Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50227
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington

Summary

בנייה מחדש של חלבונים בממברנה פונקציונליים ליפוזומים ענקים של הרכב מוגדר היא גישה רב עוצמה בשילוב עם electrophysiology תיקון מהדק. עם זאת, ייצור liposome ענק קונבנציונלי עשוי להיות בקנה אחד עם יציבות חלבון. אנו מתארים פרוטוקולים לייצור ליפוזומים ענקים משומנים טהורים או ליפוזומים קטן המכיל תעלות יונים.

Abstract

הכינון מחדש של תעלות יונים בממברנות שומנים בדם הגדרה כימית להקלטת אלקטרו כבר טכניקה רב עוצמה כדי לזהות ולחקור את תפקודם של החלבונים החשובים אלה. עם זאת, הכנות הקלסיים, כגון bilayers מישוריים, להגביל את המניפולציות וניסויים שניתן לבצע בערוץ המשוחזר וסביבת הקרום שלה. מבנה דמוי תא יותר ליפוזומים ענקים מתיר ניסויי תיקון-מהדק מסורתיים מבלי להקריב את השליטה בסביבת השומנים בדם.

Electroformation הוא ממוצע יעיל כדי לייצר ליפוזומים ענקים> 10 מיקרומטר בקוטר אשר מסתמך על היישום של מתח חילופין לסרט שומנים רזה, מסודר שהופקד על פני האלקטרודה. עם זאת, מאחר שהפרוטוקול הקלסית קורא את השומנים שיופקדו מממסים אורגניים, זה לא תואם עם חלבונים בממברנה פחות חזקים כמו תעלות יונים וחייב להיות שונה. לאחרונה, יחסי ציבורotocols פותחו כדי electroform יפוזומים ענקים מיפוזומים קטנים באופן חלקי מיובשים, שיש לנו להתאים ליפוזומים המכילים חלבון במעבדה שלנו.

אנו מציגים כאן את הרקע, ציוד, טכניקות, ואת החסרונות של electroformation של יפוזומים ענקים מתפוצות liposome קטנות. אנחנו מתחילים עם הפרוטוקול קלאסי, שאמורה להיות שולטים ראשון לפני שתנסו את הפרוטוקולים מאתגרים יותר שבאים אחרי. אנו מדגימים את התהליך של התייבשות חלקית מבוקרת של שיווי משקל ליפוזומים קטנים באמצעות אדים עם פתרונות מלח רוויים. לבסוף, אנחנו מדגימים את התהליך של electroformation עצמו. נתאר ציוד פשוט, זול, שיכול להתבצע בבית כדי לייצר ליפוזומים באיכות גבוהה, ולתאר בדיקה ויזואלית של ההכנה בכל שלב כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.

Introduction

ליפוזומים ענקים (הנקרא לעתים קרובות שלפוחית ​​unilamellar ענקית, או GUVs) יש בעיקר נעשו שימוש כדי ללמוד את הפיזיקה וכימיה פיסיקלית של bilayers שומנים, כולל מחקרים של עיוות bilayer, דו קיום שלב לרוחב ("רפסודות"), איחוי קרום, וכו '1-4. יש להם מבנה גס דמוי תא: מעטפת כדורית של קרום המקיפה פנים מימיות אשר יכול בקלות להתבצע שונה מהמאגר הימי שמסביב. הם, בהגדרה, ≈ 1-100 מיקרומטר קוטר, כך שהם יכולים להיות צילמו באמצעות מגוון של גישות אור מיקרוסקופית. הם יכולים להתבצע באמצעות מתוחים הדרגתיים אוסמוטי או מתח מיושם באופן מכאני, כך שבדרך כלל תוך רכה, ניתן להשפיע המאפיינים שלהם לטיפול קל. בפרט, שליטה על "הקשיחות" של liposome עושה את זה פשוט כדי ליצור תיקונים "liposome-מצורפים" או נכרת לאלקטרופיזיולוגיה. בעבר, הכינון מחדש ערוץ יון בוצע בעיקר בסעיף ב 'שומנים מישורייםilayers. עכשיו, היכולת ליצור כתמים מיפוזומים ענקים ולהשתמש אשפה מבוטלת של כלים שפותחו עבור electrophysiology הקונבנציונלי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שאיפת micropipette, זלוף המהיר ובקרת טמפרטורה, וכו ') גורמת ליפוזומים ענקים אטרקטיבית יותר ויותר עבור לימודי כינון מחדש 5,6.

