Giant Liposome Forberedelse til Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

Summary

Reconstituting funksjonelle membran proteiner i gigantiske liposomer definert sammensetning er en kraftig tilnærming når det kombineres med patch-clamp elektrofysiologi. Imidlertid kan konvensjonell gigantisk liposomen produksjonen være uforenlig med protein stabilitet. Vi beskriver protokoller for å produsere gigantiske liposomer fra rene lipider eller små liposomer som inneholder ionekanaler.

Abstract

Tilberedning av ionekanaler i kjemisk definerte lipid membraner for elektrofysiologisk registrering har vært en kraftig teknikk for å identifisere og utforske funksjonen til disse viktige proteiner. Men klassiske preparater, som for eksempel planar bilayers, begrense manipulasjoner og eksperimenter som kan utføres på den rekonstituerte kanalen og dens membran miljø. Jo mer celle-lignende struktur av gigantiske liposomer tillater tradisjonelle patch-clamp eksperimenter uten å ofre kontroll av lipidsystemet miljø.

Electroformation er en effektiv måte til å produsere store liposomer> 10 pm i diameter, som er avhengig av anvendelsen av vekselspenning til en tynn, bestilte lipidfilm avsatt på en elektrodeoverflate. Imidlertid, siden den klassiske protokollen krever lipidene for å bli deponert fra organiske oppløsningsmidler, er det ikke er kompatibel med mindre robuste membranproteiner som ionekanaler og må modifiseres. Nylig, protocols har blitt utviklet for å electroform gigantiske liposomer fra delvis dehydrert små liposomer, som vi har tilpasset seg protein-holdige liposomer i vårt laboratorium.

Vi presenterer her bakgrunnen, utstyr, teknikker og fallgrubene electroformation av gigantiske liposomer fra små liposomoppløsninger dispersjoner. Vi begynner med den klassiske protokollen, som skal mestres først før du prøver de mer utfordrende protokoller som følger. Vi viser prosessen med kontrollert partiell dehydratisering av små liposomer ved hjelp av damp likevekt med mettede saltløsninger. Endelig viser vi prosessen med electroformation selv. Vi vil beskrive enkel, billig utstyr som kan gjøres internt for å produsere høykvalitets liposomer, og beskrive visuell inspeksjon av preparatet på hvert trinn for å sikre de beste resultatene.

Introduction

Giant liposomer (ofte kalt gigantiske unilamillære blemmer, eller Guvs) har først og fremst blitt brukt til å studere fysikk og fysikalsk kjemi av lipid bilayers, inkludert studier av bilayer deformasjon, lateral fase sameksistens ("flåter"), membran fusion, ^1-4 etc. De har en grovt celle-lignende struktur: kuleskall av membranen som omgir en vandig indre som lett kan gjøres annerledes enn det omkringliggende vandig buffer. De er, per definisjon, ≈ 1-100 mikrometer i diameter, slik at de kan avbildes ved hjelp av en rekke lette mikroskopi tilnærminger. De kan være laget ved hjelp av stram osmotiske gradienter eller mekanisk påført spenning, slik at mens generelt myke, kan deres egenskaper bli manipulert for enkel håndtering. Spesielt styrer "stivhet" av liposomet gjør det enkelt å danne "liposom-festet" eller skåret lapper for elektrofysiologisk. I det siste, var ion-kanalen tilberedning i stor grad utført i planar lipid bilayers. Nå gjør evnen til å danne flekker fra gigantiske liposomer og bruker betydelige kogger av verktøy utviklet for konvensjonell electrophysiology (fluorescensmikroskopi, mikropipette aspirasjon, hurtig perfusjons-og temperaturkontroll, etc.) gigantiske liposomer stadig mer attraktivt for rekonstituering studier ^5,6.

