Jätte liposomberedningen för Imaging och Patch-Clamp Electrophysiology

Summary

Beredning funktionella membranproteiner i jätteliposomer med definierad sammansättning är en kraftfull metod när det kombineras med patch-clamp elektrofysiologi. Emellertid kan konventionella jätte lipo produktion oförenligt med protein stabilitet. Vi beskriver protokoll för framställning jätteliposomer från rena lipider eller små liposomer innehållande jonkanaler.

Abstract

Den beredning av jonkanaler i kemiskt definierade lipidmembraner för elektrofysiologiska inspelning har varit en kraftfull teknik för att kartlägga och utreda funktionen hos dessa viktiga proteiner. Men klassiska preparat, såsom plana bilayers, begränsa manipulationer och experiment som kan utföras på rekonstituerade kanalen och dess membran miljö. Ju mer cell-liknande struktur jätteliposomer tillåter traditionella patch-clamp experiment utan att offra kontrollen av lipid miljö.

Electroformation är ett effektivt medel för att producera jätteliposomer> 10 ^ m i diameter som är beroende av tillämpningen av växelspänning till en tunn, ordnad lipidfilmen avsatt på en elektrodyta. Eftersom emellertid den klassiska protokoll kräver lipiderna som skall deponeras från organiska lösningsmedel, är det inte kompatibelt med mindre robusta membranproteiner såsom jonkanaler och måste modifieras. Nyligen, protocols har utvecklats för att elektroformen jätteliposomer från delvis uttorkade små liposomer, som vi har anpassat sig till protein-liposomer i vårt laboratorium.

Vi presenterar här bakgrunden, utrustning, teknik och fallgropar electroformation av jätteliposomer från små lipo dispersioner. Vi börjar med den klassiska protokollet, som skall behärskas först innan de mer utmanande protokoll som följer. Vi visar processen med kontrollerad partiell uttorkning av små liposomer med ånga jämvikt med mättade saltlösningar. Slutligen visar vi processen för electroformation själv. Vi kommer att beskriva enkel, billig utrustning som kan göras internt för att producera högkvalitativa liposomer, och beskriva visuell inspektion av preparatet vid varje steg för att säkerställa bästa resultat.

Introduction

Jätteliposomer (ofta kallad jätte enlamellvesiklar eller GUVs) har främst använts för att studera fysik och fysikalisk kemi av lipidbiskikt, inklusive studier av bilager deformation, lateral fas samlevnad ("flottar"), membran fusion, etc ^1-4. De har en grovt celliknande struktur: sfäriskt skal av membran som omger en vattenhaltig interiör som lätt kan göras annorlunda än den omgivande vattenhaltig buffert. De är, per definition, ≈ 1-100 mikrometer i diameter, så att de kan avbildas med ett utbud av lätta mikroskopi metoder. De kan göras spänd använda osmotiska gradienter eller mekaniskt tillämpade spänning, så att medan de mjuka, kan deras egenskaper manipuleras för enkel hantering. I synnerhet styra "styvhet" av liposomen gör det enkelt att forma "lipo-anslutna" eller utskurna patchar för elektrofysiologi. Förr i tiden var jonkanal beredning stor del utförs i plant lipid Bilayers. Nu gör förmågan att bilda fläckar från jätteliposomer och använda stora darra av verktyg som utvecklats för konventionella elektrofysiologi (fluorescens mikroskopi, mikropipett aspiration, snabb perfusion och temperaturkontroll, etc.) jätteliposomer alltmer attraktivt för beredning studier ^5,6.

