfeksjoneffektivitet og celle toksisitet som et resultat av varierende inkubasjonstiden skal kvantifiseres ved analysen protokollen beskrevet i trinn 3.
3. Analyse av Transfeksjon Effektivitet og Cell Toksisitet
Transfeksjon effektivitet analyseres visuelt med en fluorescens mikroskop og kvantifisert ved hjelp av et flowcytometer førtiåtte timer etter transfeksjon. Cell toksisitet er analysert visuelt med en fluorescens mikroskop og kvantifiseres ved hjelp av CellTiter 96 vandig En analyse tjuefire timer etter transfeksjon.
- Fluorescens mikroskopi. Visuelt analysere brønnene for ekspresjon av den transfekterte reporteren genet (for eksempel EGFP eller DsRed) med riktig fluorescens kanal. Hente bilder for hver brønn, velge synsfelt som hensiktsmessig representerer transfeksjon effektiviteten for de spesielle formuleringer (figur 1). Notere hvilken som helst celle toksisitet observert visuelt.
- Flowcytometri.
- Bruk multikanal pipetter å forberede 96-brønns plate ved flowcytometri. Vask med PBS, trypsinize med 30 ul / brønn av trypsin / EDTA, nøytraliser med 170 pl FACS buffer (PBS + 2% FBS), pipette opp og ned i hver brønn, inkludert rundt kantene, og overføre hele 200-pl volum hver brønn inn i tilsvarende brønner i en rundbunnet eller V-bunn 96-brønns plate.
- Sentrifuger plate ved 130 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Fjern 170 ul medier fra hver brønn og pipette for å resuspendere cellene samtidig unngå bobler. Å bruke en levedyktighet flekk som propidium jodid (PI), tilsett 10 pl FACS buffer + PI (50:1 FACS buffer: PI fortynning; PI stock konsentrasjon 1 mg / ml) til hver brønn. Umiddelbart plassere på isen og dekker mot lys.
- Start C6 Accuri strømningscytometeret, den HyperCyt 96-brønners vedlegg, og HyperView programvare. Bruk HyperView Design og protokoll kategoriene for å velge riktig psen type, plate layout og andre innstillinger, for eksempel riste / sip / skylling / riste tid. For ovennevnte protokollen, ble følgende parametere, en pre-plate prime i ett minutt, og en pre-plate riste for 30 sek på 2,400 rpm. Sip tid ble satt i 15 sekunder ved 15 rpm, en sonde skyll hver brønn for 2 sek, og en inter-vel riste hver 12 brønner for 12 sek på 2400 rpm. Den inter-vel shake er viktig å holde cellene dispergert i media, samt for forbedret evne til å behandle dataene ved å inkludere tidsbestemte pauser mellom grupper av brønner (i dette tilfellet 12 sek).
- Bruk HyperView Well kategorien Identifikasjon å behandle data og separate inn i riktig godt (Figur 2). For å identifisere de enkelte brønner, kan det hjelpe å bruke programvarens støy filter, samt inkludert en base selv filter under avanserte innstillinger.
- Kvantifisere andelen positivt transfektert levende celler ved hensiktsmessig gating å skille ulike popreguleringer (figur 3). Først vise flowdata på en FSC versus SSC spredningsdiagram for å skille celler fra rusk (figur 3A). Hvis propidium jodid (PI) ble anvendt, gate individet cellepopulasjon og visningen som data på et FSC vs FL3 tomten for å separere levende celler fra døde celler og gate de levende celler. For å kvantifisere antallet transfekterte celler, vise live cellepopulasjon på de riktige kanaler, for eksempel, kan GFP sees i FL1. Bruke ubehandlet befolkningen, ubehandlede celler gate for å identifisere bakgrunnen signalet (figur 3B). De positivt transfektert cellene kan deretter bli isolert ved hjelp av denne porten og ved å vise transfekterte populasjoner med både splitte og kontur plott (figur 3C og 3D). Det kan være et kontinuum av positivt transfekterte celler, som ulike cellene vil bli transfektert til forskjellige grader av fluorescens.
- CellTiter 96 vandig En analyse
- Transfektere en annen plate på nøyaktig samme måte for celle toksisitet målinger.
- Premiks 1 ml av CellTiter 96 vandige One analyseoppløsning med 10 ml nytt medium. Ta ut mediet fra celler og bruke en flerkanals pipette til å legge 110 ul av ferdigblandet løsning + media per brønn.
