Summary
Um modelo murino de cicatrização de feridas cutâneas que podem ser utilizados para avaliar compostos terapêuticos em contextos fisiológicos e patológicos.
Abstract
A cicatrização de feridas e reparação são os processos biológicos mais complexas que ocorrem na vida humana. Após lesão, múltiplos caminhos biológicos se tornam ativadas. Cicatrização de feridas prejudicada, o que ocorre em pacientes diabéticos, por exemplo, pode levar a resultados desfavoráveis graves, como amputação. Existe, portanto, um impulso crescente de desenvolver novos agentes que promovem a cicatrização de feridas. O teste destes foi limitado a grandes modelos animais, tais como porcos, os quais são muitas vezes impraticável. Ratos representam o modelo pré-clínico ideal, uma vez que são económicos e passíveis de manipulação genética, a qual permite uma investigação mecanicista. No entanto, a cicatrização de feridas num ratinho é fundamentalmente diferente da dos seres humanos, uma vez que ocorre primeiramente através de contração. O nosso modelo murino supera esta incorporando uma tala em torno da ferida. Por imobilização da ferida, o processo de reparação é, então, dependentes de epitelização, proliferação celular e angiogênese, que de perto espelhar aprocessos biológicos de cicatrização de feridas humanas. Embora requerendo consistência e cuidado, este modelo murino não envolvem técnicas cirúrgicas complicadas e permite o teste de agentes promissores robusta que pode, por exemplo, promover a angiogénese ou inibir a inflamação. Além disso, cada rato actua como o seu próprio controlo de duas feridas são preparados, possibilitando a aplicação de tanto o composto de teste e o veículo de controlo no mesmo animal. Em conclusão, foi demonstrado um modelo prático, fácil de aprender e robusta de cicatrização da ferida, o que é comparável com a dos seres humanos.
Introduction
Cicatrização de feridas prejudicada é responsável pela morbidade e mortalidade em todo o mundo significativo, isto é particularmente verdadeiro para pessoas que sofrem de diabetes mellitus 1,2. Nos seres humanos, a cicatrização de feridas é um processo contínuo de processos, em que há sobreposição significativa 3. Imediatamente seguintes processos ferindo, inflamatórias são iniciadas. As células inflamatórias liberam fatores que incentivam os processos de proliferação celular, migração e angiogênese. Depois de re-epitelização e formação de tecido novo, há uma fase de remodelação, que implica tanto a apoptose ea re-organização das proteínas da matriz, como o colágeno.
A complexidade da cicatrização da ferida não pode actualmente ser replicado in vitro, e isto requer o uso de modelos animais. Até à data, os estudos de cicatrização de feridas têm-se limitado a modelos grandes animais, tais como porcos, para assegurar que os processos de cura são equivalentes e comparáveis aos seres humanos. No entanto, usando o grande animals de tais estudos pode ser difícil para a casa e nem sempre são 4 prático. O rato de laboratório representa um modelo animal económico que pode ser facilmente manipulado geneticamente para investigação mecanicista 5-7. No entanto, as feridas cicatrizar murino diferente ao ser humano, principalmente devido ao processo de contracção 8. Isto é, em parte, devido a uma grande camada de músculo estriado subcutânea chamado o panículo carnoso que é praticamente ausente em humanos. Em ratinhos, esta camada muscular permite que a pele se mover independentemente dos músculos profundos e é responsável pela rápida contracção da pele a seguir ferimento.
Para superar esta limitação, a cicatrização de feridas de murino pode ser adaptado para replicar a cicatrização de feridas humana por utilização de uma tala (Figura 1) 8,9. Neste vídeo demonstramos o modelo murino ferida splinted que elimina a contração da ferida e mais se aproxima dos processos humanos de re-epithelialização e formação de tecido novo. Neste modelo, duas excisões de espessura total, que incluem o panículo carnoso são criadas no dorso, uma em cada lado da linha média do rato. A tala de silicone é colocado em torno da ferida, com o auxílio de adesivo e, em seguida, a tala protegido com suturas interrompidas. Cada rato actua como o seu próprio controlo, com uma ferida a receber tratamento e do outro veículo de controlo, reduzindo assim o número de animais. Após aplicações tópicas, um curativo oclusivo transparente é aplicada. O penso pode ser removido quando necessário para outras aplicações tópicas e / ou para a medição da área da ferida 10,11. Após a conclusão de experiências, o fechamento da ferida, a arquitectura morfológica e grau da neovascularização pode ser avaliada por imuno-histoquímica. Este económico e fácil de realizar modelo também pode ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas, no contexto da diabetes mellitus ou outros pathophysiologies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de talas e curativos oclusivos
- Esboço 10 círculos mm em 0,5 milímetros de espessura folhas de silicone e usar uma tesoura ou um soco biópsia para criar discos de silicone.
