Summary
En protokol til nanopartikler sporing analyse (NTA) og højkapacitetsidentifikation flowcytometri for at evaluere polymere genafgivelsessystemer nanopartikler beskrives. NTA anvendes til at karakterisere nanopartikel partikelstørrelsesfordeling og plasmidet pr partikelfordeling. High-throughput flowcytometri muliggør kvantitativ transfektion Effektevalueringen for et bibliotek af gen-leveringsvehikler biomaterialer.
Abstract
Ikke-virale gen-levering ved anvendelse af polymere nanopartikler har vist sig som en attraktiv fremgangsmåde til genterapi til behandling af genetiske sygdomme 1 og som en teknologi til regenerativ medicin 2. Modsætning til vira, som har væsentlige sikkerhedsproblemer kan polymere nanopartikler være udformet til at være ikke-toksisk, ikke-immunogen, ikke-mutagene, lettere at syntetisere, kemisk alsidig, kan bære større nukleinsyre fragt og bionedbrydelige og / eller miljømæssigt responsiv. Kationiske polymerer selv samle med negativt ladet DNA via elektrostatisk interaktion til dannelse af komplekser af størrelsesordenen 100 nm, som normalt betegnes polymere nanopartikler. Eksempler på biomaterialer anvendes til dannelse nanoskala polykationiske genafgivelsessystemer nanopartikler indbefatter polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoaminer) s og polyethylenimin (PEI), som er en ikke-nedbrydelige off-the-shelf kationiske polymer almindeligvis anvendes til nukleinsyreadministrationskompleks 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) er en nyere klasse af kationiske polymerer 4, som er hydrolytisk nedbrydelig 5,6 og har vist sig at være effektive til genafgivelse til svære at transficere celletyper, såsom humane retinale endotelceller (HRECs) 7, muse mamma-epiteliale celler 8, menneskelige hjerne cancerceller 9 og makrovaskulære (human navlevene, HUVEC'er) endotelceller 10.
En ny protokol til at karakterisere polymere nanopartikler anvender nanopartikler tracking analyse (NTA) er beskrevet. I denne fremgangsmåde er både partikelstørrelsesfordelingen og fordelingen af antallet af plasmider pr partikel opnået 11. Endvidere er et high-throughput 96-brønds plade transfektionsassay til hurtig screening af transfektion effektiviteten af polymere nanopartikler præsenteret. I denne protokol, er poly (beta-amino ester) s (PBAEs) anvendes som model polymerer og humane retinale endotelceller (HRECs) anvendes som model humane celler. Denne protokol kan let tilpasses til at evaluere en polymer nanopartikel og enhver celletype af interesse i en multi-brønds pladeformat.
Introduction
Bestemmelse af antallet af plasmider kompleksbundet pr nanopartikel er vigtigt at udforme effektive nanopartikel-baserede genafgivelsessystemer strategier, navnlig til samtidig tilførsel af multiple plasmider i den samme celle målet, som det ofte er nødvendig stamcelle omprogrammering studier 12. Få metoder til at beregne antallet af plasmider, der er forbundet med en enkelt nanopartikel er blevet beskrevet, og hver metode har ulemper i de teknikker, der anvendes til estimering 13-16. Kvantepunktet (QD) mærkning kombineret med TEM er blevet anvendt til at estimere plasmider pr partikel i chitosan-baserede nanopartikler. Estimation med denne QD teknik er kompliceret på grund af behovet for at mærke DNA, hvilket kan ændre sine selvsamling egenskaber, muligheden for, at indkapslede umærket DNA ikke er umiddelbart detekteres; potentielt overlappende plasmider og QDs i 2D TEM-billeder af partikler, og andre forenklende antagelser 13. En alternativ fremgangsmåde, der er enpplicable når ordnet mikrodomæner findes i partiklerne er blevet anvendt til at undersøge lipopolyamin-DNA-komplekser via cryo-transmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM), røntgenspredning, og dynamisk lysspredning (DLS) 14,15. Desværre materialer, såsom de polymere nanopartikler undersøgt her ikke anvendelse med denne metode. I en anden undersøgelse anvendes Collins et al en strøm partikel billedanalyse teknik til at studere (Lys) 16-indeholdende peptid / DNA-komplekser. Kan imidlertid deres metode kun evaluerer større, mikrometerstore partikler 16. Således har vi for nylig udviklet en ny og fleksibel assay til at kvantificere antallet af plasmider pr nanopartikel 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellepodning
- Lad ikke cellerne til at vokse til overconfluency. Benytte tidlige passage-celler ved transfektion af primære celler.