- Mål absorbansen ved 490 nm hver en timers intervall 1-4 hr inntil absorbansen fra brønnen med ubehandlet tilstand er i den lineære området av analysen. Omfatter fire kontroll brønner med eneste løsningen + medier for en bakgrunn absorbans lesing.
- Gjennomsnittlig absorbansen verdier fra de fire gjentatte brønner per tilstand og trekker fra den gjennomsnittlige bakgrunn absorbans fra hver gjennomsnittet. Normaliser den korrigerte gjennomsnitt for hver behandlet tilstand til den korrigerte gjennomsnitt av den ubehandlede tilstand å bestemme prosent cellelevedyktighet.
- Prime lufthåndtering system NanoSight NS500 ved å kjøre fortynningsmiddel pumpe frem ca 1/5th maks hastighet og prøven pumpe bakover ca 1/10th maks hastighet. Fortsette inntil lufthåndtering systemet skylles med fortynningsmiddel.
- Forbered nanopartikler som skal analyseres. I tilfelle av PBAEs, separat fortynne lager plasmid DNA (1 mg / ml) og lager PBAE (100 mg / ml) i natriumacetatbuffer (25 mM, pH 5) i Eppendorf-rør.
- Fortynn plasmid DNA-konsentrasjon til 0,06 mg / ml. Polymerkonsentrasjon kan variere avhengig av ønsket vekt-vektforhold av polymer til DNA (for eksempel for 60 vekt / vekt partikler, er polymer fortynnet til 3,6 mg / ml).
- Legg polymeroppløsningen til et likt volum av plasmidet DNA-løsningen og bland kraftig. Inkuber blandingen ved romtemperatur i 10 min for å tillate selvkonfeksjonering.
- Dilutt nanopartikkel løsning 100-fold i PBS for at nanopartikkel konsentrasjonen å være i det passende området for NTA og å skaffe et endelig volum på minst 500 pl.
- Laste prøven inn NanoSight ved å plassere ladningsrøret i prøven Eppendorf-rør (figur 4A). Pass på å ikke innføre luftbobler.
- I opptaksmodus, øke kameraet nivået til partiklene kan sees. Juster fokus slik at partiklene ser glatt (figur 4A og 4B).
- Mens i standard-modus, stille kameraet nivå forbi det punktet at alle partikler kan sees på skjermen. Deretter redusere kameraet nivå til det laveste nivået slik at partiklene kan alle fremdeles observeres. Hvis en middels kamera nivå er nødvendig, gå inn avansert modus og endre kameralukker og få til riktig nivå.
- Visuell kontroll for å sikre at det er mellom 20 - 100 partikler på screen. En ideell tall for nanopartikkel sporing er ca 50 partikler. Hvis det er for mange eller for få, skyll NS500, justere fortynning i PBS, og re-load prøven.
- Juster fangst varighet i henhold til standard modus tabellen. Vanligvis 30 - 60 sek er et passende fangst lengde (figur 4B).
- Å laste den neste prøven, skylle systemet, deretter re-laste den nye prøven.
- Når videoene er fanget, gå videre til behandling scenen ved å åpne en videofil.
- Det finnes en rekke parametre som kan være innstilt for å best behandle en video (Figur 4C). Målet er å velge parametere som best fanger hver partikkel på skjermen, som indikert av en rødt kryss på skjermen over hver partikkel (figur 5).
- Øke skjermens forsterkningen til bedre se partiklene. Under standard eller avansert modus, velge automatisk justere for parametrene ved clicking de aktuelle boksene. I tilfelle at automatiske innstillinger ikke tilstrekkelig velge partikler, Fjern krysset i boksen og manuelt sette parametre (Figur 4C).
- Når alle partiklene blir plukket på skjermen, klikker prosessen knappen av programvaren til å behandle videofilen (Figur 4C). Dette gir partikkelstørrelsesfordelingen, størrelse gjennomsnitt samt partikkelkonsentrasjonen.
- For å være sikker på at partikkelkonsentrasjonen er nøyaktig, endrer PBS fortynning, for eksempel ved å øke fortynning med 2x, og gjenta prosedyren ovenfor. Måling flere fortynninger av den samme prøven anbefales for å sikre at konsentrasjonen måling av prøven nøyaktig. Et godt utvalg for måling er 10 7 -10 9 partikler / ml.