Giant liposomer har gjorts av många strategier. I själva verket, jätteliposomer bildas spontant genom en svällande process när en torkad lipidfilm rehydratiseras ^4,7,8. Viljan att snabbare förbereda större, ledde mer enhetliga liposomer forskare till andra metoder, främst bland dem electroformation ^1,9. Electroformation bygger också på hydratisering av en torkad lipidfilm, men påskyndar förfarandet genom tillämpning av ett oscillerande elektriskt fält över lipidfilmen. Fältet matas via två elektroder, antingen trådar platina eller indium-tenn-oxid (ITO) belagda glasskivor, åtskilda av vatten ellerbuffert och på vilka lipiderna har deponerats. Genom att påskynda svällning av liposomer, uppnår en ett högre utbyte av större liposomer. Således har electroformation blivit standard metod för att producera jätteliposomer ^4.

Mekanismen för electroformation är inte helt klarlagd, och de flesta av de protokoll utarbetas empiriskt (t.ex. ^10,11). Ändå kan vi lära sig lite om vad som väntar genom att betrakta teorin och några empiriska resultat. Det anses allmänt att electroformation sker genom att köra elektroosmotisk flöde av buffert mellan enskilda lipiddubbelskikten staplade i deponerade lipidfilmen ^10,11. Elektrostatisk koppling till termiska fluktuationer lipidbiskikten är troligen också involverade ^12. Dessa hypoteser förutspår kvalitativt övre gränser för det elektriska fältet frekvens och styrka som kan användas ^10,12. I synnerhet är det förutspås att hög ledningsförmåga lösningar ( 12. Elektroosmotiska flödeshastigheter minskar generellt med ökande saltkoncentration och ofta nådde en topp på några elektriskt fält oscillationsfrekvens (t.ex. om än i en annan geometri, Green et al. ^13). Således kan högre fältstyrka och högre frekvenser är rimliga för hög ledningsförmåga lösningar, inom vissa gränser ^10.

Men membranproteiner kommer sannolikt att vara oförenlig med den vanliga metoden för avsättning av lipider på elektroder för electroswelling förfarandet, nämligen i organiska lösningsmedel som sedan avdunstas att lämna en tunn lipidfilm. Det finns två huvudsakliga vägar runt detta problem: att införliva proteiner efter jätte liposombildning, eller för att anpassa hur lipider deponeras. Vår strategi bygger på andra ^5,11 att deponera lipider och utspädningentats membran protein tillsammans från en suspension av små eller stora "proteoliposomer". Vi beskriver den långa och mer utmanande process för framställning proteoliposomer från renat protein och lipider håll (Collins och Gordon, i recension). Här beskriver vi protokoll i avsaknad av något protein, men det är samma sak när proteinet är införlivad, inkluderar vi resultat som visar att proteoliposomer innehåller jonkanaler TRPV1 kan omvandlas till GUVs och används för patch-clamp elektrofysiologi. I varje electroformation tillvägagångssätt är visuell inspektion av lipiden provet under lipid avsättningsprocessen avgörande för framgång.

Vårt tillvägagångssätt kan vara relevant utanför specialiserad applikation till jonkanaler beredning. Under tiden sedan vi först utvecklade detta protokoll och nu har det också visat hur hur lipider avsätts på elektroderna för electroformation påverkar kompositionella heterogenitet de resulterande GUVs. Baykal-Caglar et al. ¹⁴ visade att GUVs bildade från noga dehydrerade liposomer hade en 2,5 gånger mindre variation i blandbarhet övergången temperatur GUVs bildade av blandningar av olika fosfolipider och kolesterol. Deras arbete visar att lipider, och särskilt kolesterol, kan orsaka fällningar från lipidblandningen när de avsätts från organiska lösningsmedel, vilket resulterar i stor rumslig variation i sammansättningen av det deponerade lipidfilmen. Detta är särskilt viktigt för studier av lipidmembran fasbeteende, men kan också vara kritiska för kvantitativa experiment på jonkanalfunktionen. Baykal-Caglar et al. 'S protokoll är liknande men inte identisk med vår egen, och läsarna uppmanas att studera det liksom.

Detta protokoll (se översikten, figur 1) är en av många som skulle kunna användas. I princip electroformation framgång beror på lipidblandningen, fukt, temperatur, andra lösta ämnen (speciellt joner), och avNaturligtvis spänning och frekvens som används i formation. Som electroformation förstås bättre, räknar vi med att förfina våra protokoll mer.

