Summary
纳米粒子跟踪分析（NTA）和高通量流式细胞仪来评价聚合物纳米基因传递的协议。 NTA用于表征的纳米粒子的粒径分布和每个粒子分布的质粒。高通量的基因传递的生物材料库，流式细胞仪，定量的转染效率评价。
Abstract
使用高分子纳米粒子的非病毒基因传递已经成为一个有吸引力的方法对基因疗法治疗遗传性疾病，再生医学的技术。与病毒不同，它具有显着的安全问题，聚合物纳米颗粒可以被设计为是无毒的，非免疫原性的，非诱变性，更容易合成，化学通用的，能够承载较大的核酸货物和可生物降解的和/或环境响应。的阳离子聚合物与带负电荷的DNA通过静电相互作用形成复合物的顺序为100nm的，通常被称为聚合物纳米颗粒的自组装。生物材料，用于以形成纳米级的聚阳离子基因传递纳米粒子的实例包括多聚赖氨酸，polyphosphoesters，聚（酰氨基胺）和聚乙烯亚胺（PEI），这是一种不可降解的关闭的，现成的阳离子性聚合物的核酸转1,3常用。聚（β-氨基酯）（PBAEs）是一个较新的类的阳离子聚合物4的水解降解的5,6，并已被证明是有效的基因传递到硬-转染的细胞类型，如人视网膜内皮的细胞（HRECs）7，小鼠乳腺上皮细胞，人脑肿瘤细胞和大血管内皮细胞（人类脐静脉内皮细胞）10。
一种新的协议来表征高分子纳米粒子，利用纳米粒子跟踪分析（NTA）。在这种方法中，得到的粒度分布和分布的每个粒子的数目的质粒11。此外，高吞吐量的96 - 孔板的聚合物纳米颗粒的转染效率进行快速筛选转染。在这个协议中，作为模型聚合物和人视网膜内皮的细胞（HRECs）的聚（β-氨基酯）（PBAEs）用作莫德尔人类细胞。这个协议可以很容易地适于评估任何聚合物纳米颗粒和感兴趣的任何类型的细胞中的多穴板的格式。
Introduction
每纳米粒子的复合物的质粒的数量的测定是很重要的设计有效的纳米粒子为基础的基因传递策略，特别是对于合作提供多个质粒给同一小区的目标，由于经常需要在干细胞重编程的研究12。已经描述了几种方法，来计算与一个单一纳米粒子的数目的质粒，每种方法都有缺点，用于估计13-16中所使用的技术。量子点（QD）标签结合TEM被用来估计每个粒子的质粒在基于壳聚糖的纳米粒子。估计这QD技术是复杂的，由于需要标记的DNA，这可能会改变其自组装特性;封装的未标记的DNA还没有直接检测的可能性;可能重叠的质粒和量子点在2D的颗粒的TEM图像;其他简化的假设13。另一种方法，是一个pplicable当排列的微颗粒中存在时，已被用来研究Lipopolyamine-DNA复合物，通过冷冻透射电子显微镜（冷冻TEM），X-射线散射，和动态光散射（DLS）14,15。不幸的是，这里考察的聚合物纳米颗粒材料，如用这种方法并不适用。 Collins 等人在另一项研究中，使用流动式粒子图像分析技术来研究（Lys）的16的含肽/ DNA复合物，但是，他们的方法只能评估较大，微米大小的颗粒16。因此，我们最近开发出一种新颖，灵活的检测，以量化的数量每11纳米粒子的质粒。
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Protocol
1。细胞接种
- 不要让细胞增长到overconfluency。早期传代细胞转染原代细胞时使用。
- 二十四小时，在转染前，trypsinize细胞，用血细胞计数器计数的细胞，并稀释以达到所需的细胞密度（细胞/体积）的细胞悬浮液与媒体。种子细胞转化为明确的组织培养处理的水库和多道移液器使用的平底96孔板。选择的密度应得到70-80％汇合的转染当天，。例如，如在表1中显示，细胞稀释至25至50个细胞/μL的转染在这里示出的数据。
2。细胞转染
