Summary
Ein Mausmodell von kutanen Wundheilung, die zur therapeutischen Verbindungen in physiologischen und pathophysiologischen Einstellungen beurteilen kann.
Abstract
Wundheilung und Reparatur sind die komplexesten biologischen Prozesse, die im menschlichen Leben auftreten. Nach einer Verletzung, werden mehrere biologische Pfade aktiviert. Wundheilungsstörungen, die bei Diabetes-Patienten zum Beispiel auftritt, kann zu schweren ungünstigen Ergebnisse wie Amputation führen. Es besteht daher ein zunehmender Impulse neuen Substanzen, die die Wundheilung fördern, zu entwickeln. Die Prüfung dieser hat Großtiermodellen wie Schweine, die oft unpraktisch beschränkt. Mäuse sind die ideale präklinischen Modell, da sie wirtschaftlich und zugänglich genetische Manipulation, die für mechanistische Untersuchung erlaubt sind. Allerdings Wundheilung in einer Maus unterscheidet sich grundlegend von dem des Menschen, wie es geschieht primär durch Kontraktion. Unsere Mausmodell überwindet diese durch den Einbau einer Schiene um die Wunde. Durch Schienung die Wunde, ist die Reparatur dann abhängig von Epithelisierung, Zellproliferation und Angiogenese, die eng spiegeln diebiologische Prozesse der menschlichen Wundheilung. Während erfordern Konsistenz und Pflege, bedeutet das Mausmodell nicht mit komplizierten chirurgischen Techniken und erlaubt die robuste Prüfung vielversprechende Wirkstoffe, zum Beispiel die Angiogenese fördern oder hemmen Entzündungen. Weiterhin wirkt jede Maus als seine eigene Kontrolle als zwei Wunden bereit sind, so dass die Anwendung sowohl der Testverbindung und der Fahrzeugsteuerung am selben Tier. Abschließend zeigen wir eine praktische, einfach zu erlernen und robustes Modell der Wundheilung, die vergleichbar mit der des Menschen ist.
Introduction
Wundheilungsstörungen ist verantwortlich für erheblichen Morbidität und Mortalität weltweit, dies gilt vor allem für Patienten mit Diabetes mellitus 1,2. Beim Menschen ist die Wundheilung ein Kontinuum von Prozessen, in denen es erhebliche Überschneidungen 3. Unmittelbar nach der Verwundung, entzündliche Prozesse initiiert werden. Entzündungszellen freizugeben Faktoren, die die Prozesse der Zellproliferation, Migration und Angiogenese zu fördern. Nach Reepithelisierung und neuem Gewebe gibt es eine Phase der Umgestaltung, die sowohl Apoptose und Neuorganisation der Matrixproteine wie Kollagen bringt.
Die Komplexität der Wundheilung können derzeit nicht in vitro repliziert werden, und dies erfordert die Verwendung von Tiermodellen. Bisher wurden Wundheilung Studien Großtiermodellen, wie Schweine beschränkt, um sicherzustellen, dass die Heilungsprozesse gleichwertig und vergleichbar Menschen. Allerdings mit großen animals für solche Studien kann schwierig sein, zu Haus und sind nicht immer praktisch 4. Das Labor Maus stellt eine kostengünstige Tiermodell die leicht genetisch für mechanistische Untersuchungen 5-7 manipuliert werden. Allerdings murinen Wunden heilen anders für die menschliche, vor allem auf den Prozess der Kontraktion 8. Dies ist zum Teil aufgrund einer umfangreichen subkutane quergestreiften Muskulatur Schicht genannt Panniculus carnosus, die weitgehend abwesend in den Menschen ist. Bei Mäusen, ermöglicht diese Muskelschicht der Haut, sich unabhängig von den tieferen Muskeln bewegen und ist verantwortlich für die schnelle Kontraktion der Haut folgende Verwundung.
