Summary
نموذج الفئران من التئام الجروح الجلدية التي يمكن استخدامها لتقييم المركبات العلاجية في إعدادات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.
Abstract
التئام الجروح وإصلاح هي العمليات البيولوجية الأكثر تعقيدا التي تحدث في حياة الإنسان. بعد الإصابة، والمسارات البيولوجية متعددة تصبح تفعيلها. ضعف التئام الجروح، والذي يحدث في مرضى السكري على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية خطيرة مثل بتر. ،، وهناك بالتالي زيادة قوة دافعة لتطوير وكلاء الرواية التي تعزز إصلاح الجرح. وقد تم اختبار هذه تقتصر على النماذج الحيوانية الكبيرة مثل الخنازير، التي غالبا ما تكون غير عملية. وتمثل الفئران النموذج المثالي قبل السريرية، كما أنها اقتصادية وقابلة للتلاعب الجيني، والذي يسمح للتحقيق الآلية. ومع ذلك، التئام الجروح في ماوس تختلف اختلافا جوهريا لأنه من البشر كما يحدث في المقام الأول عن طريق الانكماش. لدينا نموذج الفئران يتغلب على هذا من خلال دمج جبيرة حول الجرح. بواسطة جبيرة الجرح، عملية الإصلاح ومن ثم تعتمد على الاندمال بتشكل النسيج الظهاري، وانتشار الخلايا والأوعية الدموية، والتي تعكس عن كثبالعمليات البيولوجية من التئام الجروح الإنسان. في حين تتطلب الاتساق والرعاية، وهذا نموذج الفئران لا تنطوي على التقنيات الجراحية المعقدة ويسمح للاختبار قوية من وكلاء الواعدة التي قد، على سبيل المثال، وتعزيز الأوعية الدموية أو تمنع الالتهابات. وعلاوة على ذلك، كل الماوس بمثابة ايقاعه كما يتم إعداد اثنين من الجروح، وتمكن من تطبيق كل من مجمع الاختبار والسيطرة على السيارة في نفس الحيوان. في الختام، علينا أن نظهر، ونموذج العملية سهلة التعلم، وقوية من التئام الجروح، والذي هو مشابه لذلك من البشر.
Introduction
ضعف التئام الجروح هي المسؤولة عن المضاعفات والوفيات في جميع أنحاء العالم كبيرة، وهذا صحيح بشكل خاص بالنسبة لمن يعانون من داء السكري 1،2. في البشر، والتئام الجروح هو سلسلة متصلة من العمليات، التي يوجد فيها تداخل كبير 3. على الفور تم تهيئتها، عمليات التهابات اصابة التالية. الافراج عن الخلايا الالتهابية العوامل التي تشجع عمليات تكاثر الخلايا، والهجرة والأوعية الدموية. بعد إعادة تشكيل الاندمال بتشكل النسيج الظهاري وأنسجة جديدة هناك مرحلة من إعادة عرض أن يستتبع كلا موت الخلايا المبرمج وإعادة تنظيم البروتينات المصفوفة مثل الكولاجين.
تعقيد التئام الجروح لا يمكن تكرارها حاليا في المختبر، وهذا يتطلب استخدام النماذج الحيوانية. حتى الآن، ودراسات التئام الجروح اقتصرت على نماذج حيوانية كبيرة، مثل الخنازير، للتأكد من أن عمليات الشفاء متكافئين وقابلة للمقارنة إلى البشر. ومع ذلك، باستخدام أنيما كبيرةيمكن ليرة سورية لمثل هذه الدراسات يكون من الصعب منزل وليست دائما عملية 4. الماوس المختبر يمثل نموذج حيواني الاقتصادية التي يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا لتحقيق الآلية 5-7. ومع ذلك، الجروح تلتئم بشكل مختلف الفئران إلى الإنسان و، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عملية انكماش 8. هذا هو في جزء منه، بسبب وجود طبقة تحت الجلد العضلات المخططة واسعة تسمى السبلة العضلية التي هي غائبة إلى حد كبير في البشر. في الفئران، هذه الطبقة العضلات يسمح للجلد على التحرك بشكل مستقل من عضلات أعمق ومسؤولة عن الانكماش السريع من الجلد التالية اصابة.