ליפוזומים ענקים שנעשו על ידי אסטרטגיות רבות. למעשה, ליפוזומים ענקים בצורה ספונטנית על ידי תהליך נפיחות כאשר סרט שומנים בדם מיובש הוא rehydrated 4,7,8. התשוקה במהירות רבה יותר כדי להכין גדולים יותר, אחידים יותר ליפוזומים הביאו את החוקרים לגישות אחרות, ובראשם electroformation 1,9. Electroformation גם מסתמך על הידרציה של סרט שומנים בדם מיובש, אבל מאיץ את התהליך באמצעות היישום של שדה חשמלי על פני נדנוד סרט השומנים בדם. תחום מיושם באמצעות שתי אלקטרודות, או חוטי פלטינה או שקופיות זכוכית מצופים אינדיום בדיל תחמוצת (איטו), מופרד על ידי מים אוהמאגר ואליו השומנים מופקדים. נהיגה במהירות מופרזת על ידי הנפיחות של יפוזומים, אחד משיג תשואה גבוהה יותר של יפוזומים גדולים יותר. לפיכך, electroformation הפך שיטת ברירת המחדל כדי לייצר ליפוזומים ענקים 4.

המנגנון של electroformation לא מובן לחלוטין, ורוב הפרוטוקולים שפותחו באופן אמפירי (למשל 10,11). יחד עם זאת, אנו יכולים ללמוד קצת על מה לצפות על ידי בהתחשב בתאוריה וכמה תוצאות אמפיריות. הוא האמין נרחב כי electroformation מתרחש על ידי הנהיגה זרימת אלקטרו האוסמוטי של חיץ בין bilayers שומנים הבודדים שנערמו בסרט השומנים הופקד 10,11. צימוד אלקטרוסטטית לתנודות תרמיות של bilayers השומנים הוא כנראה מעורב גם 12. השערות אלה לחזות איכותי גבולות עליונים לתדר השדה החשמלי וכוח שניתן להשתמש בי 10,12. בפרט, הוא נבאה פתרונות מוליכות גבוהים ש( 12. ספיקות Electroosmotic בדרך כלל יורדות עם הגדלת ריכוז המלח והגיעו לשיאו בתדירות גבוהה בתדירות כלשהי תנודת שדה חשמלית (לדוגמה אם כי בגיאומטריה שונה, הירוק ואח'. 13). לכן, עוצמות שדה גבוהות יותר ותדרים גבוהים יותר הם סבירות לפתרונות מוליכות גבוהים, בגבולות 10.

עם זאת, חלבוני קרום עשויים להיות בקנה אחד עם שיטת הרגילה של הפקדת שומנים על גבי אלקטרודות להליך electroswelling, כלומר בממסים אורגניים אשר לאחר מכן התאדו לעזוב את סרט שומנים בדם דק. ישנם שני מסלולים עיקריים סביב קושי זה: לשלב חלבונים לאחר היווצרות liposome ענקית, או להתאים את האופן שבו השומנים מופקדים. הגישה שלנו בונה על אחרים 5,11 להפקיד את השומנים וreconstituted חלבון קרום יחד מהשעיה של "proteoliposomes" קטן או גדול. אנו מתארים את התהליך הארוך ומאתגר יותר של ייצור proteoliposomes ממטוהרי חלבון ושומנים במקומות אחרים (וקולינס גורדון, בסקירה). כאן אנו מתארים את הפרוטוקול בהיעדרו של כל חלבון, אבל זה אותו הדבר כאשר החלבון משולב; אנו כוללים תוצאות מראות כי proteoliposomes המכיל יון הערוץ TRPV1 ניתן להפוך GUVs ומשמש לתיקון מהדק electrophysiology. בכל גישת electroformation, בדיקה ויזואלית של מדגם השומנים במהלך תהליך הדחת השומנים בדם היא קריטית להצלחה.

הגישה שלנו עשויה להיות רלוונטית מעבר ליישום מיוחד לכינון מחדש תעלת יונים. בזמן מאז שפותחנו לראשונה פרוטוקול זה ועכשיו, יש לו גם הראה כיצד אופן שבו שומנים מופקדים על אלקטרודות לelectroformation משפיע ההטרוגניות ההלחנה של GUVs כתוצאה מכך. Baykאל Caglar et al. הראה כי 14 GUVs נוצר בזהירות ליפוזומים המיובשים הייתה וריאציה קטנה יותר פי 2.5 בטמפרטורת המעבר של miscibility GUVs נוצר מתערובות של פוספוליפידים וכולסטרול שונים. העבודה שלהם מצביעה על כך ששומנים וכולסטרול במיוחד נמהר, במאי מתערובת השומנים בדם, כאשר הופקדו מממסים אורגניים, וכתוצאה מהווריאציה המרחבית גדולה בהרכב של סרט השומנים שהופקד. זה חשוב במיוחד ללימודים של התנהגות שלב קרום שומנים בדם, אך הוא עשוי להיות גם קריטי לניסויים כמותיים על תפקוד תעלת יונים. Baykal-Caglar אח' 's. פרוטוקול הוא דומה אך לא זהה לזו שלנו, ואנו מעודדים את קוראים ללמוד אותו גם כן.

פרוטוקול זה (ראה סקירה, איור 1) הוא אחד מרבים שיכולים להיות בשימוש. בהצלחת electroformation עיקרון תלויה בתערובת השומנים בדם, לחות, טמפרטורה, מומסים אחרים (בעיקר יונים), ושלכמובן מתח ותדר בשימוש במבנה. כelectroformation הופך להבין טוב יותר, אנו מצפים לשפר את הפרוטוקול שלנו יותר.