- 稀释的聚合物和DNA股。解冻后的聚合物与DNA原液在室温（RT）。在明确的96 - 孔板，使用一个12通道移液器稀释聚合物原液和DNA原液，分开，与适当的溶剂中的所需浓度的DNA的重量比（重量/重量），以获得所需的聚合物重量。在这种情况下，所选择的溶剂是25 mM乙酸钠缓冲液（pH = 5.2时）。
- DNA稀释。通常情况下，存储在1毫克/毫升的DNA是在乙酸钠缓冲液稀释，在清晰的非组织培养处理的96孔板中（一个孔为一个单一的制剂）中的浓度为0.03〜0.06毫克/毫升。 表2所示为一个单一的制剂，用于转染4复制井从步骤1与细胞在96孔板中接种的典型的DNA稀释协议。
- 聚合物稀释。 100毫克/毫升聚合物/ DMSO溶液在乙酸钠缓冲液稀释，根据所要求的浓度，以获得所需的聚合物，DNA的重量/重量比。通常用于与聚（β-氨基酯）秒（PBAEs）的基因传递的范围内的重量/重量比为20〜100。 PBAE聚合物首先稀释至10毫克/毫升，然后由稀释P议定如表3中所示。的聚合物稀释，可以执行在一个明确的非组织培养处理的96孔板中的DNA稀释板的取向一致的样本。
- 纳米粒子的形成。加入等体积的质粒DNA溶液使用12通道移液器PBAE溶液并剧烈混合。让混合物在室温孵育10分钟，以允许自组装。
- 纳米粒子转染。 20微升的纳米粒子的自组装，每孔加入到培养基中滴加使用12通道移液器。复制井不及时治疗或用市售的转染试剂作为对照组。转染的细胞保温在37℃，两到四个小时，然后在各孔所取代用新鲜培养基（100μl/孔）。孵育时间的选择将依赖于细胞系，培养条件和转染系统。转染中的差异将被量化的效率和细胞毒性的结果不同潜伏期，通过分析在步骤3中描述的协议。
3。转染效率和细胞毒性分析
转染效率用荧光显微镜视觉分析，并用流式细胞仪转染后48小时，定量。细胞毒性分析用荧光显微镜可视化和量化的使用CellTiter 96水溶液测定24小时转染后的。
- 荧光显微镜。可视化地分析井使用的适当的荧光通道的转染报道基因（例如，绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白）的表达。采集图像的每个孔中，选择的视场，适当地表示为特定的配方（ 图1）的转染效率。请记下任何肉眼观察的细胞毒性。
- 流式细胞仪。
- 使用准备96孔板流式细胞仪的多道移液器。用PBS洗涤，用30μl/孔的胰蛋白酶/ EDTA，与170微升的FACS缓冲液（PBS +2％胎牛血清）中，移液管和各孔中，包括在边缘周围trypsinize，和转移的整个200微升体积的在一个圆底或V形底96孔板的各孔成相应的井。
- 离心板，在130×g离心5分钟，在4℃下
- 从每口井和吸液重悬细胞，同时避免气泡中取出170微升媒体。使用可行性，如碘化丙啶（PI）染色，FACS缓冲液+ PI（50:1 FACS缓冲液：稀释PI PI股票浓度为1毫克/毫升），每孔加入10μl。立即放在冰，覆盖了从光。
- 启动C6 Accuri的流式细胞仪，附件96的HyperCyt，超级软件。使用超级设计“和”议定书“选项卡，选择适当的P晚型，板布局，和其他设置，如抖动/ SIP /清洗/摇晃时间。对于上述的协议，使用了以下的参数，预板总理一分钟，并在2400转30秒预板晃动。品尝时间设置为15秒，15转，探头清洗每2秒，并，井间摇晃，持续12秒，每12口井在2400转。重要的是要保持细胞分散在媒体上，以及改进的能力来处理数据通过包括定时井组（在这种情况下，12秒）的时间间隔，井间的晃动。
- 使用超级井标识“选项卡来处理数据到适当的孔中（ 图2）和单独的。为了确定单井，它可以帮助使用该软件的噪声滤波器，以及包括基地连过滤器的高级设置。