للتغلب على هذا القيد، التئام الجروح الفئران يمكن تكييفها لتكرار التئام الجروح الإنسان عن طريق استخدام جبيرة (الشكل 1) 8،9. في هذا الفيديو ونحن لشرح تجبير نموذج الفئران من شأنها أن تزيل الجرح انكماش الجرح وبشكل وثيق يقارب العمليات البشرية من إعادة epithelializaنشوئها وتشكيل أنسجة جديدة. في هذا النموذج يتم إنشاء اثنين من الختان كامل سمك التي تشمل السبلة العضلية على ظهر، واحدة على كل جانب من خط الوسط من الماوس. يتم وضع جبيرة سيليكون حول الجرح بمساعدة من مادة لاصقة ثم حصل على جبيرة مع خيوط متقطعة. كل الماوس بمثابة ايقاعه، مع جرح واحد يتلقون العلاج والسيطرة على السيارة الأخرى، مما يؤدي إلى خفض أعداد الحيوانات. بعد التطبيقات الموضعية، يتم تطبيق تضميد الانسداد شفافة. يمكن إزالة الضمادة عند الحاجة لمزيد من التطبيقات الموضعية و / أو قياس من منطقة الجرح 10،11. في يمكن تقييم الانتهاء من التجارب، وإغلاق الجرح، والهندسة المعمارية المورفولوجية ودرجة اتساع الأوعية الدموية التي كتبها المناعية. هذه اقتصادية وسهلة لأداء نموذج يمكن أيضا أن تستخدم لتقييم التئام الجروح في سياق داء السكري أو pathophysiologies الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد والجبائر والضمادات الكاتمة
- الخطوط العريضة 10 ملم على الدوائر 0.5 مم الأغطية سيليكون سميكة واستخدام مقص أو لكمة خزعة لإنشاء أقراص السيليكون.
- المركز 5 ملم خزعة لكمة في منتصف مم دائرة 10 واضغط بشدة إلى خلق ثقب لتشكيل "دونات" مثل القرص التي سيتم استخدامها بوصفها جبيرة.
- الخطوط العريضة 10 مم الدوائر على تضميد الانسداد شفافة مثل Opsite ومقص استخدامها لإنشاء الضمادات دائرية.
2. حيوانات التجارب
- الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات الحيوان لجميع التجارب التي سوف يتم تنفيذها.
- استخدام 8 أسابيع من العمر (22-26 غرام) ذكر الفئران C57BL/6J من مربي التجارية (مثل مختبرات جاكسون).
- الحفاظ على الفئران في ظروف قياسية من 21 درجة مئوية والموارد البشرية دورة ضوء الظلام 12 مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
- (اختياري): مرض السكري يمكن أن يتسبب في الفئران القديمة 6-7 الاسبوع الماضي من البلعة داخل الصفاق injeكشن من 165 ملغ / كغ بالستربتوزوتوسين (في المخزن سيترات، ودرجة الحموضة 4.5)، مع أكده العادية مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم (AccuChek غلوكمتر) ارتفاع السكر في الدم. قد يكون الفئران من السكري بوال وهكذا قد تحتاج الفراش لتغييرها بشكل متكرر أكثر للقضاء على الرطوبة وينبغي رصد أوزانها عن كثب.
3. التخدير والتحضير المنطوق
- لحث على التخدير العام باستخدام 5٪ isoflurane والأكسجين في 100٪ (معدل التدفق 1 لتر / دقيقة) والحفاظ على التخدير باستخدام 1-3٪ isoflurane و.
- ضمان ردود الفعل دواسة عميقة من الفأرة يتم منعها ووضع الماوس في وضعية الانبطاح.
- إعداد المنطقة المنطوق عن طريق إزالة الفراء مع كليبرز من قاعدة الرقبة إلى 3 سم مزيد من أسفل الظهر وبين لوحي الكتف.