- Fireogtyve timer før transfektionen Trypsinisér cellerne, tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer, og fortyndes cellesuspensionen med medier for at opnå den ønskede celledensitet (celler / volumen). Seed celler i klar vævskultur-behandlet fladbundede plader med 96 brønde under anvendelse af en beholder og multikanalspipetter. Den valgte massefylde bør give 70-80% konfluens på dagen for transfektion. For eksempel, som vist i tabel 1 blev cellerne fortyndet til 25 til 50 celler / gl til transfektion viste data.
2. Celletransfektion
- Fortynding af polymer og DNA-lagre. Tø polymer og DNA-stamopløsninger ved stuetemperatur (RT). Fortyndet polymer lageropløsning og DNA-stamopløsning, separat i klare plader med 96 brønde under anvendelse af en tolv-kanals pipette, Med det passende opløsningsmiddel med koncentrationer, der kræves for at opnå den ønskede polymer vægt DNA vægtforhold (vægt / vægt). I dette tilfælde er det valgte opløsningsmiddel 25 mM natriumacetatpuffer (pH = 5,2).
- DNA fortynding. Typisk DNA opbevares ved 1 mg / ml fortyndet i natriumacetat-puffer til en koncentration på 0,03 til 0,06 mg / ml i en klar ikke-vævskultur-behandlet 96-brønds plade (én brønd til en enkelt formulering). Tabel 2 viser den typiske DNA fortynding protokol for en enkelt formulering anvendt til at transficere fire replikatkulturer brønde i en plade med 96 brønde podet med celler fra trin 1.
- Polymer fortynding. 100 mg / ml polymer / DMSO-opløsning fortyndes i natriumacetatpuffer ifølge den koncentration, der kræves for at opnå den ønskede polymer til DNA vægt / vægt-forhold. Rækken af vægt / vægt-forhold typisk anvendes til genafgivelse med poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) er 20-100. PBAE polymerer er først fortyndet til 10 mg / ml, efterfulgt af fortynding protocol som vist i tabel 3. De polymere fortyndinger kan udføres i en klar ikke-vævskultur-behandlet 96-brønds plade, der svarer til prøven orienteringen af DNA fortynding pladen.
- Nanopartikel dannelse. Tilsæt PBAE løsning til et tilsvarende volumen af plasmid-DNA-opløsning ved hjælp af en tolv-kanals pipette og der blandes kraftigt. Lad blandingen inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter for at tillade selvsamling.
- Nanopartikel transfektion. Efter selvsamling, der 20 ul nanopartikler tilsat per brønd til dyrkningsmediet dråbevis med tolv-kanals pipette. Replikatbrønde efterlades ubehandlede eller transficeres med kommercielt tilgængelige reagenser som kontrolgruppe. De transficerede celler inkuberes ved 37 ° C i 2-4 timer og derefter Brøndene erstattet med frisk medium (100 ul / brønd). Valget af inkubationstid vil afhænge af cellelinjen, dyrkningsbetingelser og transfektionssystemet. Forskellen i transfektionseffektiviteteffektivitet og celletoksicitet som resultat af varierende inkubationstid vil blive kvantificeret ved analyse protokollen beskrevet i trin 3.
3. Analyse af transfektionseffektiviteten og celletoksicitet
Transfektionseffektivitet analyseres visuelt med et fluorescensmikroskop og kvantificeret ved anvendelse af et flowcytometer 48 timer efter transfektion. Celletoksicitet analyseres visuelt med et fluorescensmikroskop, og kvantificeret ved anvendelse af CellTiter 96 Aqueous One assay 24 timer efter transfektion.
