Summary
Reconstructie van functionele membraaneiwitten in gigantische liposomen van gedefinieerde samenstelling is een krachtige aanpak in combinatie met patch-clamp elektrofysiologie. Echter, kunnen conventionele reus liposoom productie onverenigbaar met eiwitstabiliteit. We beschrijven protocollen voor het produceren gigantische liposomen uit pure lipiden of kleine liposomen die ionkanalen.
Abstract
De reconstitutie van ionenkanalen in chemisch gedefinieerde lipidemembranen voor elektrofysiologische opname is een krachtige techniek om de functie van deze belangrijke eiwitten te identificeren en te onderzoeken. Echter, klassieke bereidingen, zoals vlakke dubbellagen, beperken de manipulaties en experimenten die worden uitgevoerd op de gereconstitueerde kanaal en zijn membraan omgeving. De meer cel-achtige structuur van reusachtige liposomen traditionele patch-clamp experimenten toelaat zonder dat de controle van het lipide-omgeving.
Electroformation is een efficiënt middel om grote liposomen> 10 micrometer diameter die berust op de toepassing van wisselspanning een dunne, geordende lipide film afgezet op een elektrodeoppervlak. Aangezien de klassieke protocol gaat de lipiden worden afgezet uit organische oplosmiddelen, is niet compatibel met minder robuuste membraaneiwitten zoals ionkanalen en worden gewijzigd. Onlangs, protocols ontwikkeld om grote liposomen electroform uit gedeeltelijk gedehydrateerde kleine liposomen, die we hebben aangepast aan eiwit-bevattende liposomen in ons laboratorium.
Wij presenteren hier de achtergrond, uitrusting, technieken en valkuilen van electroformation van reusachtige liposomen van kleine liposoom dispersies. We beginnen met de klassieke protocol, die eerst moet worden beheerst voordat de meer uitdagende protocollen die volgen. We tonen het proces van gecontroleerde gedeeltelijke dehydratatie van kleine liposomen met dampevenwicht met verzadigde zoutoplossingen. Tenslotte tonen we het proces electroformation zelf. We zullen eenvoudige, goedkope apparatuur die kan worden gemaakt in huis om hoogwaardige liposomen en beschrijven visueel onderzoek van het preparaat bij elke fase om de beste resultaten te beschrijven.
Introduction
Giant liposomen (vaak grote unilamellaire blaasjes of GUVs) zijn voornamelijk gebruikt in de fysica en fysische chemie van lipide bilagen, inclusief studies dubbellaag vervorming, laterale phase coëxistentie ("vlotten"), membraanfusie, etc 1-4 bestuderen. Ze hebben een grove cel-structuur: bolvormige schil van membraan rond een waterige interieur dat gemakkelijk anders dan het omringende waterige buffer kan worden gemaakt. Ze worden per definitie ≈ 1-100 micrometer diameter, zodat ze kunnen worden afgebeeld met verschillende lichtmicroscopie benaderingen. Ze kunnen strak met osmotische gradiënten of mechanisch aangebrachte spanning worden gemaakt, zodat tijdens het algemeen zacht, hun eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd voor eenvoudig gebruik. Met name het regelen van de "stijfheid" van het liposoom is het eenvoudig om "liposoom toegevoegd" of uitgeschakelde patches voor elektrofysiologie vormen. In het verleden werd ionkanaal reconstitutie grotendeels uitgevoerd in vlakke lipide bilayers. Nu de mogelijkheid om patches van grote liposomen en gebruik de aanzienlijke trilling van conventionele methoden ontwikkeld voor elektrofysiologie (fluorescentiemicroscopie micropipet aspiratie, snelle perfusie en temperatuur, etc.) met grote liposomen steeds aantrekkelijker voor reconstitutie studies 5,6.
Giant liposomen door veel strategieën. In feite, reuze liposomen spontaan door een zwelling proces bij een gedroogde lipidefilm gehydrateerd 4,7,8. De wens om sneller te bereiden grotere, meer uniforme liposomen leidde onderzoekers tot andere benaderingen, leider onder hen electroformation 1,9. Electroformation steunt ook op hydratatie van droge lipide film, maar versnelt het proces de toepassing van een oscillerend elektrisch veld over de lipide film. Het veld wordt via twee elektroden, hetzij platina draden of indium-tin-oxide (ITO) gecoate objectglaasjes, gescheiden door water ofbuffer en waarop de lipiden worden afgezet. Door het versnellen van de zwelling van liposomen, bereikt men een hogere opbrengst van de grotere liposomen. Zo heeft electroformation uitgegroeid tot de standaard methode om gigantische liposomen produceren 4.