Slutligen, finns det ofta en brant inlärningskurva i elektroformning jätteliposomer. Vi föreslår behärska konventionella protokoll (§ § 1 och 4, och, om nödvändigt, § 5) innan att lära sig att sätta lipider från liposomala suspensioner (§ § 2-5).

Protocol

Ett. Deponering av lipider från organiska lösningsmedel: Klassisk protokoll

1. Ta bort lipider från lagring vid -20 ° C eller -80 ° C; varm till RT Varning:. Lipider är extremt hygroskopiska och många är känsliga för syre. Täck lipider i torr argon eller kvävgas och i alla steg minimera exponeringen för luft.
2. Om det behövs, upphäva lipider i kloroform eller cyklohexan vid 1-10 mg / ml, observera att tillverkarens angivna koncentrationerna är vanligtvis nominella endast VARNING: Använd lämpliga skyddshandskar och annan personlig skyddsutrustning vid användning av organiska lösningsmedel.. Ta PPE snabbt om lösningsmedel spills på dem, eftersom de flesta material är fortfarande släpper igenom dessa lösningsmedel och de bara ge tillfälligt skydd.
3. Rengör båda sidor av två 25 x 37,5 mm ITO belagda glasskivor med etanol
4. Blanda lipiderna för att uppnå de önskade molförhållanden. För varje 1 cm ² i arealen för ITO glider som skall beläggas med läppenid, blanda ~ 15-20 pg av lipider. Till exempel, om båda 25 x 37,5 mm diabilder skulle vara fullt belagd, skulle vi använder oftast 30 pl 10 mg / ml lipidblandning Obs. Tillsätt 0,1 mol% Texas Red-DPPE för fluorescerande avbildning, och se nedan för varningar om fluorescerande färgämnen.
5. Kontrollera att ITO belagda sidan av de glasskivor är vänd uppåt genom att mäta ytresistansen med en ohmmeter eller multimeter.
6. Sug lipiderna i ett lösningsmedel-resistenta spruta Varning:. Inga lim eller plast, andra än PTFE, bör kontakta organiska lösningsmedel.
7. Med sprutan nålen inte riktigt vidröra ITO yta, sakta applicera lipiden förflytta nålen fram och tillbaka över bilden. Täck ytan så jämnt, letar efter en "regnbåge glans" på glasytan.
8. Placera glasen snabbt under <1 Torr (1 mm Hg) vakuum under 0,5-1 h för att avlägsna alla spår lösningsmedel. Släpp vakuum med inert gas.
9. Applicera en silikonpackning, med entunt skikt av silikon vakuum fett på båda sidor. Lämna minst 5 mm av avtäckt bild exponerad vid ena änden av objektglaset.
10. Gå direkt till avsnitt 4.