לבסוף, לעתים קרובות יש עקומה למידה תלולה בelectroforming יפוזומים ענקיים. אנו ממליצים מאסטרינג פרוטוקול המקובל (סעיפים 1 ו -4, ואם יש צורך, סעיף 5) לפני שלומדים להפקיד שומנים מהשעיות liposomal (סעיפים 2-5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בתצהיר של שומנים מממסים אורגניים: פרוטוקול הקלסית

  1. הסר שומנים מהאחסון ב -20 ° C או -80 מעלות צלזיוס; חם לRT זהירות:. שומנים מאוד hygroscopic, ורבים מהם רגישים לחמצן. לכסות שומנים בארגון יבש או גז חנקן ובכל הצעדים לצמצם את החשיפה לאוויר.
  2. במידת צורך, להשעות את השומנים בכלורופורם או cyclohexane ב1-10 מ"ג / מ"ל; לציין כי הריכוזים המוצהרים של היצרן הם בדרך כלל נומינליים בלבד זהירות: ללבוש כפפות מתאימות וציוד מגן אישי אחר בעת שימוש בממסים אורגניים.. הסר PPE במהירות אם הוא נשפך על הממס, כמו רוב החומרים עדיין חדירים לממסים אלה והם מספקים הגנה זמנית בלבד.
  3. יש לנקות את שני הצדדים של שתי 25 x 37.5 מ"מ שקופיות איטו מצופה זכוכית עם אתנול
  4. מערבבים את השומנים כדי להשיג את היחסים הטוחנים הרצויים. עבור כל ס"מ 1 2 של שטח של איטו מחליק להיות מצופים עם שפהid, לערבב ~ מיקרוגרם 15-20 של שומנים. לדוגמה, אם שתי שקופיות 25 מ"מ x 37.5 היו להיות מצופה במלואו, היינו משתמש בדרך כלל 30 μl של 10 מ"ג / מיליליטר תערובת שומנים בדם. הערה: להוסיף 0.1% מול טקסס אדומה DPPE עבור דימות פלואורסצנטי, וראה להלן מזהירה על צבעי ניאון.
  5. ודא שהצד המצופה איטו משקופיות הזכוכית הוא פונה כלפי מעלה על ידי מדידת התנגדות המשטח עם מד התנגדות או מודד.
  6. לשאוב את השומנים לתוך מזרק זהירות ממס עמיד:. לא דבקים או פלסטיק, חוץ מPTFE, צריך ליצור קשר עם הממס אורגני.
  7. עם מחט המזרק לא ממש נגיעה במשטח איטו, להחיל השומנים הזזת המחט קדימה ואחורה על פני השקופית לאט. לכסות את פני השטח בצורה שווה, מחפש "קשת ברק" על משטח הזכוכית.
  8. מניחים את השקופיות במהירות תחת <1 טור (מ"מ כספית 1) ואקום ל0.5-1 שעות כדי להסיר כל זכר ממס. לשחרר את הוואקום בגז אינרטי.
  9. החלת אטם סיליקון, עםשכבה דקה של שומן ואקום סיליקון משני הצדדים. להשאיר לפחות 5 מ"מ של שקופית חשפו נחשפה בקצה אחד של השקופית.
  10. פנה מייד לסעיף 4.

2. הכנת Liposome קטנה להתייבשות מבוקרת

  1. מכין את תערובת השומנים בדם כמו בצעדים 1.1-1.4.
  2. ייבש את השומנים באמצעות זרם של ארגון או גז חנקן בצינור בקוטר 10-15 מ"מ תרבות. לכמויות קטנות של שומנים, ≤ 0.5 מ"ג, סרט כתוצאה מכך יכול להיות התייבשות מייד לאחר הצבתו תחת ואקום עבור 0.5-1 שעה להסיר ממס שיורי; המשך לשלב 2.5. כמויות גדולות יותר של שומנים בדם נוטות ללכוד ממסים אורגניים בג'ל סמיך, אפילו תחת ואקום, ומוכנים טוב יותר על ידי lyophilization; לראות צעדים 2.3-4.
  3. להשעות את סרט השומנים בדם המיובש בcyclohexane, מכסה בארגון וחותם עם פקק, הנח את הצינור בבלוק והקפאה קרים ב -80 מעלות צלזיוס למשך מינימום שעה 1.
  4. מניחים את הגוש הקר ומדגם שומנים במערכת ואקוםמסוגל להגיע 100 mTorr. החל ואקום, זה יהיה "דוכן" בכ -1 טור כsublimes פעמי ממס. ואקום ברגע שהממס נמחק לחלוטין (~ 1 שעות) יהיה ירידה מתחת לרמה זו. לשחרר את הוואקום בגז אינרטי ולאטום את הצינור או מימה באופן מיידי.
  5. בעוד השומנים הם תחת ואקום, מאגר לחות דגה באמצעות ואקום ותזת 15-17.
  6. מימה השומנים באמצעות חיץ degassed בגמר ריכוז 1-10 מ"ג / מ"ל. לאפשר את השומנים למימה לאט. לאחר 30 דקות, 1 שעות, מערבולת כדי לשבור את הגושים שנותרו. חכה 0.5-1 שעות נוספות כדי לאפשר ללחות מוחלטת. השתמש osmoticant, כגון סורביטול או סוכרוז עד 200 מ"מ, על מנת למנוע התייבשות מוחלטת בשלבים הבאים.
  7. היכונו ליפוזומים 100-200 ננומטר בקוטר של חול. ראה פרוטוקול שחול של היצרן לפרטים נוספים. שים לב שחייב להיות החיץ פחות מ ~ 25 מ"מ חוזק יוני, או פרוטוקולי מתח electroformation מיוחדים יהיה צורך בסעיף 4.