- Fluorescensmikroskopi. Visuelt analysere brøndene for ekspressionen af det transficerede reportergen (for eksempel EGFP eller DsRed) anvendelse af det passende fluorescenskanal. Erhverve billeder for hver brønd, vælger synsfelter, der korrekt repræsenterer transfektionseffektivitet for de særlige formuleringer (figur 1). Notér hvilken som helst celle toksicitet observeret visuelt.
- Flowcytometri.
- Brug multikanalspipetter til fremstilling af 96-brønds plade til flowcytometri. Vask med PBS, Trypsinisér med 30 gl / brønd af trypsin / EDTA, neutraliseres med 170 pi FACS buffer (PBS + 2% FBS), pipette op og ned i hver brønd, herunder omkring kanterne, og overføre hele 200 pi volumen hver brønd i tilsvarende brønde i en rundbundet eller V-bundede 96-brønds plade.
- Centrifugeres pladen ved 130 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Fjern 170 ul medier fra hver brønd og pipette til resuspendering celler og samtidig undgå bobler. At anvende en levedygtighed plet som propidiumiodid (PI), tilsættes 10 pi FACS buffer + PI (50:1 FACS buffer: PI fortynding PI stock koncentration 1 mg / ml) til hver brønd. Anbring straks på is og dække mod lys.
- Start C6 Accuri flowcytometer, at HyperCyt 96-brønds fastgørelse, og HyperView software. Brug HyperView Design og protokol fanerne for at vælge den rigtige psen type, plade layout, og andre indstillinger såsom ryste / sip / skylle / ryste tid. For den ovennævnte protokol blev de følgende parametre anvendes, en for-plade prime i et minut, og en for-plade omrystes i 30 sekunder ved 2400 rpm. Sip tid blev fastsat til 15 sekunder ved 15 rpm, en probe skylles hver brønd i 2 sekunder, og en inter-og omrystning hver 12 brønde i 12 sekunder ved 2400 rpm. Den inter-og shake er vigtigt at holde cellerne dispergeret i medierne, og for forbedret evne til at behandle data ved at inkludere timede pauser mellem grupper af brønde (i dette tilfælde 12 sekunder).
- Brug HyperView Well-fanen til at behandle oplysningerne og separate ind i passende godt (figur 2). For at identificere de enkelte brønde, kan det hjælpe at bruge softwarens støj filter, samt herunder en base selv filter under de avancerede indstillinger.
- Kvantificere procentdelen af positivt transficerede levende celler ved passende gating at adskille forskellige popfolkninger (figur 3). Først vist strømdata på en FSC versus SSC punktdiagram for at separere celler fra affald (figur 3A). Hvis propidiumiodid (PI) blev anvendt, gate den enkelte cellepopulation og at data på et FSC versus FL3 plot for at adskille levende celler fra døde celler og gate de levende celler. For at kvantificere antallet af transficerede celler, se den levende cellepopulation på passende kanaler, for eksempel, kan GFP ses i FL1. Ved hjælp af den ubehandlede population, de ubehandlede celler gate for at identificere baggrundssignalet (figur 3B). De positivt transficerede celler kan derefter isoleres ved hjælp af denne port og ved visning af de transficerede populationer ved hjælp af både scatter og kontur plot (fig. 3C og 3D). Der kan være et kontinuum af positivt transficerede celler, som forskellige celler skal transficeres med forskellige grader af fluorescens.
- CellTiter 96 Aqueous One assay
- Transficere en anden plade på nøjagtig samme måde for celletoksicitet målinger.
- Forblanding 1 ml af CellTiter 96 Aqueous One assay opløsning med 10 ml frisk medium. Fjern medier fra celler og anvende en multikanalpipette at tilføje 110 ul af forblandet opløsning + media per brønd.
- Måle absorbansen ved 490 nm hver time interval 1-4 timer, indtil absorbansen fra brønden med ubehandlet tilstand, er i det lineære område af assayet. Omfatter fire kontrolbrønde med eneste løsning + medier til en baggrund absorbans læsning.
- Gennemsnitlige den absorbansværdier fra de fire gentagne brønde pr betingelse og trække den gennemsnitlige baggrund absorbans fra hver gennemsnittet. Normalisere den korrigerede gennemsnit for hver behandlede tilstand til den korrigerede gennemsnit af den ubehandlede tilstand for at bestemme den procentvise cellelevedygtighed.