Het mechanisme van electroformation niet volledig begrepen, en de meeste protocollen empirisch ontwikkeld (bijvoorbeeld 10,11). Toch kunnen we een beetje over wat te verwachten bij het overwegen van de theorie en enkele empirische resultaten te leren. Het wordt algemeen aangenomen dat electroformation gebeurt door een elektro-osmotische stroming van buffer tussen afzonderlijke lipide bilagen gestapeld in de afgezette film lipide 10,11. Elektrostatische koppeling thermische fluctuaties van de lipide bilagen is waarschijnlijk ook betrokken 12. Deze hypotheses kwalitatief voorspellen plafonds voor het elektrische veld frequentie en kracht die kan worden gebruikt 10,12. In het bijzonder wordt voorspeld dat oplossingen hoge geleidbaarheid (
Echter, membraaneiwitten waarschijnlijk onverenigbaar met de gebruikelijke methode van aanbrengen van lipiden op elektroden voor electroswelling procedure, namelijk in organische oplosmiddelen worden vervolgens afgedampt in een dunne lipide film verlaten. Er zijn twee belangrijkste wegen rond deze moeilijkheid: om eiwitten te nemen na het gigantische liposoomvorming, of aan te passen hoe de lipiden worden afgezet. Onze benadering bouwt voort op anderen 5,11 om de lipiden en gereconstitueerd deponerenstitueerde membraaneiwit samen uit een suspensie van kleine of grote "proteoliposomen". We beschrijven de langdurige en meer uitdagende proces van het produceren proteoliposomen uit gezuiverde eiwitten en lipiden elders (Collins en Gordon, in review). Hier beschrijven we het protocol in de afwezigheid van eiwit, maar het is hetzelfde als eiwit is opgenomen, we zijn waaruit blijkt dat proteoliposomen die het ionkanaal TRPV1 kunnen worden omgezet in GUVs en gebruikt voor patch-clamp elektrofysiologie. In elk electroformation benadering visueel onderzoek van het monster tijdens de lipide lipide depositieproces is essentieel voor het succes.
Onze aanpak kan dan de gespecialiseerde toepassing om ionkanaal reconstitutie relevant zijn. In de tijd omdat wij eerst dit protocol ontwikkeld en nu is ook aangetoond hoe de wijze welke lipiden worden afgezet op elektroden electroformation invloed op de samenstelling van de verkregen heterogeniteit GUVs. Baykal-Caglar et al.. 14 bleek dat GUVs gevormd uit zorgvuldig gedroogde liposomen hadden een 2,5 keer kleiner variaties in de mengbaarheid overgangstemperatuur van GUVs gevormd uit mengsels van verschillende fosfolipiden en cholesterol. Hun werk geeft aan dat lipiden, en in het bijzonder cholesterol, kan neerslaan uit de lipide mengsel bij afgezet uit organische oplosmiddelen, wat resulteert in grote ruimtelijke variatie in de samenstelling van de afgezette lipide film. Dit is vooral in studies van lipide membraan fasegedrag, maar kan ook van cruciaal belang kwantitatieve experimenten ionenkanalen. Protocol Baykal-Caglar et al.. 'S is vergelijkbaar, maar niet identiek aan onze eigen, en de lezers worden aangemoedigd om het te bestuderen als goed.
Dit protocol (zie overzicht, figuur 1) is een van vele die kunnen worden gebruikt. In principe electroformation succes hangt af van het lipidemengsel, hydratatie, temperatuur, andere opgeloste stoffen (vooral ionen), enNatuurlijk is de spanning en frequentie die in formatie. Zoals electroformation beter wordt begrepen, verwachten we ons protocol meer te verfijnen.