3.בתצהיר של שומנים על ידי התייבשות מבוקרת של יפוזומים קטנים

  1. זהירות: הפרוטוקול שלנו דורש שומנים כדי להיות ממוקמים בשיווי משקל עם אדי פתרונות מלח רוויים במשך שעות רבות. אנו ממליצים בחום לבצע את הפרוטוקול באווירת גז אינרטי, תוך שימוש בתא הכפפות או מתחם דומה.
  2. זהירות: אם הכנת דגימות המכילות חלבונים, למנוע התייבשות מוחלטת. מימה את האווירה בכל מארז עם כוס מים חמים, או אדים מבוססי sonicator. השתמש במד לחות על מנת להבטיח שיש לפחות 30% לחות יחסית. השתמש סורביטול או סוכרוז בחיץ liposome הקטן כאמצעי זהירות נוסף על מנת למנוע התייבשות מוחלטת.
  3. הכן תמיסת מלח רוויה של לחות היחסית מתאימה. לחות יעד תלויה בosmolarity של הכנת השלפוחית. לתכשירי הosmolarity הפיזיולוגי, השתמש 30-45% לחות יחסית, ואילו הכנות שלפוחית ​​osmolarity נמוכות יכולות להיות מספקת במיובשותשיווי משקל עם 75-90% לחות יחסית (ראה גם טבלה 1).
  4. שים את תמיסת מלח רוויה ועודף מלח במכל בחוזקה רב סגר עם מדף פנימי. מיכלי מזון מסחרי ליוגורט וגרנולה עבודה טוב מאוד. החלף את המדף לאחר המילוי, ולהפוך את הנוזל בטוח הוא 5-10 מ"מ מתחת למדף.
  5. שקופיות מצופים איטו נקיים כמו בסעיף 1. השתמש במודד כדי לקבוע באיזה צד הוא מוליך, ולתייג את הצד שאינו מוליך עם שם הדוגמא.
  6. משמנים שני צידי (USP כיתה ו) אטם סיליקון (ים) עם אחד או חורים מרובים.
  7. הנח את צד מוליך שקופיות על הספסל, ולהחיל את אטם סיליקון (ים) לכל שקופית שאליו שומנים ייושמו, כדי לוודא שיש לפחות 5 מ"מ של שקופית נחשפה בקצה אחד כדי להתחבר למנגנון electroformation. להחליק את האטם על מנת להבטיח חותם טוב.
  8. לדלל את הכנת השלפוחית ​​בחיץ מליחות נמוכה מלח ל~ 1-2 מ"ג / מ"ל. אנו מוצאים כי concentr גבוה יותרations לייצר תוצאות עניות.
  9. החל שומנים לשקופית בטיפות μl 1-10. טיפות קטנות יותר בדרך כלל לייצר תוצאות טובות יותר.
  10. מניחים את השקף על מדף הפנים מעל תמיסת מלח הרווי ולאטום את המכל בחוזקה. השאר על RT במשך 3 שעות לO / נ ניתן להציב את המכל על 4 מעלות צלזיוס, אך שים לב כי עבור חלק מהמלחים, RH תלוי בחום על טמפרטורה, וקר שיגדיל את זמן איזון.
  11. הסרט עשוי כתוצאה מכך יש לו ברק קשת קלה אליו, אבל בכל מקרה צריך להופיע כמעט מיובשת. פתרונות מתחילים מאוד האוסמוטי עשויים להיות בלתי אפשריים להתייבש לחלוטין לסרט שומנים בדם, זה לא ישפיע לרעה על התוצאות.