Um diese Einschränkung zu überwinden, können murine Wundheilung geeignet ist, menschliche Wundheilung durch Verwendung einer Schiene (1) 8,9 replizieren. In diesem Video zeigen wir die Wunde splinted murinen Modell, das Wundkontraktion eliminiert und mehr annähert die menschlichen Prozesse der Re-epithelialization und neuem Gewebe. In diesem Modell zwei voller Dicke Resektionen, die die panniculus carnosus enthalten, werden auf dem Rücken, einen auf jeder Seite der Mittellinie der Maus erzeugt. Ein Silikon-Schiene wird um die Wunde mit Hilfe von Klebstoff angebracht und die Schiene dann mit unterbrochenen Nähten befestigt. Jede Maus dient als seine eigene Kontrolle, mit einer Wunde, die Behandlung und die andere Fahrzeug-Steuerung, wodurch der Anzahl der Tiere. Nach topischer Anwendung wird eine transparente Okklusivverband aufgebracht. Der Verband kann entfernt werden, wenn weitere topische Anwendungen und / oder Messung der Wundfläche 10,11 erforderlich. Bei Beendigung von Experimenten Wundverschluss morphologischen Architektur und der Grad der Gefäßneubildung durch Immunhistochemie untersucht werden. Diese kostengünstige und einfach zu Modell ausführen, können auch verwendet werden, um die Wundheilung im Rahmen von Diabetes mellitus oder anderen pathophysiologies beurteilen.
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Protocol
1. Herstellung von Schienen und Okklusivverbänden
- Gliederung 10 mm Kreise auf 0,5 mm dicken Silikon-Folien und Verwendung einer Schere oder einem Biopsiestanze zu Silikon Festplatten erstellen.
- Center ein 5 mm Biopsiestanze in der Mitte des 10 mm Kreis und drücken Sie sie fest, um ein Loch, um einen "Donut"-ähnliche Scheibe, die wie eine Schiene verwendet werden Formular zu erstellen.
- Gliederung 10 mm Kreise auf einem transparenten Okklusivverband wie Opsite und mit einer Schere kreisförmigen Dressings erstellen.
2. Versuchstiere
- Erhalten Tier Ethikkommission Zulassung für alle Experimente, die ausgeführt werden.
- Mit 8 Wochen alt (22-26 Gramm) männlich C57BL/6J-Mäusen von einem kommerziellen Züchter (zB The Jackson Laboratories).
- Halten Mäuse in Standard-Bedingungen von 21 ° C und eine 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
- (Optional): Diabetes kann in 6 bis 7 Wochen alten Mäusen durch einen Bolus intraperitoneale inje induziert werdenktion von 165 mg / kg Streptozotocin (in Citratpuffer, pH 4,5), die mit Hyperglykämie durch regelmäßige Blutzuckermessung (AccuChek glucometer) bestätigt. Diabetische Mäuse haben Polyurie und so ihr Bettzeug müssen öfter gewechselt werden, um Feuchtigkeit zu beseitigen und ihre Gewichte sollten engmaschig überwacht werden.
3. Anästhesie und Operative Vorbereitung
- Induce Vollnarkose mit Isofluran 5% in 100% Sauerstoff (Flussrate 1 L / min) und Aufrechterhaltung einer Narkose mit 1-3% Isofluran.
- Sicherstellen, dass die tiefe Pedal Reflexe der Maus werden unterdrückt und platzieren Sie den Mauszeiger in der Bauchlage.
- Bereiten Sie den operativen Bereich durch Entfernen Fell mit Schermaschinen von der Basis des Halses zu 3 cm weiter nach unten den Rücken und zwischen den beiden Schulterblättern.
- Eine leichte Anwendung der Enthaarungscreme kann nicht länger als 2 min angewendet werden. Wet Mullkompressen kann verwendet werden, um alle zu gewährleisten und Sahne restlichen Fell entfernt wird.