- 量化比例正转染的活细胞，通过适当的门来分隔不同的弹出ulations（ 图3）。首先查看流量数据上的FSC与SSC分散的情节，以不同的细胞碎片（ 图3A）。如果使用碘化丙啶（PI），栅极个别的细胞群体，并检视，为了分离从死细胞和门的活细胞的活细胞上的FSC对比FL3情节数据。为了量化转染细胞的数量，查看现场的细胞群，在适当的渠道，例如，GFP可以看出，在FL1。使用未处理的人口，栅极的未处理的细胞，以便确定的背景信号（ 图3B）。正转染细胞，然后可以使用该栅极分离和通过查看使用散和等高线图（ 图3C和3D）转染的种群。有可能是一个连续的正转染的细胞，不同的细胞将被转染到不同程度的荧光。
- CellTiter 96水分析
- 转染在完全相同的方式进行细胞毒性测量另一个板。
- 预混和物1毫升的CellTiter 96水溶液的一个测定溶液用10ml的新鲜培养基。从细胞中移除介质，并使用多道移液器加110微升的预混液+每口井的媒体。
- 每一个小时的时间间隔为1至4小时，直到在490nm处的吸光度与未处理的条件从阱是在测定的线性范围内，测量吸光度。包括4个控制井，唯一的解决办法+媒体背景吸光度读数。
- 平均吸光度值从四个重复的井每条件和减去平均背景吸收，从每个平均。规范化校正为每个处理的条件下的平均校正的未处理的条件来确定的％的细胞存活率的平均。
- 总理的NANOSIGHT NS500射流系统运行稀释剂泵，约五分之一的最大速度和采样泵落后，约十分之一的最大速度。继续，直到射流系统与稀释液冲洗。
- 准备以进行分析的纳米颗粒。以箱子PBAEs，分别稀释存货质粒DNA（1毫克/毫升）和股票PBAE（100毫克/毫升）在乙酸钠缓冲液（25mM的，pH值为5）在Eppendorf管中。
- 稀释的质粒DNA的浓度为0.06毫克/毫升。可以变化，这取决于所需的聚合物的重量的重量比为60 wt / wt的颗粒的DNA（例如，聚合物浓度，聚合物稀释至3.6毫克/毫升）。
- 的聚合物溶液加入到等体积的质粒DNA溶液，并剧烈混合。孵育混合物在室温下搅拌10分钟，以允许自组装。
- 迪琵琶纳米颗粒溶液中的纳米粒子的浓度依次为100倍到PBS在适当的范围内，NTA，以获得最终的体积至少为500微升。
- 装入到NANOSIGHT样品通过将加载管进入样品的Eppendorf管中（ 图4A）。确保不引入气泡。
- 在拍摄模式下，增加相机的水平，，直到颗粒可以看出。调整的重点，使粒子看起来光滑（ 图4A和4B）。
- 而在标准模式下，调整相机的水平，所有的粒子在屏幕上可以看到过去的点。然后减少相机的水平以使得颗粒都可以仍然可以观察到的最低水平。如果中间相机的水平是必要的，进入高级模式，修改相机快门，并获得到适当的水平。
- 目视检查，以确保有20 - 100粒子在Screen。纳米粒子跟踪的一个理想的数字是约50颗。如果有过多或过少，冲洗NS500，调整稀释到PBS，并重新加载样本。
- 调整捕捉持续时间，根据标准模式表。通常为30 - 60秒是一个适当的捕获长度（ 图4B）。
- 加载下一个样品，冲洗系统，然后重新加载新的样本。
- 一旦被捕获的视频，打开一个视频文件进行处理阶段。
- 有许多参数，这些参数可以被调谐，以最好地处理视频（ 图4C）。我们的目标是最好的选择参数，捕捉每一个粒子在屏幕上显示一个红色的十字标记在每个粒子在屏幕上（ 图5），。
- 增加屏幕增益，以更好地看到粒子。在标准模式或高级模式下，选择自动调整的参数clickin克在相应的框中。以自动设置的情况下，不充分选择颗粒，取消勾选框，并手动设置参数（ 图4C）。
- 一旦所有的粒子都挑在屏幕上，单击该进程按钮的软件处理视频文件（ 图4C）。这提供的颗粒尺寸分布，尺寸的平均值，以及颗粒浓度。