4. Electroformation של יפוזומים ענק

  1. סרטי שומנים בדם, במיוחד אלו שנוצרו מיפוזומים מיובשים, הם משתחררים ממקומם בקלות. מימה בזהירות כל אחד גם על ידי הצבת מחט 27 G מזרק בקצה של האטם וליישם את החיץ לאט. מאגרים יכוליםכולל מים, סוכרוז ≤ 200 מ"מ, ≤ M 1 סורביטול ו≤ 5 HEPES המ"מ. תמיסת מלח יותר מ -10 מ"מ עשויה לדרוש פרוטוקולי מתח electroformation חלופיים. תמלא יותר מדי בכל אטם היטב על ידי ~ 10%.
  2. הערה: פעם אחת השומנים הם התייבשות, להמשיך במהירות בשלבים הנותרים, שכן סרטי שומנים מתחילים delaminate באופן מיידי. התשואה וגודל הם מוגדל אם electroformation מתחילה מייד.
  3. בתנועה אחת חלקה, יחול, שקופית פנים מוליך שני איטו ב, לחלק העליון של האטם. לוודא שיש לפחות 5 מ"מ של הסככה מחוץ לאזור האטם ומול הסככה הראשונה. לחץ בעדינות על מנת להבטיח חותם טוב.
  4. נקה את שתי סככות באמצעות אתנול ולוודא כי צדדים העומדים בפני האטם הם מוליך עם מודד שלך.
  5. התא יכול להיות מאובטח יותר עם parafilm או קליפים אביב מתח קלים אם תרצה בכך.
  6. חברו לתא electroformation למקור מתח על ידי הבטחת סורגי אלומיניום או נחושת, "EMI Gaskקצף ואח ", או סרט מוליך מודבקות למשטחים מוליכים של שתי השקופיות. אנו משתמשים בקצף אטם EMI. תוכניות ללנענע ותפס מוצגים באיור 5.
  7. ודא שאין קצר חשמלי בין המגעים, וכי המגעים להתחבר כראוי למשטחי איטו, באמצעות מודד.
  8. מחממים את החדר 10 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת ההתכה הגבוהה ביותר של כל אחד משומני הווה; למשל עבור DPPC, חום עד 52 מעלות צלזיוס לפחות, 10 ° C מעל טמפרטורת התכת השרשרת של 42 ° C.
  9. למאגרים דלי מלח, להחיל 10 הרץ גל סינוס, ~ 0.7 V RMS לכל מילימטר פער בין שני המשטחים המצופים איטו, עבור 60-90 דקות. למאגרי מלח גבוהים, יש להשתמש בפרוטוקולי מתח אחרים (ראה הפניות).

5. הדמיה ופתרון בעיות

  1. תמונת liposome באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במסנן עבור קוביית Rhodamine או אדום צבעי טקסס. Liposome צריך להיות כדורי,בעיקר unilamellar לפי העין, ונקי מפגמים, כגון "מחרוזות" תלויות מעל liposome.
  2. אם הם קטנים מדי ליפוזומים, להשתמש בפחות שומנים בדם.
  3. אם יש פגמים רבים או כמה ליפוזומים, זה יכול להיות בגלל שומני ג'ל שלב. לשקול העלאת טמפרטורת electroformation.
  4. אם כמה, אם בכלל, ליפוזומים ענק נוצרו בכל מיפוזומים קטנים מיובשים, להפחית את כוח האוסמוטי של חיץ liposome, או להגדיל את כוח האוסמוטי של חיץ electroformation. זרימה פנימית של חיץ לפתרון חיץ ביניים המרוכז יכולה לגרום delamination של סרט השומנים שהופקד.
  5. אם תשואת שלפוחית, איכות, או גודל הוא עניה, ואתה כלל מלחים או תמיסות בופר במאגרי electroformation או liposome, לשקול פרוטוקולי מתח electroformation חלופיים. לדוגמה, פוט, et al. -11, ממליץ פרוטוקול שלושה צעד באמצעות 500 הרץ sinewave, העלאת המתח מ50-1,300 Vpp / מ 'מעל 30 דקות, מחזיק עבור 90 דקות,n יורד תדירות ל -50 הרץ מעל 30-60 דקות. אלקטרודות פלטינה או טיטניום ייתכן שתהיינה הצורך במקרה הזה, אבל זה לא משנה באופן מהותי את הפרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדוגמאות שלנו, שאנו מכינים ליפוזומים מתערובת של כ -55% מול POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-phosphocholine), 15% מול POPS (1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-phosphoserine , 30% מול כולסטרול, ו -0.1% מול טקסס האדומה שכותרתו 1,2-dipalmitoyl-SN-phosphoethanolamine (TxR-DPPE). הרכב זה נבחר כנציג של שומנים כ גנגליון שורש הגבי 18. נציין כי 15% מול מחויבים שומנים (כאן POPS) הוא קרובים לגבול של מה שניתן להשתמש בו בelectroformation (למשל אלדה et al. 4).

התפלגות שומנים בדם על ידי הידרוליזה וחמצון היא נושא חשוב במיוחד עבור תערובות שומנים רבות וניסויים רגישים רבים (ראה דיון). לשם בהירות לבד, אנחנו לא משתמשים באטמוספרות גז אינרטי במצגת וידאו. כפי שעולה מהנתונים שלהלן, אין בכך להשפיע באופן ניכר על איכות יפוזומים, אך ללימודים או רגישיםבעת שימוש בשומנים בלתי רוויים מאוד חשוב כדי למנוע התמוטטות שומנים בדם.