2. Liten liposomberedningen för Controlled Dehydrering

1. Förbered lipidblandningen som i steg 1.1 till 1.4.
2. Torka lipiderna med användning av en ström av argon eller kväve gas i en 10 till 15 mm i diameter odlingsrör. För små mängder av lipider, ≤ 0,5 mg, kan den resulterande filmen hydratiseras direkt efter att placera den under vakuum under 0,5 till 1 h för att avlägsna kvarvarande lösningsmedel, fortsätt till steg 2,5. Större mängder av lipid tenderar att fånga organiska lösningsmedel i en tjock gel, även under vakuum, och är bättre förberedda genom lyofilisering: se steg 2,3-4.
3. Suspendera den torkade lipidfilmen i cyklohexan, lock med Argon och tätning med en propp, placera röret i en kalla blocket och frys vid -80 ° C under 1 timme minimum.
4. Placera det kalla blocket och lipid provet i ett vakuumsystemkan nå 100 mTorr. Applicera vakuum, det kommer "stall" vid ca 1 torr som lösningsmedel sublimeras off. När lösningsmedlet har försvunnit helt (~ 1 timme) vakuum kommer att sjunka under denna nivå. Släpp vakuum med inert gas och försegla röret eller hydrat omedelbart.
5. Medan lipider är under vakuum, Degas hydration buffert med vakuum och strilning ^15-17.
6. Hydrate lipider med avgasad buffert vid slutlig koncentration 1-10 mg / ml. Låt lipider att återfukta långsamt. Efter 30 min-1 timme, vortex för att bryta upp kvarvarande klumpar. Vänta ytterligare 0,5-1 timmar för att möjliggöra fullständig hydrering. Använd en osmoticant, såsom sorbitol eller sackaros upp till 200 mm, för att förhindra fullständig uttorkning i stegen nedan.
7. Förbered 100-200 liposomer nm diameter genom strängsprutning. Se tillverkarens extrudering protokoll för detaljer. Observera att bufferten måste ha mindre än ~ 25 mM jonstyrka, eller särskilda electroformation protokoll spänning kommer att behövas i avsnitt 4.

Tre.Deponering av lipider genom kontrollerad Uttorkning av små liposomer

1. Varning: Vår protokollet kräver lipider som ska placeras i ånga jämvikt med mättade saltlösningar för många timmar. Vi rekommenderar starkt att utföra protokollet i en inert gasatmosfär, med ett handskfack eller liknande kapsling.
2. Varning: Om att förbereda prover som innehåller proteiner, undvik fullständig uttorkning. Hydrate atmosfären i någon låda med en bägare med varmt vatten, eller en sonicator baserad luftfuktare. Använd en hygrometer för att säkerställa att det är minst 30% relativ fuktighet. Använd sorbitol eller sackaros i den lilla lipo bufferten som en ytterligare försiktighetsåtgärd för att förhindra total uttorkning.
3. Bered en mättad saltlösning av lämplig relativ fuktighet. Target fuktighet beror på osmolaritet vesikelberedning. För preparat med fysiologisk osmolaritet, använd 30-45% RH, medan låg osmolaritet vesikelberedningar kan vara tillräckligt uttorkad ijämvikt med 75 till 90% RH (Se även tabell 1).
4. Sätt den mättade saltlösningen och överskott av salt i en tätt förslutbar behållare med en inre hylla. Kommersiella matbehållare för yoghurt och granola fungerar mycket bra. Byt hyllan efter fyllning, och se till att vätskan är 5-10 mm under hyllan.
5. Rena ITO belagda diabilder som i avsnitt 1. Använd multimetern för att avgöra vilken sida som är ledande, och märka icke ledande sida med provet namn.
6. Smörj båda sidor av silikon (USP Grade VI) packning (s) med ett eller flera hål.
7. Placera objektglasen ledande uppåt på bänken, och tillämpa silikon packning (s) till varje bild som lipid kommer att tillämpas, vilket gör att det finns minst 5 mm av exponerad bild i ena änden för att ansluta till electroformation apparaten. Jämna packningen för att säkerställa en god tätning.
8. Späd vesikelberedning i en låg-salt isosmotisk buffert till ~ 1-2 mg / ml. Vi finner att högre concentrsamheten ger dåliga resultat.
9. Applicera lipid till bilden i 1-10 l droppar. Mindre droppar ger i allmänhet bättre resultat.
10. Placera bilden på insidan hyllan ovanför den mättade saltlösningen och försegla behållaren tätt. Lämna vid RT under 3 timmar till O / N. Behållaren kan placeras vid 4 ° C, men observera att för vissa salter, beror RH starkt på temperatur, och att kyla kommer att öka jämviktstid.
11. Den resulterande filmen kan ha en liten regnbåge glans till det, men i varje fall bör visas nästan uttorkat. Mycket osmotiska utgångslösningar kan vara omöjligt att torka helt till en lipid film, detta kommer inte påverka resultatet.

