巨脂质体制剂成像和膜片钳电

Summary

重构功能膜蛋白组成界定成巨脂质体是一个功能强大的方法，结合膜片钳电。然而，传统的巨头脂质体产量可能与蛋白质的稳定性不相容。我们描述生产从单纯的脂质的巨脂质体或小脂质体含有离子通道的协议。

Abstract

离子通道电生理记录的已有化学定义的脂膜的重组一直是一个强大的技术确定并探讨这些重要的蛋白质的功能。然而，经典的制剂，如平面双层，限制了可被执行的操作和实验上的重建的信道和它的膜环境。巨脂质体的细胞状结构允许在不牺牲脂质环境控制的传统的膜片钳实验。

electroformation>10μm的直径依赖于一个薄的，有序的脂质膜沉积在电极表面的交变电压的应用产生巨大的脂质体是一种高效的平均值。然而，由于经典的协议需要从有机溶剂中的脂质沉积，它是不兼容不太可靠的膜蛋白，如离子通道，并必须进行修改。近日，公关已经开发otocols部分脱水的小我们已经适应了在我们的实验室中的含蛋白质的脂质体的脂质体，脂质体从电铸巨。

我们在座的背景下，设备，技术，脂质体分散的小巨脂质体和陷阱electroformation。我们开始尝试更具挑战性的协议之前，应首先掌握经典的协议。我们证明了小脂质体饱和盐溶液的蒸汽平衡的过程中，控制部分脱水。最后，我们演示过程的electroformation本身的。我们将描述简单，价格低廉的设备，可在内部，以产生高质量的脂质体，并描述在每一个阶段的准备目视检查，以确保最佳的效果。

Introduction

巨脂质体（通常称为巨室脂质体，或GUVs的）主要被用来研究的物理和物理化学的脂质双层，包括研究的双层变形，横向相共存（“木筏”），膜融合等 ^1-4。他们有一个严重的细胞样结构：膜周围的水的内部，比周围的水性缓冲液中，可以很容易作出不同的球壳。 ，顾名思义，他们是≈直径1-100微米，所以他们可以使用各种光镜方法成像。它们可使用渗透压梯度或机械施加张力拉紧，因此，虽然一般较软，它们的属性可以被操纵，易于处理。特别是控制的“刚性”的脂质体，使得它可以直接形成“脂质体连接”或切除电补丁。在过去，主要是在平面脂B进行离子通道重建ilayers。现在，巨脂质体形成的补丁，并使用相当颤动的常规电开发工具（荧光显微镜，微吸管，快速灌注和温度控制等 ）的能力，使得巨脂质体重建研究^5,6越来越有吸引力。

巨脂质体已作出许多战略。事实上，巨脂质体膨胀过程自发形成，当干脂质膜水化^4,7,8。的愿望更加迅速地准备更大，更均匀的脂质体的研究人员领导的其他方法，其中最主要的electroformation ^1,9。 electroformation也依赖于水化干燥的脂质膜，但加速的过程中，通过应用一个振荡电场穿过脂质膜。施加电场时，通过两个电极，无论是铂丝或铟锡氧化物（ITO）涂层的载玻片，分离水或缓冲和脂质沉积其上。加快脂质体肿胀，达到较高的产量较大的脂质体。因此，electroformation已经成为默认的方式产生巨大的脂质体^4。

的electroformation的机理还没有完全理解，大多数协议都是依靠经验（ 例如 ^10,11）。然而，我们可以学到一点什么期望考虑的理论和一些实证结果。人们普遍认为，的发生electroformation通过驱动电渗流的缓冲液层叠在沉积的脂质膜^10,11之间的脂质双层。脂质双层静电耦合热波动也可能是涉及^12。这些假说定性预测的电场的频率和强度，可用于^10,12的上限。特别是，据预测，高导电性的解决方案（ 12。电渗流速率一般随盐的浓度增加，并经常达到高峰，一些电场振荡频率（ 例如，尽管在不同的几何形状，Green 等人 ）。因此，较高的磁场强度和更高的频率是合理的，高导电性的解决方案，在一定限度内^10。