- 为了使粒子的浓度是准确的，改变PBS稀释，如增加了2倍的稀释，重复上述步骤。测量多个相同的样品稀释液，建议，以确保样品的浓度测量是精确的。一个很好的测量范围是10 7 -10 9个/毫升。
- 验证质粒纳入凝胶电泳的纳米粒子，纳米粒子，并评估是否有任何免费的DNA是存在的。如果不是所有的质粒被封装，使用标准技术来测量为了量化总封装的质粒DNA的吸光度。
- 要计算每个粒子的平均数量质粒，将总的封装质粒的浓度由国家旅游局测得的颗粒物浓度。为了估计质粒的每个粒子的样本分布，第一使用NTA粒子的大小直方图计算的体积分数各1纳米颗粒斌。总质粒量乘以体积分数分布，以获得在每个容器的质粒。除以这些数字的各bin中的颗粒数，得到的质粒，每个粒子的数目的每个粒子的大小（ 图6）。
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Representative Results
图1示出了荧光显微镜图像的一个例子的一个成功的转染与EGFP质粒HRECs。亮场图像是有帮助的，以确保细胞保持自己平时的形态。此外，细胞活力检测，如MTS或类似的检测，可以用来评估的纳米粒子毒性7。流式细胞术，如所述，可以用来量化的转染效率。当使用HyperCyt的多井板附件，数据将需要进行适当的处理，为了正确地识别各孔。中可以看出， 图2中 ，在右侧面板中时，细胞计数是好的（千个细胞每孔），和射流正确操作，单个井更容易挑出手动和由软件。然而，如果在细胞计数太低或与射流存在一个问题，它也变得更难以识别individUAL井（ 图2的左侧面板），以及实验可能需要被重复。更换管道的Hypercyt往往可以解决问题的样品流。单井数据一旦被获得，最常见的流式细胞仪软件可以用来分析导出的。FCS文件。在图3中，FlowJo用于栅极的正转染细胞进行比较未处理井。
PBAE纳米粒子通常在100 - 200纳米大小的NANOSIGHT有形资产净值来衡量的。当执行NTA，重要的是，在屏幕上的纳米颗粒的数目是在20 - 100之间，因此，该软件将是能够准确地跟踪颗粒图5A是太多的颗粒的一个例子，而图5B示出了一个例子的一个适当的数。应做处理所捕获的视频，使得屏幕上的被观察到的粒子由仿真软件拾起 E，代表的红色十字线。的一个例子，当拿起颗粒的阈值太低时，可以看出，在图5C中 ，而更好的阈值电平的一个例子出现在图5D。可以执行一个不同的稀释样品，以确保该样品是在正确的浓度范围内。新的NANOSIGHT颗粒物浓度应符合新的稀释。一旦尺寸和颗粒浓度，得到的质粒的每个粒子的平均和分布可以计算出来。实施例的结果可以看出，在图6中。在图7中所示的实验时间轴。
| 韦尔斯/板 | 体积/（μL） | 细胞/孔 |
| 96 | 100 | 2500至5000 |
| 韦尔斯/板 | 体积/（μL） | 颗粒体积/（μL） | DNA /好（微克） | DNA（微克/微升） | DNA 1μg/μL的股票（微升） | 乙酸钠（微升） |
| 96 | 100 | 20 | 0.6 | 0.06 | 3 | 47 |
表2中。典型的DNA稀释协议，用于96孔板格式。
| 聚合物：DNA（重量/重量） | 颗粒体积/（μL） | ＃复制井 | DNA /好（微克） | 聚合物/好“（微克） | 聚合物/ 10微克/微升股票（微升） | 乙酸钠（微升） |
| 20 | 20 | 4 | 0.6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0.6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0.6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0.6 | 60 | 30 | 20 |