- Prime det fluidikhovedet system NanoSight NS500 ved at køre fortynder pumpe fremad ved ca 1/5th max hastighed og prøvetagningspumpen baglæns ved ca 1/10th max hastighed. Fortsæt, indtil fluidikhovedet systemet skylles med fortyndingsmiddel.
- Forbered nanopartiklerne, der skal analyseres. I tilfælde af PBAEs, fortyndes separat bestanden plasmid DNA (1 mg / ml) og lager PBAE (100 mg / ml) i natriumacetatbuffer (25 mM, pH 5) i Eppendorf-rør.
- Fortynd plasmid-DNA koncentration på 0,06 mg / ml. Polymerkoncentration kan variere afhængigt af den krævede vægt-vægtforholdet mellem polymer til DNA (fx til 60 vægt / vægt partikler, er polymer fortyndet til 3,6 mg / ml).
- Tilsættes polymeropløsningen til et tilsvarende volumen af plasmid-DNA-opløsning og blandes kraftigt. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 10 min for at tillade selvsamling.
- Dilut nanopartikel opløsningen 100 gange i PBS, for at nanopartikel fusions i det passende område for NTA og for at opnå et slutvolumen på mindst 500 pi.
- Indlæse prøven i NanoSight ved at placere loading røret i prøven Eppendorf-rør (fig. 4A). Sørg for ikke at indføre luftbobler.
- I capture mode, øger kameraet niveau indtil partiklerne kan ses. Justere fokus, således at partiklerne ser glat (fig. 4A og 4B).
- Mens du er i standardtilstand, skal du justere kameraet niveauet forbi det punkt, at alle partikler kan ses på skærmen. Derefter falde kameraet niveau til det laveste niveau, således at partiklerne kan alle stadig observeres. Hvis en mellemliggende kamera plan er nødvendig, skal du gå ind i avanceret tilstand og ændre kameraets lukker og få de relevante niveauer.
- Visuelt tjek for at sikre at der er mellem 20 - 100 partikler på screen. En ideel tal for nanopartikler tracking er omkring 50 partikler. Hvis der er for mange eller for få, skylle NS500, justere fortynding i PBS, og re-load prøven.
- Juster capture varighed i overensstemmelse med standard mode bordet. Typisk 30 - 60 sek er en passende capture længde (figur 4B).
- Sådan lægger du den næste prøve, skylle systemet, så genindlæse den nye prøve.
- Når videoer er fanget, gå videre til forarbejdningsstadiet ved at åbne en videofil.
- Der er en række parametre, som kan indstilles med henblik på optimal behandle en video (figur 4C). Målet er at vælge parametre, der bedst opfanger hver partikel på skærmen, som angivet ved et rødt kors på skærmen over hver partikel (fig. 5).
- Forøg skærmens gain til bedre at se partiklerne. Under den standard eller avanceret tilstand, vælge automatisk justering for parametrene ved clicking de relevante bokse. I det tilfælde, at den automatiske indstillinger ikke tilstrækkeligt vælger partikler, indstille Fjern markeringen af feltet og manuelt de parametre (figur 4C).
- Når alle partiklerne er plukket på skærmen, skal du klikke på processen knappen på software til at behandle video-fil (figur 4C). Dette tilvejebringer partikelstørrelsesfordelingen, størrelse gennemsnit, og partikelkoncentration.
- For at sikre sig, at partikelkoncentrationen er nøjagtig, ændre PBS fortynding, såsom ved stigende fortynding med 2, og gentage ovennævnte procedure. Måling af flere fortyndinger af den samme prøve anbefales at sikre, at koncentrationen af prøven er korrekt. Et godt område for måling er 10 7 -10 9 partikler / ml.
- Kontrollere, at alle plasmider inkorporeres i nanopartikler ved at køre gel-elektroforese af nanopartiklerne og evaluering af, om en frit DNA er til stede.Hvis ikke alle plasmider er indkapslet, anvender standardteknikker til måling af DNA-absorbans for at kvantificere totale indkapslede plasmider.