然而，膜蛋白的脂质沉积到电极上，即在有机溶剂中，然后蒸发掉，留下一个薄的脂质膜为electroswelling过程与通常的方法很可能是不相容的。解决这个困难主要有两个路径：巨脂质体形成后，将蛋白质或脂质沉积，以适应如何。我们的做法的基础上存入脂类和reconsti的别人^5,11tuted膜蛋白从暂停或大或小的“蛋白脂质体”。我们描述了过程冗长，更具挑战性的脂蛋白体纯化的蛋白质和脂类（科林斯和戈登， 在审查）。这里，我们描述的协议，在没有任何蛋白质的情况下，但它是相同的蛋白结合时，我们包括结果显示，含有离子通道TRPV1受体的蛋白脂质体可以转化成GUVs用于膜片钳电生理。在任何electroformation方法中，脂质沉积过程过程中的脂质样品目视检查是成功的关键。

我们的做法可能超出了专门的应用程序相关的离子通道重建。在规定的时间，因为我们第一次开发了这个协议，现在也被证明的方式，脂质沉积在电极electroformation如何影响所产生的GUVs组成的异质性。 Baykal-恰拉尔的等¹⁴表明，，仔细脱水脂质体形成的GUVs有2.5倍的变化较小的混溶性化转变温度的各种磷脂和胆固醇的混合物形成的GUVs。他们的工作表明，脂质，尤其是胆固醇，可从脂质混合物沉淀在沉积有机溶剂时，导致沉积的脂质膜的组合物中的大的空间变化。脂质膜的相行为的研究，这是特别重要的，但也可以是离子通道功能的定量实验的关键。巴伊卡尔恰拉尔等人的协议是我们自己相似但不完全相同的，并鼓励读者研究。

此协议（见概述， 图1）是一个可以使用的许多。在原则electroformation成功依赖于脂质混合物，水化，温度，其他溶质（特别是离子），和当然，形成中使用的电压和频率。 ，由于electroformation变得更好理解，我们预期更加完善我们的协议。

最后，在电铸巨脂质体往往有一个陡峭的学习曲线。我们建议掌握学习脂质沉积脂质体悬浮液（2-5节）之前，传统的协议（第1和第4，和，如果有必要的话，第5节）。

Protocol

1。脂质沉积有机溶剂：古典协议

1. 删除脂质储存于-20℃或-80℃;温暖RT 注意：血脂极易吸湿，许多对氧气敏感。在干燥的氩气或氮气覆盖血脂，并在所有步骤尽量减少暴露在空气中 。
2. 如果有必要，在氯仿或环己烷暂停脂类在1-10毫克/毫升，注意制造商声明的浓度通常标称注意：在使用有机溶剂时，戴上适当的手套和其他个人防护装备。删除个人防护装备，很快，如果溶剂溅到他们，因为大多数材料的仍然是这些溶剂的渗透，它们只提供临时保护。
3. 清洁两侧的两个25 X 37.5毫米的ITO镀膜玻璃幻灯片用乙醇
4. 脂类混合，以达到所期望的摩尔比。每1厘米²的面积的ITO滑动唇涂有ID，混合〜15-20微克血脂。例如，如果两个25×37.5毫米幻灯片是完全包覆，我们通常使用30微升10毫克/毫升脂质混合物。 注：添加0.1％（摩尔），德克萨斯红DPPE用于荧光成像，请参阅下面的警告荧光染料。
5. 验证用欧姆表或万用表测量的表面电阻ITO镀膜侧玻片朝上。
6. 吸血脂耐溶剂性注射器注意：无胶或塑料，聚四氟乙烯以外，应该联系的有机溶剂。
7. 用注射器针头不太接触的ITO表面，慢慢地来回移动针幻灯片应用脂质。表面覆盖均匀，寻找“彩虹光泽”在玻璃表面。
8. <1托（1毫米汞柱）真空下快速将幻灯片0.5-1小时，删除任何痕迹溶剂。用惰性气体的释放真空。
9. 应用硅胶垫片，一个一层薄薄的两侧硅真空润滑脂。留出至少5毫米的未覆盖的滑动的一端暴露在滑动。
10. 立即着手第4节。