Tot slot, is er vaak een steile leercurve in elektrovormen gigantische liposomen. Wij stellen voor het beheersen van het conventionele protocol (afdelingen 1 en 4, en, indien nodig, sectie 5) voor het leren om lipiden storten van liposomaal schorsingen (secties 2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Afzetting van lipiden uit organische oplosmiddelen: Classical Protocol
- Verwijderen van lipiden uit opslag bij -20 ° C of -80 ° C, warm tot kamertemperatuur. Let op: lipiden uiterst hygroscopisch en vele zijn gevoelig voor zuurstof. Cover lipiden in droge argon of stikstof gas en in alle stappen te minimaliseren blootstelling aan lucht.
- Indien nodig, schorsen de lipiden in chloroform of cyclohexaan bij 1-10 mg / ml; mee dat verklaarde concentraties fabrikant zijn meestal nominaal slechts VOORZICHTIG: Draag geschikte handschoenen en andere persoonlijke beschermingsmiddelen bij het gebruik van organische oplosmiddelen.. Verwijder de PPE snel als oplosmiddel wordt gemorst op hen, zoals de meeste materialen zijn nog steeds doorlaatbaar voor deze oplosmiddelen en ze bieden alleen tijdelijke bescherming.
- Reinig beide zijden van twee 25 x 37,5 mm ITO gecoat glas dia's met ethanol
- Meng de lipiden de gewenste molaire verhoudingen te bereiken. Voor elke 1 cm2 van de oppervlakte van ITO dia's te worden bekleed met lipid, mix ~ 15-20 ug van lipiden. Als bijvoorbeeld zowel 25 x 37,5 mm glijbanen waren volledig worden bekleed, we zouden gebruiken meestal 30 ui 10 mg / ml lipide mengsel. Opmerking: voeg 0,1 mol% Texas Red-DPPE voor fluorescentie beeldvorming en zie hieronder voor waarschuwingen over fluorescente kleurstoffen.
- Controleer of de ITO gecoate zijde van de glasplaatjes is naar boven door het meten van de oppervlakte weerstand met een ohmmeter of multimeter.
- Aspireren de lipiden in een solvent-resistente spuit. Let op: geen lijm of kunststof, andere dan PTFE, moeten contact opnemen met het organische oplosmiddel.
- Met de naald niet helemaal het aanraken van de ITO-oppervlak, langzaam gelden de lipide verplaatsen van de naald heen en weer over de glijbaan. Bedek het oppervlak zo gelijkmatig, op zoek naar een "regenboog glans" op het glasoppervlak.
- Plaats de dia's snel onder <1 Torr (1 mmHg) vacuüm voor 0,5-1 uur om eventuele sporen oplosmiddel te verwijderen. Los vacuüm met inert gas.
- Breng een siliconen pakking, met eendunne laag siliconen vacuüm vet aan beide zijden. Laat ten minste 5 mm onbedekt dia blootgesteld aan een uiteinde van de schuif.
- Ga onmiddellijk door Sectie 4.
2. Kleine liposoombereiding voor Controlled Uitdroging
- Bereid het lipide mengsel in stap 1,1-1,4.
- Droog de lipiden met een stroom van argon of stikstof gas in een 10-15 mm diameter cultuur buis. Voor kleine hoeveelheden lipiden, ≤ 0,5 mg, de resulterende film kan gehydrateerd worden direct na het onder vacuüm voor 0,5-1 uur om resterende oplosmiddel te verwijderen, gaat u naar stap 2.5. Grotere hoeveelheden lipiden hebben de neiging om organische oplosmiddelen, zelfs onder vacuüm val in een dikke gel, en zijn beter voorbereid door vriesdrogen; zie stappen 2,3-4.
- Suspendeer het gedroogde lipide film in cyclohexaan, deksel met Argon en sluit de fles hermetisch Plaats de buis in een koude blok en invriezen bij -80 ° C gedurende 1 uur minimum.
- Leg de koude blok en lipide monster in een vacuümsysteemstaat het bereiken van 100 mTorr. Solliciteer vacuüm, het zal "stal" op ongeveer 1 Torr als oplosmiddel sublimeert af. Zodra oplosmiddel wordt volledig verwijderd (~ 1 uur) vacuüm zal dalen tot onder dit niveau. Los vacuüm met inert gas en sluit de buis of hydrateren onmiddellijk.
- Terwijl de lipiden zijn onder vacuüm, ontgassen hydratatie buffer met behulp van vacuüm en spoelen 15-17.