- For at beregne det gennemsnitlige antal plasmider pr partikel, dividere det samlede indkapslede plasmid koncentration af NTA målte partikelkoncentration. For at vurdere plasmidet per partikel prøve distribution, skal du først bruge NTA partikelstørrelse histogram til at beregne volumen fraktion af hver 1-nm bin partikel. Gang dette volumenfraktion fordeling af det samlede plasmid beløb for at få antallet af plasmider i hver bin. Opdele disse numre med antallet af partikler i hver bin til opnåelse af antallet af plasmider pr partikel for hver partikelstørrelse (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et fluorescensmikroskopi billede af et eksempel på en succesfuld transfektion af HRECs med EGFP plasmid. The brightfield billede nyttigt at sikre, at celler bevarer deres normale morfologi. Derudover kan cellelevedygtighedsassays, såsom MTS eller lignende assays, anvendes til at vurdere den nanopartikel toksicitet 7. Flowcytometri, som beskrevet, kan anvendes til at kvantificere transfektionseffektivitet. Ved brug af HyperCyt multi-brønds plade fastgørelse, bliver dataene skal behandles hensigtsmæssigt med henblik på at identificere de brønde. Som det kan ses i det højre panel i figur 2, når celletællinger er gode (tusindvis af celler per brønd), og fluidikken fungerer korrekt, de enkelte brønde er lettere at udvælge både manuelt og af softwaren. Men hvis celletallet er for lav, eller der er et problem med fluidikken, bliver det meget vanskeligt at identificere de indiduel brønde (venstre panel i figur 2), og forsøget sandsynligvis skal gentages. Udskiftning af slangen af Hypercyt kan ofte løse problemer med prøvestrømmen. Når de individuelle og data opnås, kan mest almindelige flowcytometri software anvendes til at analysere de udførte. FCS filer. I figur 3 er FlowJo anvendes til at gate de positivt transficerede celler ved sammenligning med de ubehandlede brønde.
De PBAE nanopartikler er normalt mellem 100-200 nm i størrelse som målt ved NanoSight NTA. Når der udføres NTA, er det vigtigt, at antallet af nanopartikler på skærmen være mellem 20 -. 100, således at softwaren vil være i stand til at følge partiklerne figur 5A er et eksempel på for mange partikler, medens figur 5B viser et eksempel på et passende antal. Behandling af optaget video skal gøres sådan, at de observerede partikler på skærmen bliver samlet op af Softwar e, repræsenteret med de røde trådkors. Et eksempel når tærsklen til opsamling af partikler er for lav kan ses i figur 5C, medens et eksempel på en bedre tærskelniveau ses i figur 5D. En anden fortynding af prøven kan udføres for at sikre, at prøven er i den korrekte koncentrationsområde. Den nye partikelkoncentration givet ved NanoSight skal matche den nye fortynding. Når først størrelse og partikelkoncentration opnås, kan plasmidet pr partikel gennemsnit og fordelingen beregnes. Eksempel resultater kan ses i figur 6. Den eksperimentelle tidsforløb vist i figur 7.
| Wells / Plate | Volumen / Well (pl) | Celler / brønd |
| 96 | 100 | 2.500 til 5.000 |
| Wells / Plate | Volumen / Well (pl) | Particle Volumen / Well (pl) | DNA / brønd (ug) | DNA (pg / pl) | DNA 1 pg / pl stock (pi) | NaAc (pi) |
| 96 | 100 | 20 | 0,6 | 0,06 | 3 | 47 |
Tabel 2. Typisk DNA fortynding protokol for en 96-brønds plade-format.
| Polymer: DNA (vægt / vægt) | Particle Volumen / Well (pl) | # Repliker Wells | DNA / Well(Pg) | Polymer / brønd (ug) | Polymer / 10 pg / pl stock (pi) | NaAc (pi) |
| 20 | 20 | 4 | 0,6 | 12 | 6 | 44 |
| 40 | 20 | 4 | 0,6 | 24 | 12 | 38 |
| 60 | 20 | 4 | 0,6 | 36 | 18 | 32 |
| 100 | 20 | 4 | 0,6 | 60 | 30 | 20 |
Tabel 3. Typiske polymer fortynding protokol for en 96-brønds plade-format.