Giant liposomer har blitt gjort av mange strategier. Faktisk gigantiske liposomer dannes spontant ved en svellende prosess når en tørket lipidfilm blir rehydrert ^4,7,8. Ønsket om å raskere forberede større, ledet mer ensartede liposomer forskere til andre tilnærminger, høvding blant dem electroformation ^1,9. Electroformation er også avhengig av hydratisering av en tørket lipidfilm, men hastigheter prosessen gjennom anvendelse av et oscillerende elektrisk felt på tvers av lipidfilmen. Feltet blir levert gjennom to elektroder, enten platina ledninger eller indium-tinn-oksyd (ITO) belagte glassplater, adskilt av vann ellerbuffer og hvorpå lipidene avsettes. Ved å påskynde hevelse av liposomer, oppnår man en høyere yield på større liposomer. Dermed har electroformation blitt standard metode for å produsere gigantiske liposomer ^fire.

Mekanismen for electroformation er ikke fullt ut forstått, og det meste av protokoller er utviklet empirisk (f.eks ^10,11). Likevel kan vi lære litt om hva du kan forvente ved å vurdere teori og noen empiriske resultater. Det er allment antatt at electroformation oppstår ved kjøring elektro-osmotisk flyt av buffer mellom individuelle lipid bilayers stablet i deponert lipidfilmen ^10,11. Elektrostatisk kopling til termiske svingninger av lipid bilayers er trolig også involvert ^12. Disse hypoteser kvalitativt forutsi øvre grenser for det elektriske felt frekvens og styrke som kan brukes ^10,12. Spesielt er det spådd at høy ledningsevne løsninger ( 12. Electroosmotic gjennomstrømning generelt avtar med økende saltkonsentrasjon og er ofte toppet seg på noen elektriske feltet svingninger frekvens (f.eks om enn i en annen geometri, Green et al. ^13). Dermed høyere feltstyrke og høyere frekvenser er rimelige for høy ledningsevne løsninger, innen visse grenser ^10.

Men membran proteiner er sannsynlig å være uforenlig med den vanlige metoden for deponering lipider på elektroder som electroswelling prosedyre, nemlig i organiske løsemidler som deretter fordampet av for å legge igjen en tynn lipid film. Det er to viktigste veier rundt dette problemet: å innlemme proteiner etter gigantisk liposomdannelse, eller for å tilpasse hvordan lipider er deponert. Vår tilnærming bygger på andre ^5,11 til deponere lipider og reconstiinnstiftet membran protein sammen fra en suspensjon av små eller store "proteoliposomes". Vi beskriver den lange og mer utfordrende prosess å produsere proteoliposomes fra renset protein og lipider andre steder (Collins og Gordon, i gjennomgang). Her beskriver protokollen i fravær av noe protein, men det er det samme når protein er innarbeidet, inkluderer vi resultater som viser at proteoliposomes inneholder ion-kanalen TRPV1 kan bli forvandlet til Guvs og brukes for patch-clamp elektrofysiologi. I alle electroformation tilnærming er visuell inspeksjon av lipid prøven under lipiddeponeringsraten prosessen avgjørende for suksess.

Vår tilnærming kan være aktuelt utover spesialisert applikasjon til ion-kanalen tilberedning. I tiden siden vi først utviklet denne protokollen, og nå har det også blitt vist hvordan måten lipider er avsatt på elektroder for electroformation påvirker det kompositoriske heterogenitet av de resulterende Guvs. Baykal-Caglar et al. ^14. viste at Guvs dannet av nøye dehydrerte liposomer hadde en 2,5 ganger mindre variasjon i blandbarheten omvandlingstemperatur av Guvs dannet fra blandinger av forskjellige fosfolipider og kolesterol. Deres arbeid viser at lipider, og spesielt kolesterol, kan utløse fra Lipidblandingen når avsatt fra organiske løsningsmidler, noe som resulterer i store romlige variasjonen i sammensetningen av det avsatte lipidfilmen. Dette er spesielt viktig for studier av lipid membran faseoppførsel, men kan også være avgjørende for kvantitative eksperimenter på ion-kanalen funksjon. Baykal-Caglar et al. 'S protokollen er like, men ikke identisk med vår egen, og leserne oppfordres til å studere det også.