- Kontroller at alle plasmider innarbeides nanopartikler ved å kjøre gelelektroforese av nanopartikler og evaluere hvorvidt en fritt DNA er til stede.Hvis ikke alle plasmider kapsles, bruke standard teknikker for å måle DNA absorbans for å kvantifisere totale innkapslede plasmider.
- For å beregne gjennomsnittlig antall plasmider per partikkel, dele den totale innkapslet plasmid konsentrasjon av NTA målte partikkelkonsentrasjonen. For å estimere den plasmid per partikkel sample distribusjon, først bruke NTA partikkelstørrelse histogrammet å beregne volumfraksjonen av hver 1-nm bin av partikkel. Multiplisere dette volumfraksjonen fordelingen med det totale plasmid beløp å skaffe antallet plasmider i hver kasse. Dele disse tallene med antall partikler i hver stolpe for å skaffe antallet plasmider per partikkel for hver partikkelstørrelse (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fig. 1 viser et fluorescensmikroskopi bilde av et eksempel på en vellykket transfeksjon av HRECs med EGFP plasmid. Den lysfelt Bildet er nyttig for å sikre at cellene opprettholde deres vanlige morfologi. Tillegg kan celleviabilitet analyser, for eksempel MTS eller lignende undersøkelser, brukes til å vurdere nanopartikkel toksisitet 7. Flowcytometri, som beskrevet, kan brukes til å kvantifisere transfeksjon effektivitet. Ved bruk av HyperCyt flerbrønns plate vedlegg, vil dataene som må bearbeides på riktig måte for å fullstendig identifisere brønnene. Som kan sees i det høyre panelet av figur 2, når cellen teller er bra (tusen celler per brønn) og lufthåndtering opererer fullstendig, de individuelle brønnene er lettere å plukke ut både manuelt og av programvaren. Men hvis celletall er for lavt eller det er et problem med lufthåndtering, blir det mye vanskeligere å identifisere den enkeltesual brønner (venstre panel av figur 2), og forsøket må sannsynlig å bli gjentatt. Skifte rør på Hypercyt kan ofte løse problemer med prøven flyt. Så snart de individuelle brønndata er innhentet, kan vanligste flowcytometri programvare brukes til å analysere de eksporterte. FCS filer. På figur 3, blir brukt for å FlowJo gate de positivt transfekterte celler ved å sammenligne til de ubehandlede brønner.
De PBAE nanopartikler er vanligvis mellom 100 til 200 nm i størrelse målt ved NanoSight NTA. Ved utføring NTA, er det viktig at antallet nanopartikler på skjermen være mellom 20 -. 100 slik at programvaren vil bli i stand til å nøyaktig spore partiklene Fig. 5A er et eksempel på for mange partikler, mens figur 5B viser et eksempel på et hensiktsmessig antall. Behandling av digitalisert video bør gjøres slik at de observerte partikler på skjermen blir plukket opp av softwar e, representert med de røde trådkorset. Et eksempel på når terskelen for å plukke opp partikler er for lavt kan sees i figur 5C, mens et eksempel på et bedre terskelnivå er sett i figur 5D. En annen fortynning av prøven kan utføres for å sikre at prøven er i riktig konsentrasjonsområde. Den nye partikkelkonsentrasjonen gitt av NanoSight skal samsvare med ny fortynning. Når størrelsen og partikkelkonsentrasjonen er innhentet, kan plasmidet per partikkel gjennomsnitt og distribusjon beregnes. Eksempel resultatene kan sees i figur 6. Den eksperimentelle tidslinjen blir vist i Figur 7.
| Brønner / Plate | Volum / Well (ul) | Celler / brønn |
| 96 | 100 | 2500 til 5000 |
| Brønner / Plate | Volum / Well (ul) | Partikkel Volum / Well (ul) | DNA / Well (pg) | DNA (ug / ul) | DNA 1 ug / ul stam (ul) | NaAc (ul) |
| 96 | 100 | 20 | 0.6 | 0,06 | 3 | 47 |
Tabell 2. Typisk DNA fortynning protokoll for en 96-brønns plate-format.
| Polymer: DNA (vekt / vekt) | Partikkel Volum / Well (ul) | # Repliker Wells | DNA / Well(Pg) | Polymer / Well (pg) | Polymer / 10 ug / ul stam (ul) | NaAc (ul) |
| 20 | 20 | 4 | 0.6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0.6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0.6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0.6 | 60 | 30 | 20 |
Tabell 3. Typisk polymer fortynning protokoll for en 96-brønns plate-format.