4. Electroformation av jätteliposomer

1. Lipid filmer, särskilt de bildade av dehydratiserade liposomer, är lätta att lossa. Genom att placera en 27 G sprutnål vid kanten av packningen och sakta applicera buffert försiktigt hydrat varje brunn. Buffertarinkluderar vatten, ≤ 200 mM sackaros, ≤ 1 M sorbitol och ≤ 5 mM HEPES. Mer än 10 mM saltlösning kan kräva alternativa protokoll electroformation spänning. Överfyll varje packning väl med ~ 10%.
2. Obs: när lipider är släckt, gå snabbt genom de återstående stegen, eftersom lipidfilmer börjar delaminerar omedelbart. Utbyte och storlek maximeras om electroformation börjar omgående.
3. I en mjuk rörelse tillämpa en andra ITO slide, konduktiv ansikte i, till toppen av packningen. Se till att ha minst 5 mm överhäng utanför packningen området och mittemot den första överhänget. Tryck försiktigt för att säkerställa en god tätning.
4. Rengör de två överhäng med etanol och kontrollera att sidor inför packningen är ledande med din multimeter.
5. Kammaren kan ytterligare säkras med parafilm eller lätt spänning klipp våren om så önskas.
6. Anslut electroformation kammaren till en spänningskälla genom att säkra aluminium eller koppar barer, "EMI gasket skum ", eller ledande tejp med de ledande ytorna hos de två bilderna. Vi använder EMI-packning skum. Planer för en jigg och klämma visas i figur 5.
7. Kontrollera att det inte finns någon elektrisk kortslutning mellan kontakterna, och att kontakterna ansluter korrekt till ITO-ytor, med hjälp av multimetern.
8. Värm kammaren 10 ° C över den högsta smälttemperaturen för något av lipiderna närvarande, t.ex. för DPPC, upphetta till 52 ° C minimum, 10 ° C över kedjan smälttemperatur av 42 ° C.
9. För låg salthalt buffertar, tillämpa en 10 Hz sinusvåg, ~ 0,7 V _rms för varje millimeter mellanrummet mellan de två ITO belagda ytorna, för 60-90 min. För höga salt buffertar bör andra spänning protokoll användas (se referenser).

Fem. Imaging och felsökning

1. Bild liposomen med ett inverterat mikroskop utrustat med ett filter kub för rodamin eller Texas Red färgämnen. Liposomen bör vara sfäriska,övervägande unilamellär med ögat, och fri från defekter som "strängar" hängande utanför liposomen.
2. Om liposomerna är för små, använda mindre lipid.
3. Om det finns många brister eller några liposomer, kan detta bero på gel-fas lipider. Överväg att höja electroformation temperaturen.
4. Om få eller inga jätteliposomer bildas alls från dehydratiserade små liposomer, minska det osmotiska styrkan av liposom buffert, eller öka den osmotiska styrka electroformation buffert. En PLÖTSLIG av buffert i det koncentrerade interstitiell buffertlösningen kan orsaka delaminering av den deponerade lipidfilmen.
5. Om vesikler avkastning, kvalitet eller storlek är dålig, och du ingår salter eller pH-buffertar i electroformation eller liposom buffertar, överväga alternativa protokoll electroformation spänning. Till exempel, Pott, et al. ^11, rekommenderar en tre steg protokollet använder en 500 Hz sinusvåg, höja spänningen från 50-1,300 Vpp / m under 30 min, innehav under 90 min, denn minskar frekvensen till 50 Hz under 30-60 min. Platina eller titan elektroder kan behövas i det här fallet, men det kommer inte väsentligt förändrar protokollet.

Representative Results

I våra exempel, förbereder vi liposomer från en blandning av cirka 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfokolin), 15 mol-% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-fosfoserin , 30 mol% kolesterol, och 0,1 mol% Texas Red-märkt 1,2-dipalmitoyl-sn-fosfoetanolamin (TxR-DPPE). Denna komposition valdes som approximativt representerar dorsala lipider rotganglion ^18. Vi noterar att 15 mol% laddad lipid (här POPs) är nära gränsen för vad som kan användas i electroformation (t.ex. Walde et al. ^4).