- Centro de uma biópsia de punção 5 mm no centro do círculo de 10 mm e pressiona firmemente para criar um orifício para formar um "doughnut" semelhante a disco que irá ser utilizada como uma tala.
- Esboço 10 círculos milímetros em um curativo oclusivo transparente como Opsite e usar a tesoura para criar curativos circulares.
2. Animais Experimentais
- Obter a aprovação do Comitê de Ética Animal para todos os experimentos que serão realizados.
- Use 8 semanas de idade (22-26 gramas) camundongos C57BL/6J machos de um criador comercial (por exemplo, os laboratórios Jackson).
- Manter ratinhos em condições-padrão de 21 ° C e uma hora ciclo claro-escuro de 12, com livre acesso a comida e água.
- (Opcional): A diabetes pode ser induzida em 6 a 7 semanas de idade por um bolus intraperitoneal injecção de 165 mg / kg de estreptozotocina (em tampão citrato, pH 4,5), com hiperglicemia confirmada pelo monitoramento de glicose no sangue regular (accuchek glicosímetro). Camundongos diabéticos podem ter poliúria e por isso a sua cama pode necessitar ser alterado com mais freqüência para eliminar a umidade e seus pesos devem ser cuidadosamente monitorizados.
3. Anestesia e Preparação operativo
- Induzir a anestesia geral, utilizando 5% de isoflurano em 100% de oxigénio (caudal de 1 L / min) e manter a anestesia utilizando 1-3% de isoflurano.
- Garantir os reflexos profundos pedal do mouse são suprimidas e coloque o mouse na posição prona.
- Preparar a região operativa através da remoção da pele com cortadores a partir da base do pescoço, a 3 cm na parte inferior da volta e entre as duas omoplatas.
- A aplicação de luz de creme depilatório pode ser aplicado durante o período de 2 min. Compressas de gaze molhada pode ser utilizado para garantir que todo o creme e pele remanescente é removido.
- Limpe a pele com umalgodão embebido em álcool e duas aplicações de 10% iodopovidona (Betadine) e armar o mouse.
4. Excisão e Splinting de Wound
- Representação esquemática do modelo de cicatrização de murino é apresentada na Figura 1.
- Usar uma solução estéril 4 milímetros biópsia de apresentar dois padrões circulares para a ferida em ambos os lados da linha média do rato ao nível dos ombros (ver as figuras 2a-2b).
- Utilização fórceps serrilhados para levantar a pele, no meio do contorno da íris e tesouras para criar uma ferida de espessura total, que se prolonga através do tecido subcutâneo (Figuras 2c-2d), incluindo o panículo carnoso (figura 2e) e, em especial sobre o consumo da parte circular de tecido.
- Repita o processo para a ferida do outro lado da linha média (Figura 2f).
- Remover o revestimento protector plástico de cada lado da tala de silicone.
- Aplicar cyanoacrylate adesiva (por exemplo, Super Cola ou Krazy Glue) para um lado de uma tala de silicone.
- Centre a tala sobre a ferida (Figura 2g) e ancorar o splint com interrompidos 6-0 nylon para garantir o posicionamento (Figura 2h).
- Repetir o processo de imobilização sobre a outra ferida.
- Se necessário, neste ponto do tempo, aplicar o composto terapêutico a ser testado (até 100 ul) para uma ferida (Figura 2i), e o controlo do veículo para o outro.
- Cobrir a ferida com uma compressa oclusiva transparente (por exemplo, Opsite) (Figura 2j-2k).