Denne protokollen (se oversikt, figur 1) er en av mange som kan brukes. I prinsippet electroformation suksess avhengig av lipid-blanding, hydrering, temperatur, andre oppløste stoffer (spesielt ioner), og avSelvfølgelig den spenning og frekvens som brukes i formasjonen. Som electroformation blir bedre forstått, forventer vi å forbedre vår protokoll mer.

Til slutt er det ofte en bratt læringskurve i electroforming gigantiske liposomer. Vi foreslår å mestre den konvensjonelle protokoll (§ § 1 og 4, og, om nødvendig, seksjon 5) før du lære å sette lipider fra liposomale suspensjoner (§ 2-5).

Protocol

En. Nedfall av lipider fra Organiske løsemidler: Klassisk Protocol

1. Fjerne lipider fra lagring ved -20 ° C eller -80 ° C, varm til RT. Forsiktig: lipider er ekstremt hygroskopisk, og mange er følsomme for oksygen. Dekk lipider i tørr argon eller nitrogen gass og i alle forholdsregler for å minimere eksponering til luft.
2. Hvis det er nødvendig, suspendere lipider i kloroform eller sykloheksan på 1-10 mg / ml, merk at produsentens oppgitte konsentrasjoner er vanligvis nominell bare FORSIKTIG: Bruk egnede hansker og annet personlig verneutstyr når du bruker organiske løsemidler.. Fjern PPE raskt hvis løsemiddel er sølt på dem, som de fleste materialer er fortsatt gjennomtrengelig for disse løsemidler og de ​​bare gi midlertidig beskyttelse.
3. Rengjør begge sider av to 25 x 37,5 mm ITO belagte glassplater med etanol
4. Bland lipider for å oppnå de ønskede molare forhold. For hver 1 cm ² areal av ITO glir å være belagt med leppeid, mix ~ 15-20 mikrogram av lipider. For eksempel, hvis begge 25 x 37,5 mm lysbilder var å være fullt belagt, ville vi vanligvis bruker 30 pl av 10 mg / ml lipid blanding Merk:. Legge 0,1 mol% Texas Red-DPPE for fluoriserende bildebehandling, og se nedenfor for advarsler om fluorescerende fargestoffer.
5. Kontroller at ITO belagt side av glassplater vender opp ved å måle overflaten motstand med et ohmmeter eller multimeter.
6. Sug lipider i en løsemiddelbestandige sprøyte. Forsiktig: Ingen lim eller plast, unntatt PTFE, bør kontakte organisk løsemiddel.
7. Med sprøytespissen ikke helt berøre ITO overflaten, sakte bruke lipid flytte nålen frem og tilbake over lysbildet. Dekk overflaten så jevnt, på jakt etter en "rainbow glans" på glassflaten.
8. Plassere objektglassene raskt opp <1 torr (1 mm Hg) vakuum i 0,5-1 timer for å fjerne ethvert spor oppløsningsmiddel. Slipp vakuum med inert gass.
9. Påfør en silikon pakning, med entynt lag av silikon-vakuum-fett på begge sider. La det være minst 5 mm for udekket lysbilde eksponert i den ene enden av raset.
10. Fortsett umiddelbart § 4.