- Hydrateren de lipiden met ontgaste buffer bij uiteindelijke concentratie 1-10 mg / ml. Laat de lipiden te hydrateren langzaam. Na 30 min-1 uur, vortex te breken resterende klonten. Wacht een extra 0,5-1 uur voor volledige hydratatie. Gebruik een osmoticant, zoals sorbitol of sucrose tot 200 mM, volledige dehydratie in volgende stappen te voorkomen.
- Bereid 100-200 nm diameter liposomen door extrusie. Zie fabrikant extrusie-protocol voor meer informatie. Merk op dat de buffer moet minder dan ~ 25 mM ionsterkte of speciale electroformation voltage protocollen vereist in paragraaf 4.
3.Afzetting van lipiden door de gecontroleerde Uitdroging van Kleine liposomen
- Opgelet: Ons protocol vereist lipiden in evenwicht met damp verzadigde zoutoplossingen urenlang worden geplaatst. We raden het uitvoeren van het protocol in een inerte atmosfeer gas, met een handschoen doos of soortgelijke behuizing.
- Let op: Als voorbereiding monsters bevattende eiwitten, vermijd volledige uitdroging. Hydrateren de sfeer in een afgesloten ruimte met een beker warme water, of een sonicator gebaseerde luchtbevochtiger. Gebruik een hygrometer om te zorgen voor ten minste 30% relatieve vochtigheid. Gebruik sorbitol of sucrose in de kleine liposoom buffer als extra voorzorgsmaatregel om totale uitdroging te voorkomen.
- Bereid een verzadigde zoutoplossing van passende relatieve vochtigheid. Target vochtigheid afhankelijk van de osmolariteit van de vesicle preparaat. Voor preparaten met fysiologische osmolariteit, gebruiken 30-45% relatieve luchtvochtigheid, terwijl een lage osmolariteit vesiclepreparaten adequaat uitgedroogd kan zijn inevenwicht met 75-90% RH (zie ook tabel 1).
- Zet de verzadigde zoutoplossing en teveel zout in een goed afsluitbare container met een interieur plank. Commerciële voedsel containers voor yoghurt en muesli werken heel goed. Vervang de plank na het vullen, en zorg ervoor dat vocht is 5-10 mm onder de plank.
- Schoon ITO gecoate glaasjes zoals in deel 1. Gebruik de multimeter om te bepalen welke kant is geleidend, en het etiket van de niet-geleidende kant met de naam monster.
- Vet beide zijden van de silicone (USP klasse VI) pakking (s) met een of meerdere gaten.
- Plaats de dia's geleidende kant naar boven op de bank, en de toepassing van de siliconen pakking (s) aan elke dia waaraan lipide zal worden toegepast, zorg ervoor dat er minstens 5 mm van de glijbaan aan de ene kant aan te sluiten op de electroformation apparaat. Strijk de pakking om een goede afdichting te garanderen.
- Verdun het blaasje voorbereiding op een zoutarm isosmotic buffer om ~ 1-2 mg / ml. Wij vinden dat hogere concentraties produceren slechte resultaten.
- Toepassing lipide om de dia in 1-10 pl druppels. Kleinere druppels produceren in het algemeen betere resultaten.
- Plaats de dia op het interieur plank boven de verzadigde zoutoplossing en sluit de verpakking goed. Voeg bij kamertemperatuur gedurende 3 uur tot O / N. De houder kan worden geplaatst bij 4 ° C, maar merk op dat voor sommige zouten, de RV sterk afhankelijk van temperatuur, en dat kou evenwichtstijdstip toenemen.
- De resulterende film mogen een lichte regenboog glans aan het, maar in ieder geval zou moeten verschijnen bijna uitgedroogd. Zeer osmotische starten oplossingen kunnen onmogelijk volledig drogen aan een lipide film te zijn, dit geen nadelige invloed op de resultaten.
4. Electroformation van Giant Liposomen
- Lipide films, vooral gevormd uit gedehydrateerde liposomen zijn gemakkelijk zorgvuldig hydraat elk putje verdreven. Door een 27 G injectienaald aan de rand van de pakking en langzaam toepassen buffer. Buffers kunnenonder water, ≤ 200 mM sucrose, ≤ 1 M sorbitol en ≤ 5 mM HEPES. Meer dan 10 mM zout oplossing kan alternatieve electroformation spanning protocollen nodig. Overvulling elke pakking goed met ~ 10%.