- يمكن تطبيق تطبيق ضوء كريم مزيل الشعر لمدة لا تزيد عن 2 دقيقة. مسحات الشاش الرطب يمكن استخدامها لضمان أن جميع كريم وتتم إزالة ما تبقى الفراء.
- مسح الجلد معمسحة الكحول وتطبيقين من 10٪ بوفيدون اليود (بيتادين) وثنى الماوس.
4. الختان والتجبير من الجرح
- يتم تقديم تمثيل بياني للنموذج الفئران التئام الجروح في الشكل 1.
- استخدام معقم 4 ملم خزعة لكمة إلى الخطوط العريضة نمطين الدائرية لالجرح على جانبي خط الوسط الماوس، على مستوى الكتفين (انظر الشكلين 2A-2B).
- استخدام ملقط مسنن لرفع الجلد في منتصف المخطط ومقص القزحية لإنشاء الجرح كامل سمك الذي يمتد من خلال الأنسجة تحت الجلد (أرقام 2C-2D)، بما في ذلك السبلة العضلية (2E الشكل)، واستئصال قطعة دائرية من الأنسجة.
- كرر العملية الجرح على الجانب الآخر من خط الوسط (الشكل 2F).
- إزالة طبقة واقية من البلاستيك من كل جانب من جبيرة السيليكون.
- تطبيق cyanoacrylaالشركة المصرية للاتصالات لاصق (مثل سوبر الغراء أو الصمغ كريزي) إلى جانب واحد من جبيرة السيليكون.
- المركز جبيرة على الجرح (الشكل 2G) ومرساة للجبيرة مع توقف 6-0 خيوط النايلون لضمان تحديد المواقع (الشكل 2H).
- تكرار عملية التجبير على الجرح أخرى.
- إذا كان ذلك مطلوبا في هذا الوقت نقطة، وتطبيق المجمع العلاجية لفحصها (ما يصل إلى 100 ميكرولتر) إلى الجرح واحد (الشكل 2I)، والسيطرة على السيارة إلى أخرى.
- تغطية الجرح بضمادة الانسداد شفافة (على سبيل المثال، OpSite) (الشكل 2J-2K).
- يتم وضع مسطرة تحت الجبائر وصورة مجهرية تؤخذ (الشكل 2L).
6. إدارة ما بعد الجراحة
- ويدير كاربروفين (5 ملغ / كلغ) مرة واحدة يوميا عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة.
- بعد أن يتم بشكل فردي في قفص الحيوانات جراحة والمحافظة على حرارة مATS حتى تعافى تماما.
- رصد الحيوانات مرتين يوميا لمدة مظاهر الألم وفقدان الوزن. لاحظنا لا يعرض السلوكية الإجمالي من ألم أو فقدان الوزن.
7. قياس الجرح والعلاج
- الجرح يمكن قياسها يوميا.
- لحث على التخدير العام باستخدام 5٪ isoflurane والغاز (معدل التدفق 1 لتر / دقيقة)، ومن ثم ضمان ردود الفعل الحسية العميقة من الفأرة يتم منعها باستخدام 1-3٪ isoflurane و.
- بلطف قشر الظهر خلع الملابس الانسداد بالملقط.
- استخدام الفرجار الجراحية لقياس قطر الجرح. ونحن نأخذ ما معدله ثلاثة قياسات طول X، Y و Z محور (أرقام 2M-2O) وكذلك صورة مجهرية لتكون مرجعا في المستقبل (الشكل 2P).
- اختياري: في هذا الوقت يمكن تقييم هذا الحيوان لنضح الدم باستخدام الليزر دوبلر تصوير (الشكل 2Q).
- يمكن إعادة تطبيق المجمع العلاجية والسيطرة على السيارة يكون ادائهاميد عند هذه النقطة.
- A نظيفة شفافة خلع الملابس الانسداد ثم يتم إعادة تطبيقها والحيوانات أبقى دافئ حتى تعافى تماما.
- ملاحظة: إذا لم يتم تأمينها بشكل صحيح الجبائر الجرح ستتعاقد بسهولة (الشكل 2R).