מאז את המשוכה המרכזית בelectroformation היא ליצור סרט שומנים טוב על מצע תחמוצת אינדיום הבדיל (איטו), לדעת מה סרט השומנים אמור להיראות כשמיובש הוא קריטי. עם זאת, כאשר electroformation נכשל, זה לעתים קרובות עושה זאת לחלוטין, וכתוצאה מכך אין ייצור liposome ענק ניכר. לעתים קרובות, שאריות משמעותיות יקויימו, זה בדרך כלל מצביע על כך שכבר בשימוש יותר מדי שומנים בדם. הנתונים שלנו מראים מה שמצפה לראות על הצלחה.

איור 2 מראה שני כתמי יפוזומים electroformed משומנים שהופקדו מתוך כלורופורם שונים. בחלונית השמאלית, לבחון מקרוב את התיקונים מסומנים על ידי חצים 2 ו -3. תוך חץ 2 מציין תיקון עם יפוזומים נבדלים גרוע, אפשר להביא אין יפוזומים אל מוקד באזור המסומן על ידי חץ 3. יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על עניים בדרךהכנה, כנראה בגלל שיש יותר מדי שומנים להיות מופקדת בתחום זה. בפנל הימני, אזורים כאלה "מעורפלים" הם פחות נפוצים, מה שמעיד על הכנה טובה יותר באופן כללי. אנחנו מוצאים שזה נדיר לחסל פגמים כאלה לחלוטין.

איור 3 מציג יפוזומים electroformed בהצלחה משומנים שהופקדו על ידי התייבשות של יפוזומים קטנים, בשתי הגדלות, צילמו באמצעות טקסס האדום epifluorescence. ליפוזומים הם דלילים, אבל יש כמה דגימות טובות. בגלל גודל משתנה, כמה הם מחוץ לפוקוס. החצים מציינים שלושה יפוזומים באיכות טובות החל בגודל ~ 5-20 מיקרומטר, שתיים מהן מופיע בתמונה בהגדלת 40X. שים לב "טבעת" ברורה שבקצה: ​​זה מצביע liposome unilamellar או כמעט unilamellar. בעוד כמה כתמים של שומנים בדם נראה שיש לי התמוטטו או לעולם לא יצרו שומנים בדם, זה הוא תוצאה באיכות טובה.

לבסוף, המטרה שלנו בפיתוח והוצאה לאור פרוטוקול זההוא להכין GUVs עם ערוצים שלמים, פונקציונלי יונקים יון שאינם מתאימים לelectrophysiology תיקון מהדק הקונבנציונלי. באיור 4 אנו מדגימים TRPV1 זרמים יוניים קפסאיצין המופעל נרשמו בכתמי קרום שומניים ניכרים מGUVs נוצר באמצעות פרוטוקול זה. הנוכחי יכול להיות חסום על ידי רותניום אדום, ואינו מופעל על ידי קפסאיצין הרכב (0.1% אתנול, 138 מ"מ NaCl, pH 3 HEPES מ"מ 7.4) לבד. הכנת proteoliposomes לניסויים electrophysiology היא הרבה מעבר להיקף של הפרוטוקול הנוכחי, אבל הוא הנושא של מאמר שהוגש.

מלח Molality @ 20 ° C ו הרוויה @ 10% לחות יחסית מעלות צלזיוס @% לחות יחסית 20 מעלות צלזיוס @% לחות יחסית 30 מעלות צלזיוס
Hexahydrate מגנזיום כלוריד 5.8 33 33 32
Dihydrate אשלגן קרבונט 8.0 47 44 42
נתרן ברומיד 4.6 58 57 57
כלוריד cupric 5.6 68 68 67
נתרן כלוריד 6.13 75 75 75
אשלגן כלורי 4.61 87 86 84

טבלת מס '1. לחות יחסית (% לחות יחסית) של כמה מלחים נפוצים נתוני לחות יחסית מגרינספן 19 ורוקלנד 20;. נתוני הרוויה מהשולחנות הקריטיים הבינלאומיים 21.

איור 1 איור 1. סכמטי של electroformation liposome הענק מיפוזומים קטנים. יפוזומים קטנים (למעלה משמאל) מופקדים במערך של טיפות קטנות, <5 μl. (במרכז למעלה) את יפוזומים מיובשים תחת לחות היחסית מבוקרת על ידי הצבת אותם במכל אטום מעל תמיסת מלח רוויה. מד לחות היא אופציונלית. (מימין למעלה) ברגע מיובש לסרט דביק של שומנים בדם ו (אולי) osmoticant כגון סורביטול, השומנים הם rehydrated בחיץ hyperosmotic (ראה סעיף 5 בפרוטוקול). (שמאלי תחתון) הקאמרית electroformation הוא חתום עם שקופית איטו שנייה על העליונה. (תחתון מימין) ולבסוף, החדר מחומם מעל טמפרטורת התכת שרשרת השומנים בדם, והוא מחובר למקור אות מתן שדה חשמלי נדנוד פני שתי שקופיות איטו.