- Opmerking: zodra de lipiden zijn gehydrateerd, gaat snel door de resterende stappen, omdat lipide films direct beginnen te delamineren. Opbrengst en grootte worden gemaximaliseerd als electroformation begint onmiddellijk.
- In een vloeiende beweging, breng dan een tweede ITO glijbaan, geleidende gezicht in, naar de top van de pakking. Zorg ervoor dat u ten minste 5 mm overhang hebben buiten de pakking en tegenover de eerste overhang. Druk voorzichtig om een goede afdichting te garanderen.
- Reinig de twee overhangen met ethanol en controleer of zijden tegenover de pakking zijn geleidend met uw multimeter.
- De kamer kan verder worden beveiligd met parafilm of lichte trekveer clips indien gewenst.
- Sluit de electroformation kamer met een spanningsbron door het veiligstellen van aluminium of koperen staven, "EMI Gasket schuim "of geleidende kleefband voor geleidende oppervlakken van de beide schuiven. We gebruiken EMI gasket schuim. plannen voor een jig en klem worden getoond in Figuur 5.
- Controleer of er geen kortsluiting tussen de contacten, en dat de contacten correct verbinden aan de ITO oppervlakken, met behulp van de multimeter.
- Verwarm de kamer 10 ° C boven het hoogste smeltpunt van een van de onderhavige lipiden, bijv. DPPC, warmte tot 52 ° C minimaal, 10 ° C boven de smelttemperatuur van keten 42 ° C.
- Voor zoutarme buffers, breng dan een 10 Hz sinus, ~ 0,7 V rms voor elke millimeter ruimte tussen de twee ITO gecoate oppervlakken, voor 60-90 minuten. Voor hoge zout buffers, moeten andere spanning protocollen worden gebruikt (zie referenties).
5. Imaging en probleemoplossing
- Beeld het liposoom met een omgekeerde microscoop uitgerust met een filter kubus Rhodamine of Texas Red kleurstoffen. De liposoom moet bolvormig zijnvoornamelijk unilamellair op het oog, en vrij van gebreken, zoals "strings" opknoping van het liposoom.
- Als de liposomen te klein, minder vet.
- Als er veel of weinig defecten liposomen kan dit door gel-fase lipiden. Overwegen om de electroformation temperatuur.
- Als er maar weinig of geen gigantische liposomen gevormd bij allen van gedroogde kleine liposomen, verminderen de osmotische sterkte van het liposoom buffer, of verhoging van de osmotische sterkte van de electroformation buffer. Een inschakelstroom van buffer in de geconcentreerde interstitiële bufferoplossing kan veroorzaken delaminatie van de gedeponeerde lipidefilm.
- Als blaasje opbrengst, kwaliteit, of grootte is slecht, en u opgenomen zouten of pH buffers in de electroformation of liposoom buffers, overwegen alternatieve electroformation spanning protocollen. Bijvoorbeeld, Pott, et al.. 11, raden een drie stappen protocol met behulp van een 500 Hz sinus, het verhogen van de spanning van 50-1,300 Vpp / m meer dan 30 min., houden gedurende 90 minuten, den verminderen van de frequentie 50 Hz gedurende 30-60 minuten. Platina of titanium elektroden nodig zijn in dit geval, maar dit zal niet wezenlijk veranderen protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze voorbeelden hebben we liposomen bereid uit een mengsel van ongeveer 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfoserine , 30 mol% cholesterol, en 0,1 mol% Texas Red-gelabelde 1,2-dipalmitoyl-sn-fosfoethanolamine (TxR-DPPE). Deze samenstelling werd gekozen als ongeveer vertegenwoordiger van dorsale wortel ganglion lipiden 18. We merken op dat 15 mol% opgeladen lipide (hier POPS) ligt in de buurt van de grens van wat kan worden gebruikt in electroformation (bv. Walde et al.. 4).