Lipid uppdelning genom hydrolys och peroxidering är en särskilt viktig fråga för många lipidblandningar och många känsliga experiment (se diskussion). För tydlighets skull ensam, använder vi inte inert gasatmosfär i videopresentation. Som framgår av nedanstående siffror, innebär detta inte märkbart påverka kvaliteten av liposomerna, men för känsliga studier ellernär man använder mycket omättade lipider är det viktigt att förhindra lipid uppdelning.

Eftersom det stora hindret i electroformation är att bilda en bra lipidfilm på indium-tennoxid (ITO) substrat, att veta vad lipidfilmen ska se ut när torkade är avgörande. Men när electroformation misslyckas, gör det ofta så fullständigt, vilket resulterar i ingen märkbar jätte lipo produktion. Ofta kommer betydande detritus observeras, vilket normalt tyder på att för mycket fett har använts. Våra siffror visar vad man förväntar sig att se på framgång.

Figur 2 visar två olika fläckar av liposomer elektroformas från lipider deponerade ut ur kloroform. I den vänstra panelen, noga undersöka de patchar som anges av pilarna 2 och 3. Medan pil 2 visar en lapp med dåligt urskiljbara liposomer, kan inga liposomer bringas i fokus i området anges av pilen 3. Tillsammans utgör dessa fynd tyder på en allmänt dåligberedning, förmodligen på grund av att det finns för mycket lipid deponeras i detta område. I den högra panelen, sådana "luddiga" regioner är mindre vanliga, vilket indikerar en generellt bättre förberedelser. Vi tycker att det är sällsynt att helt eliminera sådana brister.

Figur 3 visar liposomer framgångsrikt elektroformas från lipider deponerats av uttorkning av små liposomer, vid två förstoringar, avbildas med Texas Red epifluorescens. Liposomer är gles, men det finns flera bra exemplar. Eftersom storlek varierar, flera är ur fokus. Pilarna visar tre bra kvalitet liposomer varierar i storlek från ~ 5-20 um, varav två visas i 40x förstoring bilden. Notera den tydliga "ringen" vid kanten: detta indikerar en unilamellär eller nästan unilamellär liposom. Medan vissa fläckar av lipid tycks ha kollapsat eller aldrig bildade lipid, är detta en god kvalitet resultat.

Slutligen, vårt syfte att utveckla och publicera detta protokollär att förbereda GUVs med intakta, funktionella däggdjurs jonkanaler som är lämpliga för konventionell patch-clamp elektrofysiologi. I figur 4 visar vi capsaicin-aktiverade TRPV1 jonströmmar spelats fläckvis lipidmembranet ut från GUVs bildade användning av detta protokoll. Strömmen kan blockeras av Ruthenium Red, och är inte aktiveras av capsaicin vehikel (0,1% etanol, 138 mM NaCl, 3 mM HEPES pH 7,4) ensam. Framställningen av proteoliposomer för elektrofysiologi experiment är långt utanför ramen för det nuvarande protokollet, men är föremål för en in artikeln.

Salt	Molality @ 20 ° C och mättnad	% RH vid 10 ° C	% RH vid 20 ° C	% RH vid 30 ° C
Magnesiumkloridhexahydrat	5,8	33	33 32
Kaliumkarbonatextraktion Dihydrat	8,0	47	44	42
Natriumbromid	4,6	58	57	57
Kopparklorid	5,6	68	68	67
NATRIUMKLORID	6,13	75	75	75
Kaliumklorid	4,61	87	86	84

Tabell 1. Relativ fuktighet (% RH) av flera vanliga salter Relativ fuktighet data från Greenspan ¹⁹ och Rockland ^20,. Mättnadsdata från International Kritiska tabellerna ^21.