表3中。典型的聚合物的稀释协议，用于在96 -孔的板格式。
图1。单色通道荧光成像的HRECs，转染与PBAE的。（左）GFP荧光，绿色;（中）明图像（右）复合图像。
图2。 Hypercyt软件以及识别步骤，收集数据后（左）的例子有问题的数据，由于低计数问题与射流;（右）例干净的数据，很容易识别的井。 点击此处查看大图 。
图3。 FlowJo门控EGFP质粒转染的细胞。（A）FSC与SSC未经处理的细胞的（B）FL1对FL3为untreated细胞;（C，D）FL1对FL3与PBAE转染的细胞。是有用的，以确定位置绘制“门的两个伪色密度（C）和（D）的等高线图。
图4。该NanoSight纳米粒子跟踪分析软件，2.2版的部分截图。（A）射流控制;（B）捕捉模式下，用于捕获视频的纳米粒子（C）的处理方式后打开一个以前拍摄的视频。红盒的亮点功能的协议进行了讨论。 点击此处查看大图 。
图5。的NANOSIGHT视频捕获和分析的实例。截图视频采集的样品前的样品稀释足够的（A），并与相应的稀释液（B）;截图分析模式与粒子探测阈值设置得太低（C），并进行适当设置（D），适当地确定所有的粒子用红色十字线。 点击此处查看大图 。
图6。转载从[14]小，8，Bhise，NS，Shmueli，RB，冈萨雷斯尺寸分布和质粒每粒子分布数据PBAE（B5S3E7，60:1的聚合物与DNA的重量/重量），基于纳米粒子使用NANOSIGHT跟踪分析技术进行分析。 ，J.，绿色，JJ质粒封装的聚合物纳米粒子，367-373，版权所有2012年，Wiley-VCH的许可量化的一种新的分析。 点击此处查看大图 。
图7。实验的时间表。
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Discussion
上述的协议描述评估转染效率的纳米颗粒的制剂，以及一种方法来表征的纳米粒子的粒径和DNA装载的方法。每个粒子的数目的质粒是一个重要的参数，该参数可以帮助预测粒子的有效性，也可以被用于剂量测定。纳米粒子跟踪分析，可以执行在一个范围内的不同的水溶液，如那些不同的盐浓度。这通常表征在PBS中进行，到模仿生理盐水。虽然在PBS中的尺寸可以得到一个良好的估计媒体或生理盐水中的纳米颗粒的大小，存在血清的量可以影响纳米粒子17的尺寸和稳定性。因此，在不同浓度的血清颗粒表征是重要的，某些应用程序也是如此。为了表征的其他血清，颗粒信号的步骤是建议由于血清蛋白的高背景散射。在这种情况下，颗粒应该是荧光标记的，所以，通过使用的荧光过滤器，颗粒可具体跟踪从血清蛋白明显。
的质粒的每个粒子的定量一般足以用于与不同的纳米颗粒制剂，其中包括其它的聚合物或无机颗粒系统。由于不同的材料，不同的视频捕捉和处理参数的不同的光散射行为可能需要进行修改。此外，有可能发生变化的灵敏度的NTA取决于材料。质粒每个粒子的协议，上述表征纳米粒子是一个快速和有效的方法。
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Disclosures
这组作者报告没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢的TEDCO的MSCRF（2009-MSCRFE-0098-00）和美国国立卫生研究院R21CA152473的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
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