Uitsplitsing Lipid door hydrolyse en peroxidatie is een bijzonder belangrijk onderwerp voor veel lipidenmengsels en vele gevoelige experimenten (zie discussie). Voor de duidelijkheid alleen, doen we niet inert gas atmosferen te gebruiken in de video presentatie. Zoals blijkt uit de onderstaande figuren, is dit niet merkbaar beïnvloeden de kwaliteit van de liposomen, maar voor gevoelige studies ofdie met zeer onverzadigde lipiden is het belangrijk om afbraak lipide voorkomen.
Aangezien de belangrijkste hindernis in electroformation is om een goede lipide film te vormen op het Indium-Tin Oxide (ITO) substraat, wetende wat de lipide film eruit moet zien wanneer gedroogd is cruciaal. Wanneer electroformation faalt, vaak doet volledig, waardoor er geen noemenswaardige grote liposoom productie. Vaak zal aanzienlijke detritus opgemerkt, betekent dit doorgaans dat teveel lipiden is gebruikt. Onze cijfers tonen wat men verwacht te zien op succes.
Figuur 2 toont twee verschillende plekken op de liposomen geëlektroformeerd uit lipiden neergelegd uit chloroform. In het linkerpaneel, nauwkeurig onderzoeken de aangegeven met pijlen 2 en 3 patches. Terwijl de pijl 2 geeft een patch met slecht onderscheiden liposomen, kan geen liposomen in beeld worden gebracht in de door pijl 3 gebied. Samen tonen deze bevindingen aan tot een tekortvoorbereiding, waarschijnlijk te wijten aan dat er te veel vet afgezet in dit gebied. In het rechter paneel, zoals "fuzzy" regio's komen minder vaak voor, wat wijst op een algemeen betere voorbereiding. Wij vinden dat het is zeldzaam om dergelijke onvolkomenheden volledig te elimineren.
Figuur 3 toont liposomen succes electroformed van lipiden afgezet door uitdroging van kleine liposomen, bij twee vergrotingen, afgebeeld met behulp van Texas Red epifluorescente. Liposomen zijn schaars, maar er zijn verschillende goede exemplaren. Omdat de grootte varieert, enkele zijn onscherp. De pijlen geven drie goede kwaliteit liposomen, variërend in grootte van ~ 5-20 micrometer, waarvan er twee worden weergegeven in de afbeelding van het 40x vergroting. Let op de duidelijke "ring" aan de rand: dit duidt op een unilamellair of bijna unilamellair liposoom. Terwijl sommige plekken van lipide lijken te zijn ingestort of nooit gevormd lipide, is dit een goede kwaliteit resultaat.
Tot slot, ons doel in het ontwikkelen en publiceren van dit protocolis om GUVs bereiden met intacte, functionele zoogdieren ionkanalen die geschikt zijn voor conventionele patch-clamp elektrofysiologie zijn. In Figuur 4 zien we capsaicin-geactiveerde TRPV1 ionische stromen opgenomen in lipide membraan pleisters werden uit GUVs gevormd met dit protocol. De stroom kan worden geblokkeerd door Ruthenium rood en wordt niet door de capsaicin vehikel (0,1% ethanol, 138 mM NaCl, 3 mM HEPES pH 7,4) alleen geactiveerd. De voorbereiding van de proteoliposomen voor elektrofysiologie experimenten is ver buiten het bereik van het huidige protocol, maar is het onderwerp van een ingediend artikel.
| Zout | Molaliteit @ 20 ° C en verzadiging | % RV bij 10 ° C | % RH bij 20 ° C | % RV @ 30 ° C |
| Magnesiumchloridehexahydraat | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| Kaliumcarbonaat dihydraat | 8.0 | 47 | 44 | 42 |
| Sodium Bromide | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| Cuprichloride | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| Natriumchloride | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| Kaliumchloride | 4.61 | 87 | 86 | 84 |
Tabel 1. Relatieve vochtigheid (% RV) van de verschillende gemeenschappelijke zouten Relatieve luchtvochtigheid gegevens van Greenspan 19 en Rockland 20;. Verzadiging gegevens van de International Critical Tables 21.