Figur 1. Schematisk jätte lipo electroformation från små liposomer. (Överst till vänster) Små liposomer avsätts i en samling av små droppar, <5 pl. (Top centrum) Liposomerna är uttorkad under kontrollerad relativ fuktighet genom att placera dem i en sluten behållare ovanför en mättad saltlösning. En hygrometer är valfri. (Överst till höger) När uttorkad till en klibbig film av lipid och (eventuellt) osmoticant såsom sorbitol, är lipider återhydratiseras i en hyperosmotisk buffert (se protokoll avsnitt 5). (Nedre vänstra) den electroformation kammaren förseglas med en andra ITO glida ovanpå. (Nedre högra) Slutligen kammaren upphettas över lipid kedjan smälttemperatur, och ansluten till en signalkälla som ger en oscillerande elektriskt fält över de två ITO diabilder.

Figur 3. Elektroformat jätteliposomer bildas från uttorkning-deponerade lipider. (Vänster) vid 10x förstoring, flera liposomer är synliga. Tre liposomer är märkta. (Höger) Samma vy som till vänster, vid 40x förstoring, med sammaliposomer (2 och 3) märkt. Antalet av dessa liposomer är typiskt mycket mindre än när elektroformning från lösningsmedel-deponerade lipid, men är helt tillräckliga för många ändamål. Avbildas med ett inverterat epifluorescensmikroskop utrustat med en Chroma 41004 Texas Red filter kub och Stanford Photonics XR/MEGA-10 S30 intensifierad CCD-kamera.

Figur 4. Capsaicin aktiverade TRPV1 ström som registreras i ett membran patch ut från en GUV bildade användning av detta protokoll. A. läckström indikerade en 500 MQ försegla motstånd innan capsaicin tillsattes. B. Saturating capsaicin (> 20 ^ M, i 0,1% etanol) aktiverar en stora TRPV1 aktuella,. strömmen blockeras av Ruthenium Red, och är inte aktiveras av vehikel (0,1% etanol i buffert) ensam (data ej visade) C. De nuvarande avkastningtill nära baslinjen som capsaicin tvättas ur plåstret.

Figur 5. Planer för electroformation kammare. Inkluderat är en översikt, som visar den kompletta enheter, och dimensionerade scheman för de övre och nedre plastbitar. Använd akryl eller annan lätt bearbetad klar plast. Den tunna Kapton filmupphettaren bör anslutas till temperaturregulator (se tabell av särskilda reagenser och utrustning), och EMI packning skum bör anslutas till funktionen generatorn, så att sinusvågsignalen läggs över de två ITO belagda objektglas. Ett hål är anordnat för en temperatursond. Flathead 10-32 skruvar är placerade i de försänkta hålen i underdelen, och passera genom det övre stycket. 10-32 muttrar används för att säkra monteringen. När fullständigt sominte sammansatta, ska de övre och nedre plastbitar vara i jämnhöjd med varandra på två sidor (sidorna parallellt med EMI-packning.) Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Electroformation av jätteliposomer har utvecklats till en flexibel teknik som är kompatibel med olika lipider, preparat, och buffertar. Noggrann kontroll av lipiden deponeringsprocessen är mest avgörande för framgång. Vi har lagt fram enkla verktyg för att göra kontrollerad avsättning av lipider från små liposomberedningar en okomplicerad process. Den relativa fuktigheten är kritisk för korrekt dehydratisering av de ursprungliga liposomer och det optimala värdet kommer att variera med den initiala koncentrationen av lösta ämnen i liposomsuspensionen. Lägre relativ luftfuktighet krävs för att torka mer koncentrerade prover till en lämplig nivå.