8. التحليل النسيجي
- الموت ببطء الفئران بعد 10 يوما مع جرعة زائدة من التخدير.
- باستخدام ملقط وشفرة مشرط إزالة الغرز وقشر بعناية بعيدا جبيرة.
- استخدام مقص القزحية لخلق واسعة، والاستئصال الكامل حول وتحت منطقة الجرح واحتضان الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
- نقل الأنسجة لالسكروز 17٪ في حل برنامج تلفزيوني لمدة ساعة على 24 أخرى في 4 درجات مئوية ثم إزالة حل الزائد عن طريق اللمس بعناية على الأنسجة والمكان في شهر أكتوبر من المجمع وتجميد في -80 درجة مئوية.
- الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ يمكن استخدامها لتصور بنية الجرح والفجوة الظهارية. Neovasculويمكن تقييم arisation بواسطة تحليلات المناعى لتحديد عدد من الشعيرات الدموية (باستخدام عامل فون ويلبراند).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تحديد منحنى إغلاق الجرح عن طريق حساب متوسط قطرها من الجرح ويعبر عن النتائج كنسبة مئوية، أي 100 - (يوم 0 قطر / يوم القطر X). في هذه التجربة تم تطبيقها على مركب علاجي (أو السيطرة على السيارة) يوميا على الجرح. مجمع العلاجية إغلاق الجرح تسارع إلى حد كبير (الشكل 3). ومن المهم أن نلاحظ أن الجبائر يجب أن يحتفظ به لمدة التجربة، كما إزالة الشظايا سيؤدي إلى انكماش الجرح السريع (الشكل 2R) وتتباعد عن النمط من التئام الجروح التي لوحظت في البشر.
الشكل 1. التمثيل التخطيطي لنموذج الفئران الجرح الشفاء. وفي هذا النموذج يتم إنشاء اثنين من الجروح سمك كامل على EIالجانب ذر من خط الوسط مما يتيح لكل الماوس لتكون بمثابة سيطرتهم. يتم الالتزام الجبائر سيليكون وتخاط إلى محيط الجرح لمنع انكماش الجرح، وتوفير نموذج قابل للتكرار لأنه من البشر.
الشكل 2. الجرح جراحة الشفاء والقياسات بعد الجراحة. بعد إزالة الشعر وإعداد الجلد مع اليود والكحول (AB) يستخدم لكمة خزعة بلطف إلى الخطوط العريضة دائرتين على ظهر، أي من جانبي خط الوسط. (ج) شق صغير ثم يتم إنشاء و(د) تتم إزالة قطعة دائرية من الجلد، (ه) بما في ذلك panniculosus عضلية، (و) لإنشاء اثنين من الجروح كامل سمك. (ز) ثم يتم تطبيق لاصق على silic واحدة الجبائر والجبائر انضمت إلى محيط الجرح. (ح) ثم يتم تأمين الإطارات مع الغرز. (أنا) هي العلاجات يطبق موضعيا ويتم وضعها (JK) والانسداد، وخلع الملابس الشفافة على الجرح وانضمت إلى الجبائر (يمكن لاصق يمكن استخدامها إذا لزم الأمر). (L) Photomicrographs تؤخذ يوميا ويتم حساب منطقة الجرح من متوسط ثلاثة قياسات قطرها على (م) المحور الصادي، (ن) محور س و (س) Z-المحور. (P ) صورة ممثل الجراح في يوم 10، مشيرا إلى الجرح أصغر على الجهة اليمنى والذي كان يعالج مع مجمع العلاجية. (ف) الممثل ليزر دوبلر صورة نضح الدم من الجرح في يوم 6. (R) مثال على الجرح السريع انكماش بعد إزالة الجبائر السيليكون.