- Wischen Sie die Haut mit einemAlkoholtupfer und zwei Anwendungen von 10% PVP-Jod (Betadine) und drapieren die Maus.
4. Exzision und Schienung Wound
- Schematische Darstellung des murinen Wundheilung Modell ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Verwenden Sie eine sterile 4 mm Biopsiestanze zwei kreisförmige Muster für die Wunde auf beiden Seiten der Maus die Mittellinie auf der Höhe der Schultern skizzieren (siehe Abbildungen 2a und 2b).
- Verwenden gezackten Zange, um die Haut in der Mitte der Umriss und Iris Schere, um ein Full-Dicke Wunde, die durch das subkutane Gewebe (Abb. 2c bis 2d), einschließlich der Panniculus carnosus (Abbildung 2e) erstreckt erstellen heben, und Verbrauchsteuern die kreisförmiges Stück Gewebe.
- Wiederholen des Prozesses für die Wunde auf der anderen Seite der Mittellinie (Fig. 2f).
- Entfernen Kunststoff-Schutzschicht überzogen von jeder Seite des Silikons Schiene.
- Bewerben cyanoacrylate Klebstoff (zB Sekundenkleber oder Krazy Glue) auf der einen Seite aus einem Silikon-Schiene.
- Center die Schiene über der Wunde (Abbildung 2g) und Anker die Schiene mit unterbrochenen 6-0 Nylonnaht die Positionierung (Abbildung 2h) zu gewährleisten.
- Wiederholen Sie den Vorgang auf der Schienung andere Wunde.
- Wenn zu dieser Zeit erforderlich sein sollte, gelten die therapeutische Verbindung, die getestet werden (bis zu 100 ul) einer Wunde (2i) und dem Fahrzeug an die andere.
- Decken Sie die Wunde mit einer transparenten Okklusivverband (z. B. OpSite) (2j-2k).
- Ein Lineal ist unter den Schienen gelegt und eine mikroskopische Aufnahme gemacht (Abb. 2l).
6. Postoperative Behandlung
- Carprofen (5 mg / kg) einmal täglich über subkutane Injektion für post-operative Schmerzlinderung verabreicht.
- Nach der Operation Tiere werden einzeln in Käfigen gehalten und auf Wärme mats bis vollständig erholt.
- Überwachen Tiere zweimal täglich für Manifestationen von Schmerzen und Gewichtsverlust. Wir beobachteten keine groben Verhaltens Displays von Schmerzen oder Gewichtsverlust.
7. Wound Messung und Behandlung
- Die Wunde kann täglich gemessen werden.
- Induce Vollnarkose mit 5% Isofluran-Gas (Flussrate 1 L / min), und dann sicherstellen, dass die tiefen sensorischen Reflexe der Maus unterdrückt werden mit 1-3% Isofluran.
- Vorsichtig schälen die Okklusivverband mit einer Pinzette.
- Verwenden chirurgischen Bremssättel, um die Wunde Durchmesser messen. Wir nehmen den Mittelwert aus drei Messungen entlang der X-, Y-und Z-Achse (Abb. 2m-2o) sowie eine Mikrofotografie für zukünftige Referenz (Abbildung 2p).
- Optional: Zu diesem Zeitpunkt kann das Tier für Durchblutung mittels Laser Doppler Imager (Abbildung 2q) beurteilt werden.
- Re-Anwendung der therapeutischen Verbindung und der Fahrzeugsteuerung kann Leistung seinmed. an dieser Stelle.
- Eine saubere transparent Okklusivverband wird dann neu aufgetragen und die Tiere warm gehalten, bis sie vollständig erholt.
- Hinweis: Wenn Schienen nicht ordnungsgemäß gesichert, die Wunde wird leicht schrumpfen (Abbildung 2r).
8. Die histologische Analyse
- Euthanize die Mäuse nach 10 Tagen mit einer Überdosis Narkose.
- Mit einer Pinzette und einem Skalpell entfernen Sie die Nähte und vorsichtig abziehen der Schiene.