Den exakta hydrering protokoll och elektriska fält används för electroformation fortfarande ett ämne för diskussion ^{1,4,7,10,11,22.} De enklaste protokoll skall behärskas först innan lipo electroformation i närvaro av höga salthalter, laddade lipider, eller mycket höga halter av hög smältratur lipider. När dessa färdigheter behärskas, mer avancerade protokoll dela typiskt electroformation processen i tre delar: inledande svullnad, tillväxt, och lossnar. Initial svallning verkar vara gynnad av långsamt ökande det applicerade elektriska fältet ^11. En andra, valfri scenen hos fast fältstyrka kan hjälpa till att kontrollera den slutliga storleken av liposomerna. Slutligen kan minska frekvensen för den oscillerande fältet hjälper till att lösgöra liposomer från ITO ytan. Högre frekvenser behövs för att elektroformen liposomer i fysiologiska saltbetingelser ^11, men liposomer kan bildas över ett extremt brett område av fältet frekvenser och amplituder ^10.

Observationen att jätteliposomer bildas spontant vid rehydrering av torkad liposomer med en hypoosmotisk buffert ⁷ anger flera nycklar till framgång. Först börjar liposomen svullnad processen omedelbart, så att för electroformation, vissagrupper har även funnit det lämpligt att tillämpa AC elektriska fältet innan rehydrating lipidfilmen ^10. Det andra är det troligt att fluidflöde driver den liposomala svullnad processen, och att electroformation sker åtminstone delvis på grund av elektro-osmotiskt driven flöde. Detta anges gränser för de användbara frekvensen och amplituden intervall som kan användas i electroformation ^10.

En viktig punkt i diskussionen under de senaste åren har varit risken för lipid hydrolys och peroxidering ^23,24. Den första försvar mot lipid nedbrytning av något slag är att ta bort syre från alla material som används i GUV preparatet: Eftersom peroxidering beror på molekylärt syre ^23, bör detta bromsa processen avsevärt. En kombination av vakuum och spolning med inert gas skall användas för att avlägsna så mycket syre som möjligt ^15-17. Ultraljudsbehandling och lätta vakuum är ineffektiva. Vi använder ett kit syre test (Chemetrics K7501) till vONTROLLERA att vi har tagit bort syret så grundligt som möjligt. Hydrolys är mer ondskefull, men reduceras genom att upprätthålla neutralt pH ^25, och genom att minska den spänning som används i electroformation ^24. Vissa författare förespråkar användning av titanelektroder i stället för ITO glider ^23,24,26,27. Vi föredrar att undvika risken för kontaminering våra prover med titan (eller någon metall), eftersom det tidigare har varit kända för att störa lipo experiment ^28,29, men det kan hjälpa till att förhindra att vissa peroxidering eller hydrolys effekter. Det är självklart att långvarig exponering för höga temperaturer påskyndar lipid fördelning ^30. Slutligen tunnskiktskromatografi ^24,31, kolorimetriska analyser ^23, och andra metoder ³¹ finns för att kvantifiera lipid nedbrytning.

En liknande fråga gäller de fluorescerande lipid färgämnen som används för att avbilda GUVs, särskilt för studier av lateral fasseparation ^30,32 30,33, och används vid minimal koncentration.

Vi är inte medvetna om någon enighet om huruvida ITO elektroder bilderna kan återanvändas. Många grupper gör återanvända sina ITO diabilder, medan vissa inte. Senaste arbete tyder på att bilderna gör försämras över tiden, men kan glödgas för att återfå högpresterande ^34, denna nedbrytning hade endast en liten effekt för lipidblandningar inklusive zwitterjoniska eller anjoniska lipider, men var kritisk för blandningar som innehåller katjoniska lipider. Vi återanvänder våra bilder utan glödgning.

Även om det är stor variation i de protokoll som används för att elektroformen jätteliposomer, den teoretiska förståelse och praktisk erfarenhet med tekniken förbättras ständigt. Redan liposomer kan bildas med stora mängder av laddade lipider, eller i höga salt buffertar. Nyckeln fortfarande är effektivt avsättning av lipiderna på elektrodytan, which är kärnan i våra protokoll.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667