65/50265fig3.jpg "بديل =" الشكل 3 "FO: محتوى العرض =" 4IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
الشكل (3). ممثل الجرح إغلاق الرسم البياني. يتم حساب منطقة الجرح من المتوسط من ثلاثة قياسات القطر يوميا على طول X، Y و Z-محاور. وأعرب عن إغلاق الجرح كنسبة مئوية من منطقة الجرح الأولي في اليوم 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا هو نموذج الفئران التجريبية من التئام الجروح الجلدية. وهناك ميزة هامة من هذا النموذج هو استخدام الجبائر السيليكون لمنع انكماش الجرح بحيث قد تحدث إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري وتكوين الأنسجة الجديدة، مما يجعلها مشابهة للعملية التي تحدث في البشر. هذا النموذج هو تنوعا، ويمكن استخدامها لتقييم التئام الجروح في إعدادات كلا الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض (على سبيل المثال داء السكري). ويمكن أيضا أن تستخدم نموذج لتقييم التئام الجروح المحتملة أو التداوي الأوعية الدموية في بيئة اقتصادية. مع كل فأر بوصفها ايقاعه، يتم الحد من أعداد الحيوانات. التقنيات الجراحية اللازمة لهذا النموذج ليست متطورة للغاية، وبالتالي هذا نموذج يمكن استخدامها على نطاق واسع من قبل ذوي الخبرة الجراحية قليلا نسبيا.
لضمان استنساخ ودقيقة الكمي لا بد أن جبيرة يتم الالتزام بشكل كاف وترتكز على الجلد مع الغرز، وأن رهنا هو الحد الأدنى تأخير بين خلق جروح اثنين. الميل للجروح الفئران في التعاقد بسرعة تخفيف التالية من جبيرة أو جزئية بسبب إزالة الخدش بواسطة الماوس يتطلب الرصد اليومي للالجبائر. مطلوب تطبيق دقيق من مادة لاصقة أيضا لتقليل تهيج الجلد صحي حول جبيرة التي قد تشجع الخدش. بل هو أيضا مهم جدا لمتابعة تقنيات العقيم وتطهير المعدات بدقة، وخاصة الفرجار، بين الفئران. ويجب أيضا النظر في تطبيق خلع الملابس الانسداد، خاصة إذا الجروح لن يعامل أو يرتدون يوميا. Opsite وTegaderm (3M) الضمادات قابلة للمقارنة 12، ولقد ثبت أن الضمادات Tegaderm قد تبقى سوى الالتزام لمدة 1-2 أيام. ينبغي أن يطلب من تضميد الجروح على المدى الطويل وقد وصفت نهجا بديلا من قبل تشونغ وزملاؤه 13.
نقاط الضعف المحتملة لهذا النموذج يمكن أن تشمل التهاب د UE إلى ترسيخ الخيوط الجراحية، ونشر معاملة أو مركبة بين الجروح ودخول العلاج إلى الدوران الجهازي. في ما يخص الغرز إحداث التهاب المحلية، يتم وضع الغرز بعيدة نسبيا عن الجرح وكما يتم إنشاء كل الجرح نفسه، وبالتالي فإن أي التهاب قد يحدث يجب ان يكون مماثلا بين الجروح. وبالمثل، فإن المسافة بين الجروح وعدم وجود وذمة بين الجروح تقليل انتشار بين اثنين من سرير. هناك بعض الأدلة على أن العلاج قد تدخل الدورة الدموية، والتي قد تعجل الشفاء من السيطرة الجرح 9،10. لتحديد مدى وجود علاج دخول الدورة الدموية، ويمكن استخدام الفئران littermate، التي تعامل بها جراح اثنين فقط مع السيارة. ويمكن بعد ذلك مقارنة الاختلافات في معدلات إغلاق الجرح بين الفئران التي عولجت مع السيارة فقط، والفئران تلقي كل من السيارة والعلاج.
"> وفي الختام، لقد أثبتنا نموذج الفئران بسيطة نسبيا من التئام الجروح التي يسلك العديد من الميزات التي لوحظت في التئام الجروح الإنسان.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه الدعم التمويلي من الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) من استراليا (مشروع المنحة رقم: 632512). كان مدعوما من قبل لويز دن NHMRC المبكر الزمالة الوظيفي وكريستينا Bursill بواسطة شهادة زمالة مؤسسة القلب التنمية الوطنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y.
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