- Verwenden Irisschere eine breite durchgehende Exzision um und unter der Wunde zu schaffen und Inkubieren des Gewebes in 4% Paraformaldehyd in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° C über Nacht.
- Übertragen Gewebe bis 17% Saccharose in PBS-Lösung für weitere 24 Stunden bei 4 ° C und entfernen Sie überschüssige Lösung durch Abtupfen sorgfältig auf das Gewebe und in OCT-Verbindung und frieren bei -80 ° C.
- Hämatoxylin und Eosin-Färbung kann die gewickelte Struktur und Epithelzellen Spalt zu visualisieren. Neovascularisation durch immunhistochemische Analysen überprüft werden, um die Anzahl der Kapillaren (mit von Willebrand-Faktor) zu bestimmen.
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Representative Results
(Tag 0 Durchmesser / Tag x Durchmesser) - Wundverschlusssystem Kurve durch Berechnung des durchschnittlichen Durchmessers der gewickelten und Exprimieren der Ergebnisse in Prozent, also 100 bestimmt. In diesem Experiment wurde eine therapeutische Verbindung (oder MFK) wurde täglich auf die Wunde aufgetragen. Die therapeutische Verbindung stark beschleunigte Wundheilung (Abbildung 3). Es ist wichtig zu beachten, dass die Schienen für die Dauer des Experiments muss beibehalten werden, das Entfernen von Schienen, um eine schnelle Wundkontraktion (Abbildung 2r) führen wird und divergieren von dem Muster der Wundheilung beim Menschen beobachtet.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des murinen Wundheilung Modell. In diesem Modell zwei Vollhautwunden auf ei erstelltther Seiten der Mittellinie so dass jede Maus als ihre eigene Kontrolle dienen. Silikon-Schienen eingehalten werden und auf die Wunde Umfang zu Wundkontraktion verhindern vernäht, wobei sie ein Modell replizierbar dem des Menschen.
Abbildung 2. Wundheilung Operation und postoperativen Messungen. Nach Haarentfernung und Vorbereitung der Haut mit Jod und Alkohol (ab) ein Biopsiestanze wird sanft verwendet, um zwei Kreise auf dem Rücken umreißen, auf jeder Seite der Mittellinie. (C) Ein kleiner Schnitt Dann erstellt und (d) ein kreisförmiges Stück Haut entfernt wird, (e), einschließlich der panniculosus carnosus, (f) zu zwei tiefen Wunden, zu erstellen. (g) Haftmittel wird dann auf die silic angewendet eine Schienen und die Schienen an der Wunde Umfang eingehalten werden. (h) Schienen werden dann mit Nähten befestigt ist. (i) Behandlung topisch appliziert und (jk) eine okklusive, transparente Verband über der Wunde gelegt und an die Schienen (Klebstoff bei Bedarf verwendet werden.) (l) Mikrophotographien getroffen werden täglich Wundbereich von dem Mittelwert aus drei Messungen der Durchmesser (m) y-Achse (n) x-Achse und (o) z-Achse berechnet. (p ) Ein Vertreter Foto von den Wunden am Tag 10, unter Hinweis auf die kleineren Wunde auf der rechten Seite, die mit einer therapeutischen Verbindung behandelt wurde. (q) Vertreter Laser-Doppler-Bild der Durchblutung der Wunde am Tag 6. (r) Beispiel für schnelle Wunde Kontraktion nach dem Entfernen des Silikon Schienen.
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Abbildung 3. Repräsentative Wundverschluss Graphen. Wundbereich von dem Mittelwert aus drei Messungen pro Tag Durchmesser entlang der x-, y-und z-Achse berechnet. Wundverschluss wird als Prozentsatz der ursprünglichen Wundbereich am Tag 0 ausgedrückt.