2。小脂质体准备控制脱水

1. 准备的脂质混合物在步骤1.1到1.4。
2. 在10至15毫米直径的培养管中使用的氩气或氮气流干燥的脂质。对于小批量的脂质，≤0.5毫克，得到的膜可以直接水合后，将其放置在真空下0.5〜1小时，以除去残留的溶剂，进行步骤2.5。数额较大的脂质往往捕获有机溶剂在厚厚的凝胶，即使在真空条件下，更好地准备冻干见步骤2.3-4。
3. 干燥后的脂质膜悬挂在环己烷中，用氩气和用塞子密封的盖，将管子在寒冷的块，冷冻在-80℃下至少1小时。
4. 放置在真空系统中的冷块和脂质样品能够达到100毫托。应用真空的，它会在约1托作为溶剂升华的“失速”。一旦完全除去溶剂（约1小时），真空将下降低于这个水平。与惰性气体一起推出真空，立即密封管或水合物。
5. 脂类是在真空条件下，采用真空脱气水化缓冲和喷射^15-17。
6. 水合物的脂质使用脱气缓冲液终浓度1-10毫克/毫升。允许脂类水合物缓慢。 30分钟，1小时后，涡分手剩余的团块。等待一个额外的0.5-1小时，让完全水化。使用一个osmoticant，如山梨糖醇或蔗糖至200mM，在下面的步骤中，以防止完全脱水。
7. 准备直径为100-200纳米的脂质体受到挤压。协议的详细信息，请参见制造商的挤压。请注意，该缓冲区必须有小于〜25 mM的离子强度，或的特殊electroformation电压协议第4节中，将需要。

3。脂质沉积控制小脂质体脱水

1. 注意：我们的协议需要被放置在多个小时，用饱和盐溶液的蒸气平衡的脂质。我们强烈建议在惰性气体气氛中进行的协议，使用的手套箱中，或类似的外壳。
2. 注意：如果含有蛋白质样品制备，避免完全脱水。水合物中的气氛与温水的烧杯中，任何外壳，或基于超声波仪的加湿器。使用，以确保有至少30％的相对湿度的湿度计。在小脂质体缓冲使用山梨糖醇或蔗糖作为一个额外的预防措施，防止脱水。
3. 准备适当的相对湿度饱和盐溶液。目标湿度取决于囊泡制剂的渗透压。渗透压与生理准备，用30-45％RH，而低渗透压泡准备可以充分脱水75-90％相对湿度（另请参阅表1）的平衡状态。
4. 将饱和盐溶液和过量的盐，在一个紧密密封的容器的内部搁板。商业食品容器酸奶和燕麦的工作非常出色。后更换货架充盈，确保流体在货架下面是5-10毫米。
5. 清洁的ITO涂层第1幻灯片。用万用表测量，以确定哪一面是导电的，并与样品名称，标签的一面不导电。
6. 抹油的聚硅氧烷（USP级VI）垫片（次）与一个或多个孔的两侧。
7. 将幻灯片导电侧在板凳上，并应用硅胶垫片（次），确保有至少为5毫米的外露滑动一端连接到的electroformation装置的每个幻灯片，将应用脂质。光滑的垫片，以确保良好的密封。
8. 在低盐等渗缓冲〜1-2毫克/毫升稀释囊泡准备。我们发现较高concentr的ations产生不良结果。
9. 应用脂质在1-10微升滴幻灯片。一般较小的墨滴产生更好的结果。
10. 将饱和盐溶液之上的室内货架上滑动密封容器。在室温下离开3小时到O / N容器可以被放置在4℃下，但注意，一些盐，将RH强烈地依赖于温度，和那个寒冷会增加平衡时间。
11. 所得到的膜，可能有轻微的彩虹光泽，但在任何情况下，应该会出现接近干涸。高渗透压的起始溶液可以是不可能完全干燥的脂质膜，这将不会产生不利影响的结果。