Figuur 1. Schematische voorstelling van gigantische liposoom electroformation van kleine liposomen. (Linksboven) Kleine liposomen worden afgezet in een reeks van kleine druppeltjes, <5 pl. (Top center) De liposomen zijn uitgedroogd onder gecontroleerde relatieve vochtigheid door ze in een afgesloten container boven een verzadigde zoutoplossing. Een hygrometer is optioneel. (Rechtsboven) Eens gedehydrateerd tot een kleverig laagje van lipide-en (eventueel) osmoticant zoals sorbitol, worden de lipiden gerehydrateerd in een hyperosmotische buffer (zie protocol hoofdstuk 5). (Linksonder) de electroformation kamer wordt afgesloten met een tweede ITO dia bovenop. (Rechtsonder) Tenslotte is de kamer boven de lipideketenlengte smelttemperatuur verwarmd, en verbonden met een signaalbron voorzien van een oscillerend elektrisch veld over de twee ITO slides.
Figuur 3. Electroformed gigantische liposomen gevormd door uitdroging-afgezet lipiden. (Links) Bij 10x vergroting, meerdere liposomen zijn zichtbaar. Drie liposomen zijn gelabeld. (Rechts) dezelfde weergave als links, bij 40x vergroting, met dezelfdeliposomen (2 en 3) gemerkt. Het aantal van deze liposomen is meestal veel kleiner dan wanneer elektroformeren van oplosmiddelen neergeslagen lipide, maar is volledig voldoende voor vele doeleinden. Beeld gebracht met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een Chroma 41.004 Texas Red filter kubus en Stanford Photonics XR/MEGA-10 S30 geïntensiveerde CCD-camera. 
Figuur 4. Capsaïcine geactiveerde TRPV1 stroom geregistreerd in een membraan patch uitgesneden uit een GUV gevormd met behulp van dit protocol. A. De lekstroom aangegeven een 500 MQ verzegelen verzet voordat capsaïcine werd toegevoegd. B. Saturating capsaïcine (> 20 uM, in 0,1% ethanol) activeert een TRPV1 grote stroom;. de stroom wordt geblokkeerd door Ruthenium rood en wordt niet alleen geactiveerd drager (0,1% ethanol in buffer) (gegevens niet getoond) C. De huidige rendementvan de uitgangswaarde in de buurt zo capsaïcine wordt gewassen uit de patch. 
Figuur 5. Plannen voor electroformation kamer. Inbegrepen is een overzicht, waarin de complete montage en gedimensioneerd schema's voor de boven-en onderkant plastic stukjes. Gebruik acryl of andere gemakkelijk machinaal doorzichtig plastic. De dunne Kapton film verwarmer moet worden aangesloten op de temperatuurregelaar (zie tabel specifieke reagentia en apparatuur), en de EMI pakking schuim moet worden aangesloten op de functiegenerator, zodat de sinusgolf wordt aangelegd over de twee ITO gecoate glaasjes. Een gat is voorzien van een temperatuursensor. Flathead 10-32 schroeven worden geplaatst in de verzonken gaten in het onderste stuk, en door het bovenste stuk. 10-32 noten worden gebruikt om het vast te zetten. Wanneer deze volledig alsmonteerd, moeten de boven-en onderkant stukjes plastic spoelen met elkaar te zijn aan twee zijden (de zijkanten parallel aan de EMI pakking.) Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electroformation van reusachtige liposomen heeft zich ontwikkeld tot een flexibele techniek die compatibel is met diverse lipiden, preparaten en buffers. Zorgvuldige controle van het lipide afzetting is het meest essentieel voor het succes. We hebben eenvoudige hulpmiddelen gepresenteerd aan gecontroleerde afzetting van lipiden uit kleine liposoompreparaten een eenvoudig proces te maken. De relatieve vochtigheid is essentieel voor juiste dehydratatie van de oorspronkelijke liposomen, en de optimale waarde afhankelijk van de initiële concentratie van opgeloste stoffen in de liposoomsuspensie. Lagere relatieve vochtigheid is nodig om meer geconcentreerde monsters uitdrogen tot een adequaat niveau.