- Uma régua é colocada abaixo das talas e uma fotomicrografia tomada (Figura 2d).
6. Gestão de pós-operatório
- Carprofeno (5 mg / kg) é administrado uma vez por dia por meio de injecção sub-cutânea para o alívio da dor pós-operatória.
- Após a cirurgia, os animais são colocados em gaiolas individuais e mantidos sob calor mats até que esteja totalmente recuperado.
- Monitorar os animais duas vezes por dia para as manifestações de dor e perda de peso. Não observamos aspectos comportamentais graves de dor ou perda de peso.
7. Medição e Tratamento de Feridas
- A ferida pode ser medido diariamente.
- Induzir a anestesia geral, utilizando 5% de gás isoflurano (caudal de 1 L / min), e depois assegurar os reflexos profundos sensoriais do rato são suprimidas utilizando 1-3% de isoflurano.
- Delicadamente descascar o curativo oclusivo com uma pinça.
- Use pinças cirúrgicas para medir o diâmetro da ferida. Tomamos a média de três medições ao longo de X, Y e Z (Figuras 2m-2o), bem como uma fotomicrografia para futura referência (Figura 2p).
- Opcional: Neste momento o animal pode ser avaliada para a perfusão de sangue através de um gerador de imagens Doppler a laser (figura 2q).
- Re-aplicação do composto terapêutico e do controlo do veículo pode ser desemmed neste momento.
- Um curativo oclusivo transparente limpo é então re-aplicado e os animais mantidos aquecidos até que esteja totalmente recuperado.
- Nota: se talas não são protegidos adequadamente a ferida será prontamente contratar (Figura 2R).
8. Análise Histológica
- Eutanásia dos ratos após 10 dias, com uma overdose de anestesia.
- Utilizando uma pinça e uma lâmina de bisturi remover as suturas e cuidadosamente descascar a tala.
- Use uma tesoura íris para criar uma largura, a excisão completa em torno e sob a área da ferida e incubar o tecido em 4% de paraformaldeído em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante a noite.
- Transferência de tecido para 17% de sacarose na solução de PBS durante mais 24 horas a 4 ° C, em seguida, remover o excesso de solução, esfregando cuidadosamente sobre o tecido e em lugar outubro composto e congelar a -80 ° C.
- Hematoxilina-eosina pode ser utilizado para visualizar a estrutura da ferida e gap epitelial. Neovascularisation pode ser avaliada por análises de imuno-histoquímica para determinar o número de capilares (utilizando o factor de von Willebrand).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma curva de encerramento da ferida é determinada através do cálculo da média do diâmetro da ferida e expressando os resultados como uma percentagem, ou seja, 100 - (Dia 0 diâmetro / diâmetro Dia X). Nesta experiência, um composto terapêutico (ou de controlo do veículo) foi aplicada diariamente à ferida. O composto terapêutico fechamento da ferida grandemente acelerada (Figura 3). É importante notar que as talas devem ser mantidos durante o período de ensaio, como a remoção de tampões conduzirá a contracção da ferida rápida (Figura 2r) e desviar-se do padrão de cicatrização de feridas observadas nos seres humanos.
Figura 1. Representação esquemática do modelo de cura de feridas de murino. Neste modelo de duas feridas de espessura total são criados em either lado da linha média, permitindo que cada mouse para servir como seu próprio controle. Talas de silicone são cumpridos e suturada ao perímetro de feridas para evitar a contracção da ferida, proporcionando um modelo replicável à dos seres humanos.
Figura 2. Cirurgia de cicatrização de feridas e medições pós-cirúrgicas. Após remoção do cabelo e preparação da pele com iodo e álcool (ab) um perfurador de biópsia é suavemente usada para delinear dois círculos no dorso, de cada lado da linha mediana. (C) Uma pequena incisão É então criada e (d) uma parte circular de pele é removida, (e), incluindo o panniculosus carnosus, (f), para criar duas feridas de espessura total. (g), em seguida, o adesivo é aplicado à silic um talas e as talas aderiu ao perímetro da ferida. (h) talas são então fixados com suturas. (i) Os tratamentos são aplicados topicamente, e (jk) um, curativo oclusivo transparente é colocado sobre a ferida e aderido às talas (adesivo pode ser utilizado, se necessário). (l) Fotomicrografias são tomados diariamente e a área da ferida é calculado a partir da média de três medições de diâmetro no eixo-y, (n) do eixo x (m) e (o) no eixo z. (p ) Uma fotografia representativa das feridas no dia 10, indicando que a ferida menor da direita que foi tratado com um composto terapêutico. (q) da imagem de laser Doppler representativas de perfusão de sangue da ferida no dia 6. (r) Exemplo de ferida rápida contração após a remoção das talas de silicone.