4。巨脂质体Electroformation

1. 脂片，特别是那些由脱水脂质体，容易脱落。 小心水合物的各孔中，放置一个27 G的注射器针头上面的垫片的边缘， 慢慢施加缓冲区。缓冲区可以包括水，≤200毫米蔗糖，山梨醇≤1 M≤5毫米肝素钠。超过10毫米的盐溶液可能需要备用electroformation电压协议。溢满每个垫片以及约10％。
2. 注：一旦脂类滋润，迅速 ​​完成剩下的步骤进行，因为脂质膜立即开始分层。产量和规模最大如果开始electroformation及时。
3. 以平滑的动作，应用第二个ITO滑动，导电面，最佳的垫片。确保外悬有至少5毫米的垫片区和对面的第一悬。轻轻按压以保证良好的密封。
4. 清洁两个出挑，用乙醇和验证双方面临的垫片是导电使用万用表。
5. 室可进一步用封口膜或轻张力弹簧夹固定，如果需要的话。
6. 固定铝或铜条，“EMI GASK的的electroformation室连接到一个电压源等发泡体，或导电性粘合带的导电性的两个滑动表面，我们使用：EMI垫圈泡沫状物。计划的夹具和夹紧， 如图5所示。
7. 验证是没有电气短路之间的接触，而且接触正确连接到ITO的表面，使用万用表。
8. 加热腔室10℃以上的最高熔化温度的任何脂类本例如为DPPC，加热到52℃下最小，链的熔化温度的42℃以上10℃
9. 对于低盐缓冲器，适用于10赫兹正弦波〜0.7 V _RMS每毫米两层ITO涂层表面之间的差距，为60-90分钟。对于高盐缓冲剂，应使用其他电压协议（请参阅参考资料）。

5。成像和故障排除

1. 图片的脂质体，使用倒置显微镜配备罗丹明或得克萨斯州的红色染料过滤器的多维数据集。该脂质体是球形的，单层为主眼，无缺陷，如“弦”，挂脂质体。
2. 如果脂质体太小，使用较少的脂质。
3. 如果有很多缺陷或几个脂质体，这可能是由于凝胶相的脂质。考虑提高温度electroformation。
4. 如果很少或没有巨脂质体形成在从脱水的小脂质体的脂质体的缓冲液中，减少渗透强度，或，增加渗透强度的electroformation缓冲区。缓冲到浓间质性缓冲溶液可引起浪涌的分层沉积的脂质膜。
5. 如果泡产量，质量或尺寸差，包括盐或pH缓冲的electroformation或脂质体缓冲区，考虑替代electroformation的电压协议。比如，波特， 等^。11，建议一个三个步骤的协议，使用一个500 Hz的正弦波，提高电压为50-1,300 Vpp /米在30分钟内，保持90分钟，N的减少30-60分钟频率为50 Hz。在这种情况下，铂金或钛的电极可能需要，但基本上不会改变协议。

Representative Results

在我们的例子中，我们准备了脂质体的混合物约55％（摩尔）POPC（1 -棕榈酰-2 -油酰-SN-甘油-磷酸胆碱），15％（摩尔）持久性有机污染物（1 -棕榈酰-2 -油酰-SN-甘油磷酸丝氨酸摩尔，30％胆固醇和0.1％（摩尔）德州红色标记的1,2 -二棕榈酰-SN-磷酸乙醇胺（TXR DPPE），这个组合被选为约代表性的背根神经节血脂^18，我们注意到，扣除15％（摩尔）脂质（POPS）的限制，可用于在electroformation（ 如 Walde的等^4）附近。

通过水解和过氧化脂质比较是一个特别重要的问题，许多脂质混合物和许多敏感的实验（见讨论）。对于单独的清晰度，我们不使用惰性气体环境中的视频演示。是显而易见的，从下面的图中，这不会明显地影响脂质体的质量，但对于敏感的研究或使用高度不饱和脂质时，重要的是要防止脂质击穿。

由于主要障碍electroformation是铟锡氧化物（ITO）衬底上形成良好的脂质膜，知道脂质膜看起来应该像干燥时是至关重要的。然而，当electroformation失败，它常常这样做完全，导致没有明显的脂质体生产巨头。频繁，大量碎屑会被观察到，这通常表示已使用太多的脂质。我们的数字显示，人们期望看到成功时。