De exacte hydratatie protocol en elektrisch veld gebruikt voor electroformation blijft een punt van discussie 1,4,7,10,11,22. De eenvoudigste protocollen moet eerst worden beheerst voordat liposoom electroformation in de aanwezigheid van hoge zoutconcentraties, geladen lipiden, of zeer hoge concentraties hoogsmeltendeING temperatuur lipiden. Zodra deze vaardigheden onder de knie, meer geavanceerde protocollen meestal verdelen het electroformation proces in drie delen: de initiële zwelling, groei, en onthechting. Aanvankelijke zwelling lijkt worden bevorderd door langzaam de aangelegde elektrische veld 11. Een tweede, optionele podium op vaste veldsterkte kan helpen bij het controleren van de uiteindelijke grootte van de liposomen. Tenslotte verminderen van de frequentie van het oscillerende veld kan helpen om liposomen van de ITO oppervlak los. Hogere frequenties zijn nodig om liposomen in fysiologisch zout omstandigheden 11 electroform, maar liposomen kan dan een zeer breed scala van het veld frequenties en amplitudes 10 worden gevormd.
De waarneming dat reuze liposomen spontaan zal vormen bij de rehydratatie van gedehydrateerde liposomen met een hypo-osmotische buffer 7 geeft een aantal sleutels tot succes. Eerst begint meteen het liposoom zwelling proces, zodat bij electroformation sommigegroepen hebben zelfs vonden het nuttig om de AC elektrische veld toe te passen voordat hydrateren de lipide film 10. Ten tweede, is het waarschijnlijk dat fluïdumstroming drijft de liposomale zwelling proces en voorkomt electroformation althans gedeeltelijk door electro-osmotisch aangedreven flow. Dit beperkt het bruikbare frequentie en amplitude bereik dat kan worden gebruikt in electroformation 10.
Een belangrijk punt van discussie in de afgelopen jaren is het potentieel voor lipide hydrolyse en peroxidatie 23,24. De eerste verdediging tegen lipide afbraak van welke aard van zuurstof van alle in de GUV voorbereiding materialen te verwijderen: aangezien peroxidatie afhankelijk moleculaire zuurstof 23 dient dit proces aanzienlijk vertragen. Een combinatie van vacuüm en spoelen met inert gas worden gebruikt om zoveel mogelijk zuurstof te verwijderen 15-17. Sonicatie en lichte vacuüm zijn niet effectief. We maken gebruik van een zuurstof testkit (Chemetrics K7501) tot verify dat we hebben zuurstof zo grondig mogelijk verwijderd. Hydrolyse is schadelijk, maar wordt verminderd door het handhaven neutrale pH 25, en door het verminderen van de spanning in electroformation 24. Sommige auteurs pleiten voor het gebruik van titanium elektroden in plaats van ITO schuift 23,24,26,27. Wij vinden de mogelijkheid van besmetting van onze monsters met titanium (of metalen) te vermijden, aangezien het in het verleden bekend interfereren met liposoom experimenten 28,29, maar het kan helpen om enkele peroxidatie of hydrolyse effecten te voorkomen. Het spreekt vanzelf dat langdurige blootstelling aan hoge temperaturen versnelt lipide verdeling 30. Tenslotte dunnelaagchromatografie 24,31, colorimetrische assays 23, 31 en andere methoden bestaan om lipide afbraak kwantificeren.
Een soortgelijk probleem is dat zij fluorescent lipide kleurstoffen gebruikt om beelden GUVs, vooral voor studies laterale fasescheiding 30,32 30,33 worden gekozen, en gebruikt bij een minimale concentratie.
We zijn niet bewust van enige consensus over de vraag of de ITO elektrode dia's kunnen worden hergebruikt. Veel groepen doen opnieuw hun ITO dia's, terwijl sommige niet. Recent onderzoek geeft aan dat de dia's doen degraderen na verloop van tijd, maar kan worden getemperd om hoge prestaties 34 te herwinnen; dit degradatie had slechts een klein effect voor lipidenmengsels inclusief zwitterionisch of anionische lipiden, maar was kritisch voor mengsels die kationische lipiden. We hergebruiken onze dia's zonder gloeien.
Hoewel er grote variatie in de protocollen die worden gebruikt om gigantische liposomen, de theoretische kennis en praktische ervaring met de techniek electroform wordt steeds beter. Reeds liposomen kunnen worden gevormd met grote hoeveelheden geladen lipiden, of in hoge zout buffers. De oplossing verblijft efficiënte afzetting van lipiden op het elektrodeoppervlak, which is de kern van ons protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Bryan Venema en Eric Martinson voor het construeren van de electroformation apparaat. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health (R01GM100718 aan SEG) en het Nationale Instituut van de National Institutes of Health Eye (R01EY017564 aan SEG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