2. Liten liposompreparatet for Controlled Dehydrering

1. Klargjør Lipidblandingen som i trinn 01.01 til 01.04.
2. Tørk lipider ved hjelp av en strøm av argon eller nitrogengass i en 10-15 mm diameter kultur rør. For små mengder av lipider, ≤ 0,5 mg, kan den resulterende filmen hydratiseres direkte etter å plassere den under vakuum i 0,5-1 timer for å fjerne gjenværende oppløsningsmiddel, fortsett til trinn 2.5. Større mengder av lipid har en tendens til å felle organiske løsningsmidler i en tykk gel, selv under vakuum, og er bedre fremstilles ved lyofilisering, se trinn 2,3 til 4.
3. Suspender den tørkede lipidfilmen i cykloheksan, dekk med argon og tetning med en propp, plasseres røret i en kald blokk og fryst ved -80 ° C i 1 time minimum.
4. Plasser kald blokk og lipid prøven i et vakuumsystemstand til å nå 100 mTorr. Påfør vakuum, det vil "stall" på ca 1 torr som løsemiddel sublimes off. Når løsemiddel er helt fjernet (~ 1 time) vakuum vil falle under dette nivået. Slipp vakuum med inert gass og forsegle røret eller hydrat umiddelbart.
5. Mens lipider er under vakuum, Degas hydrering buffer ved hjelp av vakuum og sparging ^15-17.
6. Hydrere lipidene med avgasset buffer ved endelig konsentrasjon på 1-10 mg / ml. Tillate lipider til hydrat sakte. Etter 30 min-1 time, vortex å bryte opp gjenværende klumper. Vent ytterligere 0,5-1 time for å tillate fullstendig hydratisering. Bruk en osmoticant, såsom sorbitol eller sukrose opp til 200 mm, for å hindre fullstendig dehydrering i trinnene nedenfor.
7. Forbered 100-200 nm diameter liposomer ved ekstrudering. Se produsentens ekstrudering protokoll for detaljer. Merk at bufferen må ha mindre enn ~ 25 mm ionestyrke, eller spesielle electroformation spenning protokoller vil være nødvendig i § 4..

3.Nedfall av lipider av Controlled Dehydrering av små Liposomes

1. Forsiktig: Vår protokollen krever lipider som skal plasseres i likevekt med damp mettede saltløsninger i mange timer. Vi anbefaler på det sterkeste å utføre protokollen i en atmosfære av inert gass, ved hjelp av et hanskerom eller lignende kabinett.
2. Forsiktig: Hvis forberede prøver som inneholder proteiner, unngå fullstendig dehydrering. Hydrat atmosfæren i noen kabinett med et beger med varmt vann, eller en sonicator basert luftfukter. Bruk et hygrometer for å sikre at det er minst 30% relativ luftfuktighet. Bruk sorbitol eller sukrose i den lille liposom buffer som en ytterligere forholdsregel for å hindre total dehydrering.
3. Forbered en mettet saltoppløsning med riktig relativ fuktighet. Target fuktighet avhenger av osmolariteten av det vesikkel preparatet. For preparater med fysiologisk osmolaritet, bruker 30-45% RH, mens lav osmolaritet vesicle forberedelser kan være tilstrekkelig dehydrert ilikevekt med 75-90% relativ fuktighet (se også tabell 1).
4. Sett mettet salt-løsning og overskudd av salt i en tett lukket beholder med en innvendig sokkel. Kommersielle mat beholdere for yoghurt og müsli fungerer svært godt. Sett på sokkelen etter fylling, og sørge for at væsken er 5-10 mm under sokkelen.
5. Rene ITO belagt lysbilder som i punkt 1. Bruk multimeter for å finne ut hvilken side er ledende, og merke ikke-ledende side med prøven navn.
6. Smør begge sider av silikon (USP Grade VI) pakning (er) med ett eller flere hull.
7. Plasser lysbildene ledende side opp på benken, og bruke silikon pakning (er) til hvert lysbilde som lipid vil bli anvendt, og pass på at det er minst 5 mm av eksponert lysbilde i den ene enden for å koble til electroformation apparat. Glatt pakningen for å sikre god tetting.
8. Fortynn vesikkel-preparatet i en lav-salt isosmotisk buffer til ~ 1-2 mg / ml. Vi finner at høyere konsentrasjonerasjon produserer dårlige resultater.
9. Påfør lipid til raset i 1-10 mL dråper. Mindre dråper generelt gi bedre resultater.
10. Plasser lysbildet på interiøret hylle over mettet saltoppløsning og forsegle beholderen tett. La ved RT i 3 timer til O / N. Beholderen kan plasseres ved 4 ° C, men merk at for noen salter, avhenger RH sterkt på temperatur, og at kald vil øke ekvilibrering tid.
11. Den resulterende filmen kan ha en liten regnbue glans til det, men i alle fall skal vises nesten revet. Svært osmotiske start løsninger kan være umulig å tørke helt til en lipid film, og dette vil ikke påvirke resultatene.