图2显示了两种不同的补丁脂质体从脂质沉积氯仿电铸。在左侧面板中，审视箭头2和3所示的补丁。虽然箭头2表示一个补丁区分的不良脂质体，无脂质体可以在由箭头3表示的区域中，进入到聚焦。总之，这些研究结果表明普遍较差在这方面的准备，可能是由于有太多的脂质沉积。在右侧面板中，这样的“模糊”的区域则不太常见，一般更好的准备。我们发现，这是罕见的完全消除这种瑕疵。

图3显示了成功的电从脂质沉积脂质体小脂质体脱水，两个放大倍率，使用德州红萤光成像。脂质体是稀疏的，但也有几个很好的标本。因为大小不同，有几个重点。箭头指示〜5-20微米，其中两个出现在40倍放大图像大小不等的三个质量好脂质体。注意在边缘清晰的“环”：这表明单层或接近单层脂质体。虽然有些斑点似乎已经崩溃或从未形成脂质脂质，这是一个良好的质量结果。

最后，我们在开发和发布这个协议的目的是准备GUVs，完整的，功能性的哺乳动物离子通道是适合传统的膜片钳电生理。在图4中，我们证明辣椒素激活TRPV1的离子电流记录在切除从GUVs使用此协议的形成脂质膜补丁。目前可以阻止由钌红，辣椒素车辆（0.1％乙醇，138 mM氯化钠，3 mM的HEPES pH 7.4）中，单独不激活。编制脂蛋白体电生理实验是远远超出了本协议的范围，但提交文章的主题。

盐	摩尔浓度20°C和饱和度	％RH @ 10°C	％RH @ 20°C	％RH @ 30°C
六水氯化镁	5.8	33	33 32
碳酸钾二水	8	47	44	42
溴化钠	4.6	58	57	57
氯化铜	5.6	68	68	67
氯化钠	6.13	75	75	75
氯化钾	4.61	87	86	84

表1中。相对湿度（％RH）几种常见的盐。相对湿度数据从格林斯潘^19日和²⁰罗克兰饱和度数据从国际重要的表^21。

图1。小脂质体的巨型的脂质体electroformation从示意图。（左上）小脂质体存放在数组的小水滴，<5微升。 （顶部中心）的脂质体脱水控制相对湿度下，它们放置在一个密封的容器，饱和食盐水。湿度计是可选的。 （右上），一旦脱水至粘稠状的脂质膜和（可能的）osmoticant如山梨糖，脂类高渗缓冲液中（参见协议第5条），再水化。 （左下）的electroformation室密封与第二ITO滑动之上。 （右下）最后，腔室加热脂质链的熔融温度以上，并连接到一个信号源提供一个振荡电场横跨两个ITO幻灯片。

图3。电铸巨脂质体形成的脱水沉积的脂类。（左）在10倍的放大倍率，一些脂质体是可见的。三种脂质体标记。左（右）同样的观点，在放大40倍，与同标记的脂质体（2和3）。这些脂质体的数目通常是远小于从溶剂中沉积的脂质电铸时，用于多种用途，但完全足够。使用色度41004得克​​萨斯红色滤光片立方体和斯坦福大学光电XR/MEGA-10 S30增强型CCD相机配备了一个倒落射荧光显微镜成像。

图4。辣椒素激活TRPV1当前的GUV切除膜补丁从形成，使用此协议。A.泄漏电流500MΩ前密封阻力辣椒素。B.饱和辣椒素（> 20微米，在0.1％的乙醇）激活大TRPV1的电流，电流被阻断，钌红，按车辆没有被激活（在缓冲液中的0.1％的乙醇）（数据未示出）。C.的电流返回辣椒素洗出的补丁接近基线。