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Discussion
Dies ist eine experimentelle Mausmodell der kutanen Wundheilung. Ein wesentliches Merkmal dieses Modells ist die Verwendung von Silikon-Schienen gewickelt Kontraktion zu verhindern, so dass Reepithelisierung und neuem Gewebe auftreten, so dass es ähnlich zu dem Verfahren, das in Menschen auftritt. Dieses Modell ist vielseitig und kann verwendet werden, um die Wundheilung bei sowohl physiologische und pathophysiologische (zB Diabetes mellitus) Einstellungen zu bewerten. Das Modell kann auch verwendet werden, um potentielle Wundheilung oder Angiogenese Therapeutika auf wirtschaftliche Einstellung herangezogen werden. Mit jeder Maus als seine eigene Kontrolle, sind Tierzahlen minimiert. Die chirurgischen Techniken für dieses Modell benötigt nicht sehr anspruchsvoll, damit dieses Modell weit kann von denjenigen mit relativ wenig chirurgische Erfahrung verwendet werden.
Um die Reproduzierbarkeit und genaue Quantifizierung zu gewährleisten ist es wichtig, dass die Schiene ausreichend anhaftet und verankert, die Haut mit Fäden, und daß thier ist minimaler Verzögerung zwischen der Erstellung der beiden Wunden. Die Neigung der Maus Wunden schnell zusammenziehen folgende Lockerung der Schiene oder teilweise Entfernung durch Kratzen durch die Maus tägliche Überwachung der Schienen benötigt. Sorgfältige Auftragen von Klebstoff ist auch erforderlich, um Irritationen der gesunden Haut rund um die Schiene zu fördern, die kratzen kann, zu minimieren. Es ist auch sehr wichtig, aseptische Techniken folgen und gründlich desinfizieren Ausrüstung, insbesondere die Bremssättel, zwischen Mäusen. Die Anwendung des Okklusivverband muss auch berücksichtigt werden, vor allem, wenn Wunden nicht gehen, um behandelt oder zugerichteten täglich. Opsite und Tegaderm (3M) Dressings sind vergleichbar 12, und es hat sich gezeigt, dass nur Tegaderm Dressings können 1-2 Tage haften bleiben. Sollte längerfristigen Wundauflagen erforderlich ein alternativer Ansatz von Chung und Kollegen 13 beschrieben worden ist.
Mögliche Schwachstellen dieses Modells können die Entzündung d UE zum Verankern von Nähten, die Diffusion der Behandlung oder ein Fahrzeug Wunden und dem Eintritt der Behandlung in die systemische Zirkulation. In Bezug auf die Nähte Induzieren lokaler Entzündung, werden die Fäden relativ weit entfernt von der Wunde platziert und wie jeder Wunde dieselbe daher keine Entzündung, die auftreten sollte ähnlich zwischen Wunden erstellt. Ebenso würde der Abstand zwischen den Wunden und fehlende Ödem zwischen den Wunden minimiert Diffusion zwischen den beiden Betten. Es gibt einige Hinweise, dass eine Behandlung kann die systemische Zirkulation, die beschleunigen die Heilung der Steuerung gewickelt 9,10 eintreten kann. Um das Ausmaß der Behandlung in die systemische Zirkulation zu bestimmen, könnte littermate Mäuse verwendet werden, in denen die beiden Wunden nur mit dem Vehikel behandelt. Die Unterschiede in den Raten der Wundverschluss zwischen Mäusen mit Vehikel nur, und die Mäuse, die sowohl Fahrzeug und Behandlung könnte dann verglichen werden.
"> Zusammenfassend haben wir eine relativ einfache Mausmodell der Wundheilung, die viele der Funktionen im menschlichen Wundheilung beobachtet weist demonstriert.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich finanzielle Unterstützung aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC) von Australien (Projektstipendium ID: 632512) bestätigt. Louise Dunn wurde durch eine NHMRC Early Career Fellowship und Christina Bursill von einem National Heart Foundation Career Development Fellowship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
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