Figur1. Enkelt fargekanal fluorescens avbildning av HRECs transfektert med PBAE (venstre) GFP fluorescens, farget grønn,. (Middle) Lysfelt bilde, (høyre) Sammensatt bilde.
Figur 2. Hypercyt programvare brønnidentifikasjon steg etter at dataene som samles inn (venstre) Eksempel på problematiske data som følge av lave teller eller et problem med lufthåndtering;.. (Høyre) Eksempel på rene data, med lett identifisert brønner Klikk her for å se større figur .
Figur 3. FlowJo gating for celler transfektert med EGFP plasmid (A) FSC versus SSC for ubehandlede celler,. (B) FL1 vs FL3 for untreated celler, (C, D) FL1 versus FL3 for celler transfektert med PBAE. Både pseudo-fargetettheten (C) og (D) konturkart plott er nyttig for å bestemme plasseringen til tegne gates.
Figur 4. Skjermbilde av deler av NanoSight nanopartikkel sporing analyse programvare, versjon 2.2 (A) lufthåndtering kontroll,. (B) bildemodus brukes til å fange video av nanopartikler, (C) Processing modus tilgjengelig etter å ha åpnet en tidligere registrert video. Røde bokser markere funksjoner omtalt i protokollen. Klikk her for å se større figur .
Figur 5. . Eksempel på NanoSight videoopptak og analyse Skjermbilder av prøven før videoopptak for prøve som ikke er utvannet nok (A), og med passende fortynning (B), Skjermbilder av analyse modus med partikkel deteksjonsgrensen satt for lavt (C) og riktig angitt (D), med røde trådkors som identifiserer alle partikler hensiktsmessig. Klikk her for å se større figur .
Figur 6. Størrelsesfordeling og plasmid per partikkel fordelingsdata for PBAE (B5S3E7, 60:1 polymer til DNA vekt / vekt) baserte nanopartikler analysert med NanoSight sporing analyseteknikken. Gjengitt fra [14] Lie, 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, Gonzalez ,J. og Green, JJ En roman analysen for å kvantifisere antall plasmider innkapslet av polymer nanopartikler, 367-373, 2012 opphavsrett tillatelse fra Wiley-VCH. Klikk her for å se større figur .
Figur 7. Eksperimentell tidslinjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene over beskriver metoder for å evaluere effekten av transfeksjon nanopartikkel formuleringer, så vel som en måte å karakterisere partikkelstørrelsen og DNA lasting av nanopartikler. Antallet plasmider per partikkel er en viktig parameter som kan bidra til å forutsi effektiviteten av partikkelen, og kan også brukes for dosebestemmelse. Nanopartikkel sporing analyse kan utføres i en rekke forskjellige vandige oppløsninger, slik som de forskjellige i saltkonsentrasjonen. Ofte denne karakteristikken er utført i PBS, for å etterligne fysiologisk saltvann. Mens dimensjonering i PBS kan gi et godt estimat av størrelsen av nanopartikler i media eller fysiologisk saltvann, kan mengden av serum Foreliggende påvirke størrelsen og stabiliteten av nanopartikler 17. Derfor kan partikkel karakterisering i forskjellige konsentrasjoner av serum være viktig for visse anvendelser, så vel. For å karakterisere de partiklene i serum, en tilleggsunnal trinn er anbefalt på grunn av den høye bakgrunn spredning av serumproteiner. I dette tilfellet, bør partiklene være fluorescensmerket tagget, slik at ved bruk av fluorescens-filter, kan partiklene være spesielt spores tydeligere fra serumproteiner.
Plasmidet per partikkel kvantifisering er generelt nok til å brukes med forskjellige nanopartikkel formuleringer, inkludert andre polymere eller uorganisk partikkelformige systemer. På grunn av de ulike lysspredning oppførsel av ulike materialer, videoopptak og prosessparametere må endres. Tillegg kan følsomheten av NTA endres avhengig av materialet. Plasmidet per partikkel protokollen beskrevet ovenfor er en rask og nyttig metode for å karakterisere nanopartikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takke TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) og NIH R21CA152473 for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