图5。计划室electroformation。包括概述，表示完整的组件，和尺寸的原理图的顶部和底部的塑料片，使用丙烯酸类或另一个容易加工的透明的塑料。应该连接的薄的聚酰亚胺薄膜加热器的温度控制器（见表特定的试剂和设备），EMI衬垫泡沫应连接到函数发生器的正弦波信号，从而使施加在两个ITO镀膜幻灯片。提供一个洞，一个温度探头。扁平头的10-32螺丝被放置在底部件的沉头孔中，并通过上片。 10-32螺母用来固定组件。当完全装配时，顶部和底部的塑料件应彼此平齐两侧（两侧平行于EMI垫圈） 点击这里查看大图 。

Discussion

发展成一个灵活的技术，兼容不同的血脂，准备和缓冲区巨脂质体Electroformation已。仔细的脂质沉积过程的控制是最关键的成功。我们已经提出了简单的工具，使小脂质体准备一个简单的过程控制血脂沉积。相对湿度是至关重要的适当初始脂质体脱水，将随溶质的初始浓度的脂质体悬浮液中的最佳值。较低的相对湿度是必需的，脱水更浓缩的样品，以适当的水平。

确切的的水化协议和电场用于electroformation的仍然是点^{1,4,7,10,11,22}讨论。最简单的协议，首先应掌握在尝试脂质体electroformation的前中存在高盐的浓度，带电血脂，或非常高浓度的高熔体安泰温度血脂。一旦掌握了这些技能，更先进的协议通常划分electroformation过程分为三个部分：初期的肿胀，生长和支队。初期的肿胀，好像被慢慢增加所施加的电场^11的青睐。第二阶段，可选固定磁场强度可以帮助控制脂质体的最终大小。最后，减小振荡场的频率可能有助于分离从ITO表面的脂质体。需要更高的频率在生理盐条件下¹¹电铸脂质体，但脂质体可以形成一个极其广泛的实地频率和振幅^10。

巨脂质体将补液脱水脂质体与低渗缓冲⁷时自发形成的观察表明几个成功的关键。首先，该脂质体的溶胀过程立即开始，使为electroformation，一些团体甚至发现它很有用补水的脂质膜¹⁰之前申请的交流电场。第二，它是可能的流体流动的驱动器的脂质体的膨胀过程，并至少部分由于电渗透驱动的流，electroformation发生。这使得限制的可使用的频率和幅度的范围内，可用于在electroformation ^10。

在过去几年中一直讨论的一个主要点脂质水解和过氧化^23,24的潜力。任何一种脂质降解的第一道防线是去除氧气GUV准备使用的所有材料：因为过氧化取决于分子氧^23，这应该相当缓慢的过程。用惰性气体喷入真空的组合，应使用尽可能^15-17以除去尽可能多的氧。超声和​​光真空是无效的。我们使用氧气检测试剂盒（K7501 Chemetrics）到verify，我们已经移除氧气为尽可能彻底。水解是更有害的，但通过保持中性pH值^25，和通过减少电压中使用electroformation ^24的减少。一些学者主张使用钛电极代替ITO滑动^{23,24,26,27。}我们宁愿避免污染我们的样品与钛（或金属）的可能性，因为它在过去被称为脂质体实验干扰^28,29，但它可能有助于防止一些过氧化或水解作用。不用说，长时间暴露在高温下加速脂肪分解^30。最后，薄层色谱法^24,31，比色测 ​​定法^23，其他方法³¹存在量化脂质退化。

类似的问题，涉及到的荧光脂质染料用于图像GUVs的，尤其是研究的横向相分离^30,32 30,33，并以最小的浓度使用。

我们不知道是否可重复使用的ITO电极幻灯片任何共识。许多团体做重用其ITO幻灯片，而有些不。最近的工作表明随着时间的推移，幻灯片做的降解的，但可以进行退火处理，以重新获得高性能^34;包括两性离子型或阴离子脂质的脂质混合物，这种退化仅有很小的影响，但对于含有阳离子脂质的混合物。我们重用幻灯片不退火。

虽然有很大的变异用于电铸巨脂质体，理论认识和实践经验的技术协议中的不断改进。已经脂质体可以形成大量的带电脂质，或在高盐缓冲液中。键仍然有效的脂质沉积在电极表面上，这h是我们的核心协议。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667