4. Electroformation av Giant Liposomes

1. Lipid filmer, særlig de som er dannet fra dehydrerte liposomer, blir lett forskyves. Forsiktig hydrat hver brønn ved å plassere en 27 g sprøytespissen ved kanten av pakningen, og langsomt å anvende buffer. Buffere kaninkluderer vann, ≤ 200 mM sukrose, ≤ 1 M sorbitol og ≤ 5 mMHEPES. Mer enn 10 mM salt løsning kan kreve alternative electroformation spenning protokoller. Overfylle hver pakning godt av ~ 10%.
2. Merk: når lipider er hydrert, gå raskt gjennom resten av trinnene, siden lipid filmer begynner å delaminere umiddelbart. Yield og størrelse er maksimert hvis electroformation begynner omgående.
3. I en jevn bevegelse, bruke en annen ITO lysbilde, ledende ansikt i, til toppen av pakningen. Sørg for å ha minst 5 mm av overheng utenfor pakningen, og ovenfor den første overheng. Trykk forsiktig for å sikre en god forsegling.
4. Rengjør de to overheng ved hjelp av etanol og kontrollere at sidene mot pakningen er ledende med multimeter din.
5. Kammeret kan bli ytterligere sikret med parafilm eller lette spenninger fjærklemmer hvis ønskelig.
6. Koble electroformation kammer til en spenningskilde ved å sikre aluminium eller kobber barer, "EMI Gasket skum ", eller ledende-teip til de ledende overflater i de to lysbilder. Vi bruker EMI pakning skum. Planer for en pilk og klemme er vist i figur 5.
7. Kontroller at det ikke er kortslutning mellom kontaktene, og at kontaktene kobles ordentlig til ITO flater, ved hjelp av multimeter.
8. Varm opp kammeret 10 ° C over den høyeste smeltetemperatur på noe av lipidene tilstede, f.eks for DPPC, varme til 52 ° C minimum, 10 ° C over kjeden smeltetemperatur av 42 ° C.
9. For lav-salt buffere, gjelder en 10 Hz sinusbølge, ~ 0,7 V _RMS for hver millimeter gap mellom de to ITO malte overflater, for 60-90 min. For høy salt buffere, bør andre spenning protokoller brukes (se referanser).

5. Bildebehandling og feilsøking

1. Bilde liposomet bruker en invertert mikroskop utstyrt med et filter kube for Rhodamine eller Texas Red fargestoffer. Den liposom bør være sfærisk,overveiende unilamellær ved øyet, og fri for defekter som "strenger" henging av liposomet.
2. Hvis liposomene er for små, bruker mindre lipid.
3. Hvis det er mange defekter eller noen liposomer, kan dette være på grunn av gel-fase lipider. Vurdere å øke den electroformation temperatur.
4. Ved lite eller ingen store liposomer dannet i det hele tatt fra dehydrerte små liposomer, redusere den osmotiske styrken til bufferen liposom, eller øke det osmotiske styrken til bufferen electroformation. En innkoblingsstrøm av buffer i den konsentrerte interstitiell bufferløsning kan forårsake delaminering av det avsatte lipidfilmen.
5. Hvis vesicle ytelse, kvalitet eller størrelse er dårlig, og du inkludert salter eller pH-buffere i electroformation eller liposomen buffere, vurdere alternative electroformation spenning protokoller. For eksempel, Pott, et al. ^11., anbefaler en tretrinns protokollen ved hjelp av et 500 Hz sinusbølge, heve spenningen fra 50-1,300 Vpp / m over 30 minutter, holding i 90 min, denN redusere frekvensen til 50 Hz i løpet av 30-60 min. Platina eller titan-elektroder kan være nødvendig i dette tilfelle, men dette vil ikke vesentlig endre protokollen.

Representative Results

I vårt eksempel, forbereder vi liposomer fra en blanding av omtrent 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfocholin), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-Phosphoserine , 30 mol% kolesterol, og 0,1 mol% Texas Red-merket 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoethanolamine (TXR-DPPE). Denne sammensetningen ble valgt som ca representant for dorsal root ganglion lipider ^18. Vi merker oss at 15 mol% ladet lipid (her POPs) er nær grensen for hva som kan brukes i electroformation (f.eks Walde et al. ^4).