65/50265fig3.jpg "alt =" Figura 3 "fo: content-width =" 4 polegadas "fo: src =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
Figura 3. Representativas gráfico o fechamento da ferida. Área da ferida é calculado a partir da média de três medições diárias ao longo do diâmetro x, y e z-eixos. O fechamento da ferida é expresso como uma percentagem da área da ferida inicial no dia 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este é um modelo experimental murino de cicatrização de feridas cutâneas. Uma característica importante deste modelo é o uso de tampões de silicone para evitar a contracção da ferida de modo que pode ocorrer a re-epitelização e formação de tecido de novo, tornando-se o processo semelhante ao que ocorre em seres humanos. Este modelo é versátil e pode ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas em ambientes fisiológicos e patológicos (por exemplo, diabetes mellitus). O modelo pode também ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas ou potencial terapêutica de angiogénese num ambiente económico. Com cada rato atuando como seu próprio controle, o número de animais são minimizados. As técnicas cirúrgicas necessárias para este modelo não são altamente sofisticados, assim este modelo pode ser utilizado por aqueles com relativamente pouca experiência cirúrgica.
Para garantir a reprodutibilidade e quantificação precisas, é imperativo que a tala seja suficientemente respeitado e fixados à pele com suturas, e que taqui é o mínimo de atraso entre a criação de duas feridas. A propensão de feridas murino de contratar rapidamente após afrouxamento da tala ou parcial remoção devido a coçar pelo mouse requer acompanhamento diário das talas. Aplicação cuidadosa do adesivo também é necessário para minimizar a irritação da pele saudável em redor da tala que podem promover a coçar. Também é muito importante seguir as técnicas de assepsia e desinfecção completamente equipamentos, especialmente os compassos de calibre, entre ratos. A aplicação do curativo oclusivo deve também ser considerada, especialmente se as feridas não vão ser tratados ou vestido diária. Opsite e Tegaderm (3M) pensos são comparáveis 12, e demonstrou-se que os pensos Tegaderm só pode permanecer aderido durante 1-2 dias. Deve curativos longo prazo ser necessária uma abordagem alternativa tem sido descrito por Chung e colegas 13.
Fraquezas potenciais deste modelo podem incluir inflamação d ue para a ancoragem das suturas, a difusão do tratamento ou o veículo entre as feridas e a entrada do tratamento para a circulação sistémica. No que diz respeito às suturas induzem inflamação local, as suturas são colocados relativamente longe da ferida e, como cada ferida é criado o mesmo, por conseguinte, qualquer inflamação que pode ocorrer deve ser semelhante entre feridas. Da mesma forma, a distância entre as feridas e uma falta de edema entre as feridas iria minimizar a difusão entre os dois leitos. Há alguma evidência de que o tratamento pode entrar na circulação sistémica, o que pode acelerar a cicatrização da ferida de controlo 9,10. Para determinar a extensão de um tratamento de entrar na circulação sistémica, os ratinhos ninhada pode ser utilizado, no qual as duas feridas são tratados só com o veículo. As diferenças nas taxas de encerramento da ferida entre os ratinhos tratados apenas com o veículo, e os ratinhos que receberam veículo e de tratamento podem então ser comparados.
"> Em conclusão, nós demonstramos um modelo murino relativamente simples de cicatrização da ferida que apresenta muitas das características observadas na cicatrização de feridas humanas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) da Austrália (Project Grant ID: 632512). Louise Dunn foi apoiada por um NHMRC início de carreira Fellowship e Christina Bursill por um Heart Foundation Career Development Fellowship Nacional.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y.
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