איור 2

איור 3
איור 3. ליפוזומים ענקים Electroformed נוצרו משומני התייבשות-הופקדו. (משמאל) בהגדלה 10x, כמה ליפוזומים גלויים. שלושה יפוזומים מסומנים. (מימין) באותה התצוגה כמו בשמאל, בהגדלה של 40X, עם אותוליפוזומים (2 ו -3) שכותרתו. מספר יפוזומים אלה הוא בדרך כלל הרבה יותר קטן מאשר כאשר electroforming משומנים ממסים מופקדים, אבל זה מספיק לגמרי למטרות רבות. צילמו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הפוך מצוידים Chroma 41004 טקסס אדומה מסנן קובייה ומצלמה סטנפורד פוטוניקס XR/MEGA-10 S30 התעצם CCD.

איור 4
איור 4. קפסאיצין הפעיל TRPV1 נוכחי נרשמו בתיקון קרום נכרת מבוס נוצר באמצעות פרוטוקול זה. א דליפה הנוכחי הצביע 500 לאטום התנגדות MΩ לפני קפסאיצין נוסף. ב להרוות קפסאיצין (> 20 מיקרומטר, ב0.1% אתנול) מפעיל TRPV1 הנוכחי גדול; ג. חוזר הנוכחי חסום על ידי רותניום אדום, ואינו מופעל על ידי רכב (0.1% אתנול במאגר) לבד (מידע לא מוצג) הנוכחיתלקרוב בסיסית כמו קפסאיצין הוא שטף החוצה מהתיקון.

איור 5
איור 5. תוכניות לתא electroformation. היא כללה סקירה, המציג את המכלול השלם, וdimensioned שרטוטים לחלקי הפלסטיק העליונים ותחתונים. השתמש אקריליק או פלסטיק שקוף אחר בקלות במכונה. דוד סרט Kapton הדק צריך להיות מחובר לבקר הטמפרטורה (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים), וקצף אטם EMI צריך להיות מחובר למחולל הפונקציה, כך שאות הגל סינוס מוחלת על פני שתי השקופיות המצופים איטו. חור מסופק לבדיקת טמפרטורה. ברגי flathead 10-32 ממוקמים את החורים המשוקעים בקטע התחתון, ועוברים בחלק העליון. 10-32 אגוזים משמשים כדי לאבטח את המכלול. כאשר באופן מלא כsembled, חלקי הפלסטיק העליונים ותחתונים צריכים להיות מיושרים אחד עם השני על שני צדדים (הצדדים במקביל לאטם EMI.) לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Electroformation של יפוזומים ענקים התפתח טכניקה גמישה תואמת עם שומנים שונים, תכשירים, וחוצצים. שליטה מדוקדקת של התהליך בתצהיר השומנים היא קריטית ביותר להצלחה. יש לנו הצגנו כלים פשוטים כדי להפוך תצהיר מבוקר של שומנים מהכנות liposome קטנות תהליך פשוט. הלחות היחסית היא קריטית להתייבשות נכונה של יפוזומים הראשוניים, ואת הערך האופטימלי ישתנה עם הריכוז הראשוני של מומסים בהשעית liposome. לחות היחסית נמוכה נדרשה מייבשים דגימות מרוכזות יותר לרמה נאותה.

הפרוטוקול מדויק הלחות והשדה חשמלי המשמש לelectroformation נשאר נקודה של דיון 1,4,7,10,11,22. הפרוטוקולים הפשוטים צריכים להיות שולטים ראשון לפני שתנסו electroformation liposome בנוכחות ריכוזים גבוהים מלח, שומנים טעונים, או ריכוזים גבוהים מאוד של להמיס גבוהing שומני טמפרטורה. ברגע שהכישורים האלה הם שולטים, פרוטוקולים מתקדמים יותר בדרך כלל לחלק את תהליך electroformation לשלושה חלקים: נפיחות ראשונית, צמיחה, וניתוק. נפיחות ראשונית נראה להיות מועדפת על ידי הגדלת השדה החשמלי מיושם לאט 11. שלב שני, אופציונלי בשדה כוח קבוע יכול לעזור לשלוט בגודל הסופי של יפוזומים. לבסוף, להקטין את התדירות של שדה נדנוד עשוי לעזור לנתק יפוזומים ממשטח איטו. תדרים גבוהים יותר יש צורך בתנאי electroform יפוזומים מלח פיסיולוגיים 11, אך יכולים להיווצר יפוזומים על מגוון רחב מאוד של תדרי שדה ומשרעות 10.

התצפית שיפוזומים ענקים יהוו באופן ספונטני על התייבשות של יפוזומים מיובשים עם חיץ היפו אוסמוטי 7 מציינת כמה מפתחות להצלחה. ראשית, תהליך נפיחות liposome מתחיל מייד, כך שעבור electroformation, חלקםקבוצות מצאו אפילו את זה שימושי כדי להחיל את השדה החשמלי AC לפני rehydrating שומנים סרט 10. שנית, סביר להניח כי זרימת נוזל מניעה את תהליך נפיחות liposomal, וelectroformation המתרחש לפחות בחלקו, בגלל זרימה מונעת אוסמוטי אלקטרו. זה מציב מגבלות על התדירות שימושית ומגוון משרעת, שניתן להשתמש בelectroformation 10.