Figur1. Single farvekanal fluorescensimagografi af HRECs transficeret med PBAE (Venstre) GFP-fluorescens, farvet grøn. (Middle) Lysfelt image; (højre) Sammensat billede.
Figur 2. Hypercyt software godt identifikation trin efter indsamlede data (Venstre) Eksempel på problematiske data på grund af et lavt antal eller problemer med fluidikken.. (Højre) Eksempel på rene data, med let identificerede brønde Klik her for at se større figur .
Figur 3. FlowJo gating for celler transficeret med EGFP plasmid (A) FSC versus SSC for ubehandlede celler. (B) FL1 versus FL3 for untreated celler (C, D) FL1 versus FL3 for celler transficeret med PBAE. Både pseudo-farvetæthed (C) og (D) kontur plots er nyttige til at bestemme placeringen at trække gates.
Figur 4. Screenshot af dele af NanoSight nanopartikel tracking analyse software, version 2,2 (A) fluidikken kontrol. (B) optagefunktion, bruges til at fange video af nanopartiklerne, (C) Processing tilstand tilgængelig efter åbning af en tidligere optaget video. Røde bokse fremhæve funktioner diskuteres i protokollen. Klik her for at se større figur .
Figur 5. . Eksempel på NanoSight videooptagelse og analyse Screenshots af prøven før videooptagelse for prøve, der ikke er fortyndet nok (A), og med passende fortynding (B), Screenshots af analyse-mode med partikel påvisningsgrænse indstillet for lavt (C) og indstille korrekt (D), med røde trådkors identificerer alle partikler korrekt. Klik her for at se større figur .
Figur 6. Størrelsesfordeling og plasmid pr partikelfordeling data PBAE (B5S3E7, 60:1 polymer til DNA vægt / vægt) nanopartikler analyseret under anvendelse NanoSight sporing analyseteknik. Genoptrykt fra [14] Small, 8, Bhise, NS, Shmueli, RB, Gonzalez ,J., og Green, JJ En ny analyse til kvantificering af antallet af plasmider indkapslet af polymere nanopartikler, 367-373, Copyright 2012, med tilladelse fra Wiley-VCH. Klik her for at se større figur .
Figur 7. Eksperimentel tidslinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollerne ovenfor beskriver fremgangsmåder til evaluering af transfektion effekten af nanopartikel formuleringer, såvel som en metode til karakterisering af partikelstørrelsen og DNA loading af nanopartiklerne. Antallet af plasmider pr partikel er en vigtig parameter, som kan hjælpe med at forudsige effektiviteten af partiklen og kan også anvendes til fastsættelse af dosis. Nanopartikel sporing analyse kan udføres i en række forskellige vandige opløsninger, såsom de afviger i saltkoncentration. Ofte er denne karakterisering udføres i PBS, for at efterligne fysiologisk saltvand. Mens dimensionering i PBS kan give en god vurdering af størrelsen af nanopartiklerne i medierne eller fysiologisk saltvand, kan mængden af serum foreliggende påvirke størrelsen og stabiliteten af nanopartikler 17. Derfor kan partikel karakteristik i forskellige koncentrationer af serum være vigtig for visse anvendelser. For at karakterisere partiklerne i serum, en yderlinal trin anbefales på grund af den høje baggrund spredning af serumproteiner. I dette tilfælde bør partiklerne være fluorescerende mærket, så at ved anvendelse af fluorescens filter, kan partiklerne specifikt spores tydeligt fra serumproteiner.
Plasmidet per partikel kvantificering er generelt tilstrækkelig til brug med forskellige nanopartikel formuleringer, herunder andre polymere eller uorganiske partikulære systemer. På grund af den anderledes lysspredning opførsel af forskellige materialer, video capture og forarbejdning parametre muligvis skal ændres. Yderligere kan følsomheden af NTA ændre sig afhængigt af materialet. Plasmidet per partikel protokollen beskrevet ovenfor er en hurtig og nyttig metode til karakterisering af nanopartikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterer nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) og NIH R21CA152473 for support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA | |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