Lipid sammenbrudd ved hydrolyse og peroksidasjon er en spesielt viktig sak for mange lipid blandinger og mange sensitive eksperimenter (se diskusjon). For klarhet alene, vi bruker ikke inerte gassatmosfærer i videopresentasjon. Som det fremgår av figurene nedenfor, betyr dette ikke merkbart påvirke kvaliteten av liposomene, men for sensitive eller studierved bruk av sterkt umettede lipider er det viktig å hindre lipid-sammenbrudd.

Siden den store hinder i electroformation er å danne en god lipid film på Indium-Tin Oxide (ITO) substrat, vel vitende om hva lipid film skal se ut når tørket er avgjørende. Men når electroformation svikter, vil det ofte så fullstendig, noe som resulterer i ingen merkbare gigant liposom produksjon. Ofte vil betydelige avfallsproduktene observeres, og dette indikerer som regel at for mye lipid har blitt brukt. Våre tall viser hva man forventer å se på suksess.

Figur 2 viser to forskjellige flekker av liposomer electroformed fra lipider deponert ut av kloroform. I venstre panel, nøye undersøke de patcher indikert med piler to og tre. Mens pil 2 viser en lapp med dårlig skjelnes liposomer, kan ingen liposomer bringes i fokus i området angitt med pil 3. Sammen utgjør disse funnene tyder på en generelt dårligforberedelse, sannsynligvis på grunn av det blir for mye lipid avsatt i dette området. I høyre panel, slike "fuzzy" regioner er mindre vanlig, noe som indikerer en generelt bedre forberedelse. Vi finner at det er sjelden å fullstendig eliminere slike feil.

Figur 3 viser liposomer vellykket electroformed fra lipider avsatt av dehydrering av små liposomer, på to forstørrelser, avbildes med Texas Red epifluorescence. Liposomer er sparsom, men det finnes flere gode prøver. Fordi størrelsen varierer, flere er ute av fokus. Pilene viser tre gode liposomer som varierer i størrelse fra ~ 5-20 mikrometer, hvorav to vises i 40x forstørrelse bildet. Legg merke til den klare "ring" på kanten: dette indikerer en unilamellær eller nesten unilamellær liposomen. Mens noen flekker av lipid synes å ha kollapset eller aldri dannet lipid, er dette en god kvalitet resultat.

Endelig, vår hensikt i å utvikle og publisere denne protokollener å forberede Guvs med intakte, funksjonelle pattedyr ionekanaler som er egnet for konvensjonell patch-clamp elektrofysiologi. I Figur 4 viser vi capsaicin-aktiverte TRPV1 ioniske strømninger spilt inn i lipid membran patcher skåret ut fra Guvs dannet ved hjelp av denne protokollen. Strømmen kan bli blokkert av Ruthenium Red, og er ikke aktivert av capsaicin kjøretøy (0,1% etanol, 138 mM NaCl, 3 mM HEPES pH 7,4) alene. Utarbeidelsen av proteoliposomes for elektrofysiologiske eksperimenter er langt utenfor rammen av denne protokoll, men er gjenstand for en innsendt artikkel.

Salt	Molality @ 20 ° C og metning	% RF @ 10 ° C	% RF @ 20 ° C	% Relativ fuktighet ved 30 ° C
Magnesiumkloridheksahydrat	5.8	33	33 32
Kaliumkarbonat Dihydrate	8,0	47	44	42
Natriumbromid	4.6	58	57	57
Cupriklorid	5.6	68	68	67
Natriumklorid	6.13	75	75	75
Kaliumklorid	4.61	87	86	84

Tabell 1. Relativ luftfuktighet (% RH) av flere vanlige salter relativ fuktighet data fra Greenspan ¹⁹ og Rockland ^20;. Metning data fra International Kritiske tabell ^21.

Figur 1. Skjematisk av gigantiske liposomet electroformation fra små liposomer. (Øverst til venstre) Små liposomer er deponert i en rekke små dråper, <5 pl. (I midten) Liposomene er dehydrert med kontrollert relativ fuktighet ved å plassere dem i en lukket beholder over en mettet salt-løsning. En hygrometer er valgfritt. (Øverst til høyre) Når dehydrert til en klebrig film av fett og (muligens) osmoticant som sorbitol, er lipider utvannet i en hyperosmotisk buffer (se protokoll § 5). (Nedre venstre) den electroformation kammeret er forseglet med en andre ITO skyv på toppen. (Nederst til høyre) Endelig er kammeret oppvarmes over lipidets kjeden smeltetemperatur, og koplet til en signalkilde som gir et oscillerende elektrisk felt på tvers av de to ITO lysbilder.

Figur 3. Electroformed gigantiske liposomer dannet av dehydrering-deponert lipider. (Venstre) med 10x forstørrelse, flere liposomer er synlige. Tre liposomer er merket. (Høyre) Den samme utsikten som til venstre, på 40x forstørrelse, med sammeliposomer (2 og 3) markert. Antallet av disse liposomer er vanligvis mye mindre enn når electroforming fra oppløsningsmiddel-avsatt lipid, men er fullstendig tilstrekkelig for mange formål. Avbildes med en invertert epifluorescence mikroskop utstyrt med en Chroma 41004 Texas Red filter kuben og Stanford Photonics XR/MEGA-10 S30 intensivert CCD-kamera.

Figur 4. Capsaicin aktivert TRPV1 nåværende spilt inn i en membran patch fjernet fra en GUV dannet ved hjelp av denne protokollen. A. Lekkasjen strøm som en 500 MΩ forsegle motstand før capsaicin ble lagt. B. Mette capsaicin (> 20 mikrometer, i 0,1% etanol) aktiverer en store TRPV1 gjeldende;. strømmen er blokkert av Ruthenium Red, og er ikke aktivert av kjøretøy (0,1% etanol i buffer) alene (data ikke vist) C. løpende avkastningtil nær grunnlinjen som capsaicin er vasket ut av plasteret.

Figur 5. Planer for electroformation kammer. Inkludert er en oversikt som viser hele forsamlingen, og dimensjoneres skjemaer for de øvre og nedre deler av plast. Bruk akryl eller en annen lett maskinert klar plast. Den tynne film Kapton varmeapparatet skal være koblet til temperaturregulatoren (se tabell av spesifikke reagenser og utstyr) og EMI-pakning skum skal kobles til funksjonsgeneratoren, slik at sinusbølgen signal tilføres over de to ITO belagte objektglass. Et hull er gitt for en temperatur probe. Flathodede skruer 10-32 er plassert i det forsenkede hull i understykket, og passerer gjennom det øvre stykke. 10-32 nøtter brukes for å feste. Når den er fullt så, demonteres, bør de øvre og nedre deler av plast være i flukt med hverandre på to sider (sidene parallelt med EMI pakning.) Klikk her for å se større figur .

Discussion

Electroformation av gigantiske liposomer har utviklet seg til en fleksibel teknikk kompatibel med ulike lipider, preparater og buffere. Med nøye kontroll av lipid avleiring prosess er mest avgjørende for suksess. Vi har presentert enkle verktøy for å lage kontrollert deponering av lipider fra små liposomoppløsninger forberedelser en grei prosess. Den relative fuktighet er kritisk for korrekt dehydrering av de opprinnelige liposomene, og den optimale verdi, vil variere med den opprinnelige konsentrasjon av de oppløste stoffer i liposomsuspensjonen. Lavere relativ fuktighet er nødvendig for å dehydratisere mer konsentrerte prøver til et tilstrekkelig nivå.

Den nøyaktige hydrering protokollen og elektrisk felt brukes for electroformation fortsatt et utgangspunkt for diskusjon ^{1,4,7,10,11,22.} De enkleste protokollene skal mestres først før du prøver liposomet electroformation i nærvær av høye saltkonsentrasjoner, ladede lipider, eller svært høye konsentrasjoner av høy smelteing temperatur lipider. Når disse ferdighetene er mestret, mer avanserte protokoller typisk dele electroformation prosessen inn i tre deler: første hevelse, vekst og avløsning. Første hevelse ser ut til å bli foretrukket av sakte øke anvendt elektrisk felt ^11. En andre, valgfrie trinn ved fast feltstyrke kan bidra til å kontrollere den endelige størrelsen av liposomene. Endelig kan redusere frekvensen av det oscillerende felt bidrar til å løsne liposomer fra ITO overflate. Høyere frekvenser er nødvendig for å electroform liposomer i fysiologisk ^salt-11 betingelser, men liposomer kan bli dannet over et ekstremt bredt område av frekvenser og amplituder felt ^10.

Observasjonen at gigantiske liposomer vil danne spontant ved utvanning av dehydrert liposomer med hypo-osmotisk buffer ⁷ indikerer flere nøkler til suksess. Først begynner den liposomsvelling prosessen umiddelbart, slik at for electroformation, noengrupper har selv funnet det nyttig å bruke AC elektrisk felt før rehydrerende av lipidfilmen ^10. For det andre er det sannsynlig at fluidstrømmen som driver den liposomale hevelse prosess, og at electroformation oppstår i det minste delvis på grunn av elektro-osmotisk drevet strømning. Dette setter grenser for de nyttige frekvens og amplitudeområde som kan brukes i electroformation ^{10 år.}

Et viktig punkt for diskusjon i de siste årene har vært potensial for lipid hydrolyse og peroksidasjon ^23,24. Den første forsvar mot lipid nedbrytning av noe slag er å fjerne oksygen fra alle materialer som brukes i GUV forberedelse: siden peroksidasjon avhenger av molekylært oksygen ^23, bør dette forsinke prosessen betydelig. En kombinasjon av vakuum og spyling med inert gass bør brukes for å fjerne så mye oksygen som mulig ^15-17. Sonikering og lys vakuum er ineffektive. Vi bruker en oksygen test kit (Chemetrics K7501) til verify at vi har fjernet oksygen så grundig som mulig. Hydrolyse er mer skadelig, men reduseres ved å opprettholde nøytral pH ^25, og ved å redusere spenningen som brukes i electroformation ^24.. Noen forfattere argumentere for bruk av titanelektroder i stedet for ITO glir ^23,24,26,27. Vi foretrekker å unngå muligheten for forurensende våre prøver med titan (eller noe metall), siden det har i det siste vært kjent for å forstyrre liposomoppløsninger eksperimenter ^28,29, men det kan bidra til å forhindre at enkelte peroksidasjon eller hydrolyse effekter. Det sier seg selv at langvarig eksponering for høye temperaturer akselererer lipid sammenbrudd ^30. Til slutt, tynn-sjikt kromatografi ^24,31, kolorimetriske assays ^23, og andre metoder eksisterer for å ³¹ kvantifisere lipid degradering.

En lignende sak knyttet til de fluorescerende lipid fargestoffer som brukes til bilde Guvs, spesielt for studier av lateral fase separasjon ^30,32 30,33, og brukes med minimal konsentrasjon.

Vi kjenner ikke til noen enighet om hvorvidt ITO elektrode lysbilder kan gjenbrukes. Mange grupper gjør gjenbruke sine ITO lysbilder, mens noen ikke. Nyere arbeider indikerer at lysbildene brytes ikke ned over tid, men kan bli glødet for å gjenvinne høy ytelse ^34; dette degradering hadde bare en liten effekt for lipid blandinger inkludert zwitterioniske eller anioniske lipider, men var kritisk for blandinger som inneholder kationiske lipider. Vi gjenbruke våre lysbilder uten gløding.

Selv om det er stor variasjon i protokollene som brukes til electroform gigantiske liposomer, teoretisk forståelse og praktisk erfaring med teknikken blir stadig bedre. Allerede liposomer kan bli dannet med store mengder av ladede lipider, eller i høy salt buffere. Nøkkelen forblir effektiv avsetning av lipider på elektrodeoverflaten, hh er kjernen i protokollen vår.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667