נקודה עיקרית של דיון בשנים האחרונות הייתה הפוטנציאל להידרוליזה שומנים בדם וחמצון 23,24. קו ההגנה הראשונה נגד השפלת שומנים מכל סוג שהוא כדי להסיר מחמצן את כל החומרים המשמשים בהכנת הבוס: מאז peroxidation תלוי בחמצן מולקולרי 23, זה אמור להאט את התהליך באופן משמעותי. שילוב של אבק ותזה עם גז אינרטי יש להשתמש כדי להסיר כמה שיותר חמצן כ15-17 אפשרי. Sonication וואקום אור אינם יעילים. אנו משתמשים בערכת בדיקת חמצן (Chemetrics K7501) לVerify שהסרנו חמצן באופן יסודי ככל האפשר. הידרוליזה היא יותר הרסני, אבל הוא מופחת על ידי שמירה על pH ניטראלי 25, ועל ידי הפחתת המתח בשימוש בelectroformation 24. מחברים אחדים תומכים בשימוש של אלקטרודות טיטניום במקום של איטו מחליק 23,24,26,27. אנחנו מעדיפים להימנע מהאפשרות של זיהום הדגימות שלנו עם טיטניום (או כל מתכת), שכן יש לו בעבר היה ידוע להפריע לניסויי liposome 28,29, אבל זה עשוי לעזור למנוע כמה תופעות חמצון או הידרוליזה. למותר לציין, כי חשיפה ממושכת לטמפרטורות גבוהות מאיצה את התפרקות שומנים בדם 30. לבסוף, 24,31 כרומטוגרפיה דקה שכבה, מבחני colorimetric 23, ושיטות אחרות קיימות 31 לכמת השפלה שומנים בדם.

בעיה דומה מתייחסת לצבעי ניאון השומנים בדם המשמשים לGUVs תמונה, במיוחד ללימודים של הפרדת פאזות לרוחב 30,32 30,33 צבעים, ולהשתמש בו בריכוז מזערי.

אנחנו לא מודעים לכל הסכמה בשאלה האם ניתן לעשות שימוש חוזר בשקופיות אלקטרודה איטו. קבוצות רבות עושות שימוש חוזר בשקופיות איטו, וחלק לא. מחקר שנערך לאחרונה מצביע על כך שהשקופיות לעשות בזות לאורך זמן, אבל יכול להיות מרותק להחזיר לעצמו ביצועים גבוהים 34; הייתה השפלה זו רק השפעה קטנה לתערובות שומנים בדם, כולל שומני zwitterionic או anionic, אבל היה קריטי עבור תערובות המכילות שומני קטיוני. שלנו לעשות שימוש חוזר בשקופיות שלנו בלי חישול.

למרות שיש שונה גדול בפרוטוקולים המשמשים ליפוזומים electroform ענקים, הבנה התיאורטית וניסיון מעשי עם הטכניקה הוא שיפור מתמיד. כבר יכולים להיווצר יפוזומים עם כמויות גדולות של שומנים טעונים, או במאגרי מלח גבוהים. המפתח נשאר בתצהיר יעיל של שומנים על פני האלקטרודה, אשרשעות היא הליבה של הפרוטוקול שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים לבריאן Venema ואריק מרטינסון לבניית מנגנון electroformation. עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומי לבריאות (R01GM100718 לSEG) והמכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומי לבריאות (R01EY017564 לSEG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Agilent Technologies, www.agilent.com U1232A or similar Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Fluke 117 or 177 Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator Agilent Technologies, www.agilent.com 33210A or similar Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com CB-90IN-S107 or similar Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com CNi3233 or similar
Hygrometer Extech, Nashua, NH, www.extech.com 445815
Silicone rubber sheet McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com 87315K64 Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket Laird Technologies www.lairdtech.com 4202-PA-51H-01800 or similar Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com T1395MP Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com 850457P or 850457C Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS Avanti Polar Lipids 840034P/C
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  2. Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
  3. Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
  5. Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
  6. Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
  7. Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
  8. Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
  9. Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
  10. Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
  11. Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
  12. Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
  13. Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
  14. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  15. Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
  16. Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
  17. Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
  18. Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
  19. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
  20. Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
  21. Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
  22. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
  23. Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
  24. Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
  25. Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
  26. Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
  27. Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
  28. Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
  29. Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
  30. Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
  31. Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
  32. Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
  33. Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
  34. Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).

Tags

פיזיולוגיה גיליון 76 ביופיזיקה ביולוגיה מולקולרית ביוכימיה גנטיקה ביולוגיה תאית חלבונים ממברנות Bilayers מלאכותי שומנים בדם ליפוזומים פוספוליפידים ביוכימיה שומנים שלפוחית ​​Unilamellar ענקית liposome electrophysiology electroformation הכינון מחדש תיקון מהדק
הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant… More

Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology. J. Vis. Exp. (76), e50227, doi:10.3791/50227 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter